一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒及其制作和使用方法与流程

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，尤其涉及一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒及其制作和使用方法。
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免疫比浊分析方法在临床得到普遍开展，有几十种试剂盒已在临床应用，同时新的生物标记物的发现，将不断推进这种新的试剂盒产生。目前主要有两种类型，一种是直接将抗体加入反应体系中，在一定的条件下，抗原、抗体反应形成免疫复合物，产生凝集或沉淀使体系浊度改变，这种浊度变化与体系中抗原浓度具有正向的相关关系，据此可以测定样品中抗原浓度，这种方法通常称为比浊或普通比浊；第二种是在第一种方法基础上发展而来，将抗体结合到固态微粒上，可以增强凝集或沉淀的效果，以提高分析灵敏度，这种方法通常称为增强免疫比浊。增强免疫比浊这种均相的免疫分析过程中，维持抗原、抗体适当的比例十分重要，否则当抗原过量时，抗原-抗体免疫复合物产生沉淀或凝集的效果反而会降低，这就是免疫比浊分析中，通常所说的“钩状效应”，由于“钩状效应”存在，过量抗原检测时，免疫复合物形成沉淀的效果反而下降，会测出较低的浓度值，得出“假阴性”结果，这种假阴性结果往往会引起临床误判。尿微量白蛋白是反映肾小球疾病和肾损伤的一个非常灵敏的指标。尤其在糖尿病、高血压等疾病发生的早期用于了解肾脏的损伤情况有特殊的意义，正常状态下，人尿液中白蛋白的含量低于20mg/l，当有肾损伤时，微量白蛋白可高达1000mg/l甚至更高。尿中白蛋白检测时，需要考虑过量抗原检测所产生的假阴性结对临床的误判，避免由于抗原过量时的假阴性结果，有人利用预反应阀值判断的方法，用于过量抗原测定，通过短时间预反应，给定浊度变化的阀值，筛选出抗原过量的样本，稀释后再测定，采用这种方法可以有效的避免“假阴性”结果，但对于不同的分析物质，由于抗体不同，给定的阀值各有所不同，另外，不同批次的抗原抗体质量不完全相同，也影响阀值的设定，除此以外，这种方法不同于常规的免疫分析过程，需要设计专用测定程序或专用设备，无法在一般自动生化分析仪上实现这种分析过程。此外比较有效的方法是利用定性的方法，预测样本中的白蛋白浓度，如使用尿蛋白试纸预测，筛选出高浓度样本，将高值样本稀释后再测定，这种方法实际需要两次测定，会产生多余诊断费用，也给临床诊断实验室增加多余的工作量。上述免疫比浊方法存在的问题主要如下：1.现有的胶乳增强尿微量白蛋白免疫比浊检测方法，以抗体联结胶乳，设计成所谓正向免疫比浊试剂盒用于临床检测，这种方法的检测范围通常在0-100ug/l，当样品浓度超过100ug/l时，其测定结果有可能因为“钩状效应”而出现假阴性。2.现有的免疫比浊方法，通常以抗体联结胶乳，设计成所谓正向免疫比浊试剂盒用于临床检测，针对不同分析物，需要制备不同种类抗体胶乳联结物，胶乳-抗体联结物的质量是试剂盒产品质量的关键因素，胶乳-抗体联结物的质量受胶乳自身性质、抗体性质及联结方法等。胶乳自身性质包括胶乳材料及合成方法，胶乳颗粒大小，胶乳表面性状等；抗体性质包括抗体种类、抗原决定族和抗体纯度等；联结方法包括物理方法和化学方法，物理吸附联结方法受粒子表面性状，大小及抗体纯度及吸附过程影响，而化学方法受粒子表面活性基团，交联剂、联结过程等影响。以上居多因素影响，同时由于抗体蛋白和胶乳颗粒的多样性，即使是同一胶乳和抗体，无任是采用物理方法还是化学方法，不同生产商，由于不同胶乳-抗体联结物制备方法不完全一致，都无法获得完全相同试剂盒产品。导致临床结果受试剂盒产品因素影响而难以标准化，以至于不同医院对同一检测结果无法通用，造成多次检测的现象，增加患者的检测费用。3.现有的免疫比浊方法，对于每一种分析物，需要制备对应的一种胶乳-抗体联结物，其试剂盒的研发过程需要对抗体种类，胶乳种类，胶乳大小及联结方法进行研究获得最佳的检测方案，制备出试剂盒；生物技术日新月异，临床上有价值的新标识物不断被发现，需要开发的新试剂盒不断增加，这为试剂盒开发增加了巨大的工作量。技术实现要素：为解决上述问题，本发明公开了一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒及其制作和方法。如图4所示，采用本发明的增强免疫抑制比浊方法，从免疫反应的原理上克服了现有的增强免疫比浊方法的缺陷，其所利用的就是免疫反应凝集的过量抗原曲线部分，当测量反应体系中无抗原时，连接在胶乳粒子上的二抗（ab2）将和体系中的第一抗体（ab1，抗人白蛋抗体）产生凝集反应，形成胶乳凝集物，在一定的抗体浓度条件下，这种凝集效果将达到最大，当测量反应体系中有抗原存在时，抗原将与第一抗体反应，形成可溶性免疫复合物，由于大分子的空间位阻效应，抗原将封闭第一抗体上的二抗结合位点，并形成一种竞争性的抑制效果，样品中抗原将竞争性抑制一抗-二抗免疫复合物的凝集效果，因此，随反应体系中游离抗原量增加，一抗与二抗-胶乳反应形成免疫复合物的凝集效果反而会下降，当测量体系中抗原达到一定量时，游离抗原趋向于完全抑制一抗-二抗反应的凝集效果，如果能克服胶乳和样品中其他物质的非特异性结合，反应过程浊度变化将趋向于为零。尽管这种方法无法将高浓度范围无限扩展，但不会出现假阴性的检测结果，还将有效的筛选出过线的高浓度白蛋白样本，当确有需要时，可以稀释高浓度样本，再次测定以得到准确结果。为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒，包括试剂1和试剂2；所述试剂1包括负载物，所述负载物上负载有待使用一抗的抗体，即二抗；所述二抗为兔抗小鼠igg或羊抗兔igg；所述试剂2包括待使用一抗，所述待使用一抗为鼠抗人白蛋白单克隆抗体或兔抗人白蛋白多克隆抗体。进一步的改进，所述负载物为胶乳粒子。进一步的改进，所述胶乳粒子为羧基纳米胶乳粒子。进一步的改进，所述羧基纳米胶乳粒子的径粒范围为40-500纳米。进一步的改进，分别制备试剂1和试剂2，具体包括如下步骤：试剂1：取纳米胶乳粒子溶液，用酸性缓冲液稀释后，加入活化剂活化，再加入待使用抗体的二抗进行连接反应，待连接反应结束后加入封闭剂、防腐剂、表面活性剂，然后用中性缓冲液稀释到工作体积，即制备得到含有二抗-胶乳的试剂1；试剂2：在中性缓冲液中加入无机盐，防腐剂、表面活性剂，过滤得到稀释液，用稀释液稀释待使用一抗到工作浓度，即制备得到试剂。进一步的改进，所述封闭剂为甘氨酸、防腐剂为proclin300、表面活性剂为tween20；所述酸性缓冲液和中性缓冲液均为磷酸缓冲液；无机盐为nacl；所述乳胶粒子为羧基纳米胶乳粒子，活化剂为二环己基碳二亚胺，二抗为兔抗小鼠igg或羊抗兔igg。进一步的改进，试剂1和试剂2的最终试剂配方中各成分的质量体积比如下：试剂1和试剂2的最终试剂配方中各成分的质量体积比如下：试剂1：ph7.0,0.02m/l磷酸缓冲液二抗-胶乳0.01-0.05%g/l甘氨酸0.002m/ltween200.01%g/lproclin3000.1%g/l试剂2：ph7.5,0.02m/l磷酸缓冲液一抗按工作浓度稀释甘氨酸0.002m/lnacl0.15m/ltween200.001%g/lproclin3000.1%。g/l。进一步的改进，包括如下步骤：试剂1制备：取粒径100nm,10%浓度的羧基纳米胶乳粒子0.2ml，加入ph4.6，0.02m磷酸缓冲液0.8ml，加入20ul浓度为20mg/ml的二环己基碳二亚胺，37℃摇床保温反应20分钟活化后，加入0.5ml，ph7.5，0.02m磷酸缓冲液及0.02ml纯化兔抗小鼠igg抗体或0.05ml羊抗兔igg，37℃摇床保温再连接反应60分钟，待连结反应结束后，加ph7.5，0.02m磷酸缓冲液使总溶液的体积到10ml，再加入0.2m甘氨酸0.1ml，1%吐温200.1ml，37℃摇床保温再反应30分钟封闭并终止反应，按0.1%加入proclin300，即可制备得到含有兔抗小鼠igg或羊抗兔igg二抗-胶乳连接物的试剂1；试剂2制备：以水倍比稀释一抗，以0.02m，ph7.5且含nacl0.15m的磷酸盐缓冲液为r1’，以兔抗小鼠igg或羊抗兔igg二抗-胶乳连接物为r2’，生化分析仪上，按以下参数设定测量程序，分别测定各倍比稀释的一抗；测定波长：546nm；r1’：r2’：待测样品=100：100：20，即加入r1’100ul后，加入待测样品20ul，37℃保温5分钟，加入r2’100ul，读取17点和34点的光吸收值，计算第34点和17点的光吸收差值：△a=a34-a17；取光吸收差值最大的稀释度为一抗稀释度，按一抗稀释度，用0.02m，ph7.5且含nacl0.15m的磷酸盐缓冲液稀释一抗，按0.1%加入proclin300，0.01%tween20即制备得到试剂2。一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：所述胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒包括负载物，负载物上负载有待使用抗体的二抗；校准曲线建立：试剂1，和试剂2即r2，在生化分析仪上，按以下参数设定测量程序，以人白蛋白校准品浓度范围分别为0，2.5，5，20，50，100，200mg/l建立校准曲线；测定波长：546nm；试剂1：试剂2：校准品=100：100：5，即加入试剂1100ul后，加入校准品5ul，37℃保温5分钟，加入试剂2100ul，读取17点和34点的光吸收值，计算第34点和17点的光吸收差值：△a=a34-a17，依据各校准品浓度及对应的△a，按多点spline拟合建立校准曲线；所述试剂1中包含负载物，负载物上负载有待使用一抗的抗体，即二抗；所述试剂2中包含待使用一抗；样品测定：以试剂1和试剂2，在生化分析仪上，按以下参数设定测量程序，以人尿为测量样品；测定波长：546nm；r1：r2：样品=100：100：5，即加入r1100ul后，加入样品5ul，37℃保温5分钟，加入r2100ul，读取17点和34点的光吸收值，计算第34点和17点的光吸收差值：△a=a34-a17，依据△a，按以上建立的校准曲线计算得到尿样品中白蛋白浓度。本发明的优点如下：1.目前市面上的胶乳免疫比浊试剂盒，以所谓正向免疫比浊为主流，即胶乳联结第一抗体形成以胶乳-抗体试剂，样品中的抗原与胶乳-抗体（一抗）形成免疫复合物，产生浊度，由此测定样品中抗原浓度，这种技术需要针对不同的抗原制备不同的胶乳-一抗联结物，以本发明的方法，制备二抗胶乳，通过对一抗滴度检测，选定一抗浓度，如表（一），图（1）所示，以此可以配制出二抗竞争比浊试剂盒，形成一种竞争性的剂量效应曲线，如图（2）所示，这种二抗胶乳将来还有可能成为一种通用性试剂，结合不同一抗，用于不同抗原检测。2.本发明的方法与临床所使用的方法（目前市售试剂盒方法），对100份尿样测定结果比较，表明采用单抗（a）或多抗（b）为一抗所建立的二抗竞争比浊方法，与目前市售的试剂盒对尿样测定结果均有较好的相关性，采用鼠抗人白蛋白单抗为一抗及兔抗小鼠igg为二抗所建立的方法（二抗竞争a）与市售试剂盒测定结果的回归方程为：y对比试剂盒=1.043x本法a-0.2072，（r2=0.9796）。其中以兔抗人白蛋白多抗为一抗及羊抗兔igg为二抗所建立的方法（二抗竞争b）与市售试剂盒测定结果的回归方程为：y对比试剂盒=1.001x本法b-0.2253，（r2=0.9897）；而以人白蛋白单抗和多抗所建立的两种方法之间也有较好的相关关系，两者测定结果的回归方程为：y本法a=0.9503x本法b+0.2063，（r2=0.9895），三种方法测定的样本结果均值及标准差如下：x本法a=19.75±19.28，x本法b=21.00±20.18，y对比试剂盒=20.67±20.19，方差分析三组均数差异无显著性（f=0.114，p=0.893﹥0.05）。表（一）三种方法测定100份人尿样结果相关分析测定方法截距斜率r2本法二抗竞争a与对比试剂盒0.20721.0430.9796本法二抗竞争b与对比试剂盒0.22531.0010.9897本法二抗竞争a与本法二抗竞争b0.20630.95030.98953.正向的胶乳免疫比浊方法，通常有所谓的“钩状”效应，当抗原过量时，会出现假阴性结果，二抗竞争分析方法可以有效避免假阴性出现，本发明的二抗竞争方法，当样品中白蛋白浓度超过200mg/l后，样品测定值与实际值有较大偏差，但不会出现低于200mg/l的测定结果，提高样品浓度达到5000mg/l，也不会出现假阴性的结果，如表（三），图（4）。比较1000-5000mg/l，测定结果，5组高浓度测定结果，总体均值：av=326.1，标准差：sd=20.64，各自均值差异无显著性（f=3.84，p=0.52>0.05）。采用本发明的方法，可以有效的筛选出高浓度样本，但高浓度样品测定值不能反应出真实结果，如果临床上有需要，可以稀释样本，获取准确的测量结果。4.采用本发明的胶乳增强二抗竞争免疫比浊方法，从免疫反应的原理上克服了现有的增强免疫比浊方法的缺陷，其所利用的就是免疫反应凝集的竞争原理，当测量反应体系中无抗原时，连接在胶乳粒子上的兔抗小鼠igg或羊抗兔igg二抗将与抗人白蛋白一抗（单抗或多抗）抗体结合产生凝集或沉淀反应，且这种凝集或沉淀效果达到最大，当测量反应体系中有抗原存在时，由于一、二抗的量已限定，一抗与抗原结合形成免疫复合物，竞争性的封闭了一抗和二抗的结合位点，相对于一抗和二抗的结合，形成一种竞争性反应，从而降低了凝集或沉淀的效果，游离的抗原过量时，将完全竞争抑制一抗与二抗的结合，因此，随反应体系中抗原量增加，一抗-二抗免疫复合物的凝集或沉淀效果反而会下降，当测量体系中抗原达到一定量时，游离抗原将完全抑制一抗体与胶乳上的二抗的结合，如果能克服胶乳和样品中过量抗原及其他物质的非特异性结合，反应过程浊度变化将为零。尽管这种方法无法将高浓度范围无限扩展，但不会出现假阴性的检测结果，还将有效的筛选出过线的高浓度样本，当确有需要时，可以稀释高浓度样本，再次测定以得到准确结果。5.采用二抗-胶乳建立方法，可以避免不同胶乳，不同一抗及不同制备胶乳-抗体联结物等因素对产品质量的影响，有利于临床检测结果标化，达到检测结果通用，减少患者检测费用。6.若采用通用性的二抗-胶乳联结物，开发方法，可以避免居多种类抗原影响，可以达到同一种二抗-胶乳联结物测定不同抗原的目的，即同一种二抗-胶乳形成不同抗原种类的试剂盒，可以极大地节省试剂盒研发时间，减少研发工作量。附图说明图1为一抗滴度测定（1，2，3，4，5，6，7）滴度分别为（1：8），1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，0）；图2为hsa单抗（a）、多抗（b）的二抗竞争校准曲线；图3-1为二抗竞争方法a与对比试剂盒测定尿液结果比较；图3-2为二抗竞争方法b与对比试剂盒测定尿液结果比较；图3-3二抗竞争方法a与b尿液结果比较；图4为本发明的原理图。具体实施方式实施例1兔抗小鼠igg二抗（a）或羊抗兔igg（b）-胶乳连接物制备市售粒径100nm,10%浓度的羧基纳米胶乳粒子0.2ml，加入ph4.6，0.02m磷酸缓冲液0.8ml，加入20ul浓度为20mg/ml的二环己基碳二亚胺，37℃摇床保温反应20分钟活化后，加入0.5ml，ph7.5，0.02m磷酸缓冲液及0.02ml纯化兔抗小鼠igg抗体或0.05ml羊抗兔igg（二抗），37℃摇床保温再连接反应60分钟，待连结反应结束后，加ph7.0，0.02m磷酸缓冲液使总溶液的体积到10ml，再加入0.2m甘氨酸0.1ml，1%吐温200.1ml，proclin3000.1ml，37℃摇床保温再反应30分钟封闭并终止反应，按0.1%加入proclin300，即可分别制备得到兔抗小鼠igg（a）或羊抗兔igg二抗（b）-胶乳连接物，也即试剂1。实施例2小鼠抗人白蛋白单抗或兔抗人白蛋白多抗滴度测定：以水倍比稀释鼠抗人白蛋白单抗或兔抗人白蛋白多抗，以0.02m，ph7.0（含nacl0.15m）的磷酸盐缓冲液为r1，分别用以上方法制备的兔抗小鼠igg二抗-胶乳连联结物为r2，在日立7170s全自动生化分析仪上，按以下参数设定测量程序，测定不同稀释度的一抗液；测定波长：546nm；r1：r2：样品=100：100：20，即加入100ulr1后，加入样品20ul，37℃保温5分钟，再加入100ulr2，读取17点和34点的光吸收值，计算第34点和17点的光吸收差值：△a=a34-a17。滴度测定结果如下表(二)，图（1）所示，根据表(二)单抗选定的滴度为1：64，多抗选定的滴度为1：128。表(二)抗人白蛋白单抗或多抗滴度测定编号hsa单抗△has多抗△11：872701：8368921：1670841：16458931：32124681：32789541：64143261：641456751:12884521:1281566561:25624311:2568674701450567实施例33.1人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒配制：按下列配方分别配制二抗竞争免疫比浊检测试剂试剂盒a:r1：ph7.0,0.02m磷酸缓冲液兔抗小鼠igg二抗-胶乳（0.01-0.05%）甘氨酸(0.002m)tween20（0.01%）proclin300（0.1%)r2：ph7.5,0.02m磷酸缓冲液小鼠抗人白蛋白单抗（1:200）nacl(0.15m)酪蛋白（0.01%）tween20(0.001%)proclin300(0.1%)试剂盒br1：ph7.0,0.02m磷酸缓冲液羊抗兔igg二抗-胶乳（0.01-0.05%）甘氨酸(0.002m)tween20（0.01%）proclin300（0.1%)r2：ph7.5,0.02m磷酸缓冲液兔抗人白蛋白（1：500）nacl(0.15m)酪蛋白（0.01%）tween20(0.001%)proclin300(0.1%)3.2测量参数在日立7170s全自动生化分析仪上，按以下参数设定测量程序；测定波长：546nm；r1：r2：样品=100：100：5，即加入100ulr1后，加入样品5ul，37℃保温5分钟，再加入100ulr2，读取17点和34点的光吸收值，计算第34点和17点的光吸收差值：△a=a34-a17。市售试剂盒测量参数按试剂盒说明书设定。3.3校准曲线、样品测定及比较标准人白蛋白抗原，用水稀释成0，2.5，5，20，50，100，200mg/l，按以上测量参数及市售试剂盒测量参数分别建立各校准曲线，如图（2）所示，收集临床100份尿样，分别用本发明的试剂盒方法（a，b）与市售的试剂盒比对分析，采用相同的校准品，每个样本测定两次，第二次为逆向测定，计算各试剂盒测定的平均值，求取相关系数及线性方程。如表(三)，图（3-1），（3-2），（3-3）所示。表(三)二抗竞争方法a，b与试剂盒测定100份尿液结果比较测定方法截距斜率r2本法二抗竞争a与对比试剂盒0.20721.0430.9796本法二抗竞争b与对比试剂盒0.22531.0010.9897本法二抗竞争a与本法二抗竞争b0.20630.95030.9895实施例4用低浓度尿液制备含高浓度白蛋白的样品，浓度分别为50，100，200，1000，2000，3000mg/l，按以上测量程序，分别以以上三种方法测定此高浓度样品，每个样品平行测定三次，取均值，结果以均值±标准差表示。如表(四)所示，二抗竞争方法测定高浓度样品时，其结果与理论值相差较大，但不会出现低于最高浓度样品的低值，如有需要，可以稀释样品后再测定获得准确值，而市售试剂盒在高浓度测定时会出现低于最高校准品浓度的低值。具体的如表(四)中样品中的浓雾大于1000mg/l时，市售的用于本方法对比用的对比试剂盒的测量值对比样品浓度为200mg/l时出现了下降，即出现了钩状效应（样品试剂浓度为1000mg/l时，其结果显示低于100mg/g）。而本方法的检测值虽然与实际值差距也较大，但是其检测值依然是上升的（样品为1000mg/l时，检测值依然大于200mg/l；即检测结果依然会随着样品浓度的增加而变大），即不会给出样品浓度低于病理阈值的错误结果。而且若需要对高浓度的样品检测，此时的检测结果说明其高于了本方法的准确检测阈值（如本实施例，本方法的准确检测阈值为200mg/l，当检测结果为大于200mg/l的浓度时，说明样品浓度超过了准确检测阈值），此时对样品进行倍比稀释，然后再检测即可检测到准确的高浓度的样品的浓度。表(四)高浓度尿液测定下述所有方案也均在本发明保护范围内：1.连接反应的试剂类型市售的胶乳有至少三种类型，包括羧基，羟基，巯基等，所采取的连接二抗的方法各有所不同，但其基本的设计是将二抗连接到胶乳粒子上，无任采取那种方法，最种得到的结果都是制备出合适的二抗-胶乳的连接物质以便于二抗增强竞争免疫比浊分析。对于羧基胶乳，也可以采取不同的活化试剂包括edc，edc钠盐，tbe等等，在一定的合适ph、温度等条件下以制备二抗-胶乳连接物，均在本发明保护范围内。2.粒子的类型市售的胶乳包涵各种不同粒度大小，如羧基胶乳有40，80，100，150，200，300，500，1000纳米等等，无任选取何种大小的胶乳，在一定条件下都可以制备出二抗-胶乳连接物以实现上述过程，均在本发明保护范围内。3.名字，竞争免疫比浊反应基于二抗-连接物所建立的增强竞争比浊方法，目前没有在专业表述上统一，有人将其称为竞争免疫比浊或抑制免疫比浊等，尽管名称不同，其实际原理完全一样，因此名称不同，但试剂和步骤一样的也在本发明保护范围内。4.抗体的种类及抗原的种类连接到胶乳粒子上的二抗，可以是多种，包括单抗和多抗，单抗又包括鼠单抗和兔单抗等等，多抗包括兔多抗，羊多抗等等，均在本方保护范围内。5.仪器的类型目前，用以检测免疫比浊反应的仪器有至少两种类型，一种是基于透射比浊测定生化分析仪，还有一种是基于散射比浊测定的所谓特种蛋白测定仪。包括半自动及全自动两种类型，生产厂家也有许多，比较有名的国外厂家有日立，西门子，罗氏、贝克曼等，国内产家有迈瑞、库备尔、科华、优利特等。各种仪器类型都可以用于一抗体筛选及滴度测定、试剂盒方法建立及临床应用。因此使用各种仪器进行检测也在本发明保护范围内。尽管本发明的实施方案已公开如上，但并不仅仅限于说明书和实施方案中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里所示出与描述的图例。当前第1页12