一种三阴乳腺癌预后预测标志物及其检测方法与流程

本发明涉及预后预测标志物技术领域，特别涉及一种三阴乳腺癌预后预测标志物及其检测方法。

背景技术：

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在常见恶性肿瘤的发病率中高居世界第二位，且近年来发病率呈逐年升高趋势，给社会和家庭造成了严重的经济和心理负担。三阴乳腺癌(triple-negativebreastcancer，tnbc)是乳腺癌中侵袭性最强的一种亚型，约占全部乳腺癌的20％。tnbc即雌激素受体(estrogenreceptor，er)、孕激素受体(progesteronereceptor，pr)和人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，her-2)皆表达缺失的乳腺癌，因其特殊的致病机理，因其缺乏靶点，目前尚无有效的内分泌、靶向治疗。目前无论是病因的基础研究或者是临床诊断和治疗研究，都是为了延长患者的生存时间和提高生存质量，使患者有一个好的预后。因此，加强对三阴乳腺癌预后规律的探索是非常必要的。

evi-1蛋白，又称mds1和evi-1蛋白复合体基因座(mds1andevi1complex，mecom)蛋白，属于锌指转录因子，在多种恶性肿瘤中表达上调，且与肿瘤的不良预后有关。在乳腺癌中，evi-1蛋白可能通过促进乳腺癌细胞生长、侵袭等相关基因的表达，发挥致癌作用。crt蛋白(calreticμlin)是骨骼肌肌质网膜上的钙结合蛋白，是一种多功能钙结合分子伴侣，文献报道其在促进肿瘤细胞增殖、迁移、黏附和诱导凋亡抵抗方面有重要作用。我们前期研究发现下调mda-mb-231乳腺癌干细胞中crt蛋白的表达能显著抑制乳腺癌干细胞的增殖、迁移；

现有技术中的三阴乳腺癌预后预测标志物包括：蛋白、信使rna、dna、microrna、代谢产物，或这类生物分子的整合。迄今为止研究最多的还是蛋白，因为蛋白一般可以通过免疫组化评估。现有证据表明相关标志性蛋白的异常调节参与三阴乳腺癌的发生发展。但是，目前尚没有利用这些标识性蛋白准确预测tnbc预后的报道。

技术实现要素：

本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种三阴乳腺癌预后预测标志物及其检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：

一种三阴乳腺癌预后预测标志物，所述三阴乳腺癌预后预测标志物为evi-1蛋白或crt蛋白。

上述的三阴乳腺癌预后预测标志物的检测方法，包括以下步骤：

1)制作乳腺癌组织石蜡切片；

2)脱蜡和水化

石蜡切片先后置于二甲苯中浸泡2次、15分钟/次，无水乙醇中浸泡2次、3分钟/次；分别在95％乙醇、85％乙醇中浸泡3分钟，用自来水冲淋1分钟；

3)高压加热枸橼酸钠缓冲液组织抗原修复液

加热枸橼酸钠缓冲液组织抗原修复液至沸腾；将脱蜡和水化后的切片放入置于耐高温染色架上的压力锅中，加热至喷汽，2分钟后，压力锅离开热源，自然冷却5分钟；用自来水冲洗使其冷却，待冷却至室温后取出切片；用蒸馏水冲洗2次、3分钟/次；再用pbs溶液冲洗3次、3分钟/次；

4)阻断内源性过氧化物酶

将步骤3)得到的切片除去pbs溶液，加100μl内源性过氧化物酶阻断剂，室温下培育10分钟，pbs溶液冲洗3次、3分钟/次；

5)加evi-1蛋白，crt蛋白一抗或空白对照试剂

将步骤4)得到的切片除去pbs溶液，分为三份，分别加100μl的evi-1蛋白一抗，crt蛋白一抗或空白对照试剂，室温下培育60分钟，pbs溶液冲洗3次、3分钟/次；

6)加酶标聚合物

将步骤5)得到的切片除去pbs液，对于在pbs溶液冲洗前加过100μl的evi-1蛋白一抗和crt蛋白一抗的切片，分别加100μl的evi-1蛋白二抗和crt蛋白二抗，室温下培育15分钟，pbs溶液冲洗3次、3分钟/次；

7)显色

将步骤6)得到的切片除去pbs溶液，加100-200mldab显色液，培育3-5分钟；

8)复染

将步骤7)得到的切片用自来水冲洗，加100-200ml苏木素体细胞染色液培育10-30秒；pbs溶液或自来水冲洗反蓝；

9)脱水、透明、封片

在85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇中分别浸泡3分钟，用二甲苯进行透明处理，以中性树胶和盖玻片封片；

10)评价

对步骤9)得到的切片采用光学显微镜进行观察胞质和/或胞核的颜色，计算阳性细胞数占总细胞数的百分数；

evi-1蛋白，crt蛋白阳性判断标准为：evi-1蛋白以细胞质和/或细胞核出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性，crt蛋白以细胞核和/或细胞质出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性；每张切片随机选取5个高倍视野观察，根据组织染色强度及阳性细胞面积进行综合评分；

综合评分具体准则如下：

(1)染色强度：

无着色为0分，弱染色为1分，中等染色为2分，强染色为3分；

(2)阳性细胞百分比：

无阳性细胞为0分；

大于或等于1％，且小于或等于25％为1分；

大于或等于26％，且小于或等于50％为2分；

大于或等于51％，且小于或等于75％为3分；

大于或等于76％为4分。

(3)evi-1蛋白和/或crt蛋白的综合评分的标准：

染色强度和阳性细胞面积百分比两项得分相乘，0分～4分为低表达组，6分～12分评估为高表达组。

在上述技术方案中，步骤10)中，对应于不同的表达组，其三阴乳腺癌预后的情况分别为：

evi-1蛋白，crt蛋白为双低表达组：无进展的时间间隔在5年以上；

evi-1蛋白为低表达组，crt蛋白为高表达组：无进展的时间间隔在3年以上；

evi-1蛋白为高表达组，crt蛋白为低表达组：无进展的时间间隔在1年以上；

evi-1蛋白，crt蛋白为双高表达组：无进展的时间间隔在1年以下。

本发明具有以下的有益效果：

本发明的三阴乳腺癌预后预测标志物及其检测方法，通过脱蜡和水化、高压加热、阻断内源性过氧化物酶等步骤，对标志物进行了检测，根据evi-1蛋白，crt蛋白表达的不同，得到了不同程度的多个表达组。

本发明对三阴乳腺癌预后的预测给出了新的标志物及其特定的检测方法，避免了免疫组化基础上检测不一致、甚至相反结论的情况。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

图1为evi-1蛋白和crt蛋白在tnbc中的表达(s-p法×400)示意图。

具体实施方式

下面对本发明做以详细说明。

本发明的三阴乳腺癌预后预测标志物的检测方法包括以下步骤：

1)制作乳腺癌组织石蜡切片；

收集2010年1月至2015年6月某医科大学附属一院及附属三院术后病理、免疫组化及临床资料完整的tnbc患者88例。

临床病理资料包括：年龄、体重指数(bmi)、病理类型、组织学分级、肿瘤大小、脉管癌栓、淋巴结转移情况、ptnm分期、ki-67、p53、无进展生存时间(pfs)，总生存时间(os)。具体情况见表1。所有tnbc患者均随访至2016年8月，随访时间14～70个月，中位随访时间为44个月。

依据《ajcc癌症分期手册第十版》对肿瘤进行分期。病理组织学诊断依据2003年《who乳腺及女性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中乳腺癌的诊断标准，由两位高级病理医生进行诊断、分级及分期。

88例术后标本都进行了免疫组织化学检查。

免疫组织化学检查：

evi-1蛋白和crt蛋白在tnbc及癌旁组织中的表达

88例tnbc患者的石蜡切片标本中，evi-1蛋白高表达率为59.1％，其阳性表达主要定位于细胞质，少数同时定位于细胞核和细胞质，表现为细胞质和/或细胞核内呈现棕黄色或者棕褐色颗粒(图1中的a-c)；crt蛋白高表达率为72.7％，其阳性表达定位于细胞核和细胞质(图1中的d-f)。癌旁组织切片中evi-1蛋白及crt蛋白表达均为弱阳性或缺失表达。分析结果显示，tnbc组与癌旁组织的evi-1蛋白、crt蛋白表达差异均有统计学意义(表1)。tnbc组织中evi-1蛋白和crt蛋白的阳性表达率明显高于癌旁组织(p<0.05)。

表1：evi-1蛋白、crt蛋白在tnbc及癌旁组织中的表达

注：evi-1蛋白tnbc组织vs.癌旁组织:#p<0.05；crt蛋白tnbc组织vs.癌旁组织:△p<0.05；阳性表达＝高表达+低表达

2)脱蜡和水化

石蜡切片先后置于新鲜的二甲苯中浸泡2次、15分钟/次，无水乙醇中浸泡2次、3分钟/次，分别在95％乙醇、85％乙醇中浸泡3分钟，用自来水冲淋1分钟；

3)高压加热枸橼酸钠缓冲液组织抗原修复液

加热枸橼酸钠缓冲液抗原修复液至沸腾；将脱蜡和水化后的切片放入置于耐高温染色架上的压力锅中，加热至喷汽，2分钟后，压力锅离开热源，自然冷却5分钟；用自来水冲洗使其冷却，待自然冷却至室温后取出切片；用蒸馏水冲洗2次、3分钟/次；再用pbs溶液冲洗3次、3分钟/次；

4)阻断内源性过氧化物酶

将步骤3)得到的切片除去pbs溶液，加100μl内源性过氧化物酶阻断剂，室温下培育10分钟，pbs溶液冲洗3次、3分钟/次；

5)加evi-1蛋白，crt蛋白一抗或空白对照试剂

将步骤4)得到的切片除去pbs溶液，分为三份，分别加100μl的evi-1蛋白一抗，crt蛋白一抗或空白对照试剂，室温下培育60分钟，pbs溶液冲洗3次、3分钟/次；

6)加酶标聚合物

将步骤5)得到的切片除去pbs液，对于在pbs溶液冲洗前加过100μl的evi-1蛋白一抗和crt蛋白一抗的切片，分别加100μl的evi-1蛋白二抗和crt蛋白二抗，室温下培育15分钟，pbs溶液冲洗3次、3分钟/次；

7)显色

将步骤6)得到的切片除去pbs溶液，加100-200mldab显色液，培育3-5分钟；

8)复染

将步骤7)得到的切片用自来水冲洗，加100-200ml苏木素体细胞染色液培育10-30秒；pbs溶液或自来水冲洗反蓝；

9)脱水、透明、封片

85％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液、无水乙醇中分别浸泡3分钟，二甲苯透明，中性树胶和盖玻片封片；

10)评价

采用光学显微镜进行观察胞质和/或胞核的颜色，计算阳性细胞数占总细胞数的百分数；

evi-1蛋白，crt蛋白阳性判断标准为：evi-1蛋白以细胞质和/或细胞核出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性，crt蛋白以细胞核和/或细胞质出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性；每张切片随机选取5个高倍视野观察，参考syedkmohsin等报道的标准进行改良，采用半定量评分标准判断，即根据组织染色强度及阳性细胞面积进行综合评分。

综合评分具体准则如下：

(1)染色强度：

无着色为0分，弱染色为1分，中等染色为2分，强染色为3分；

(2)阳性细胞百分比：

无阳性细胞为0分；

大于或等于1％，且小于或等于25％为1分；

大于或等于26％，且小于或等于50％为2分；

大于或等于51％，且小于或等于75％为3分；

大于或等于76％为4分；

(3)evi-1蛋白和/或crt蛋白的综合评分的标准：

染色强度和阳性细胞面积百分比两项得分相乘，0分～4分为低表达组，6分～12分评估为高表达组。

对应于不同的表达组，其三阴乳腺癌预后的情况分别为：

evi-1蛋白，crt蛋白为双低表达组：无进展的时间间隔在5年以上；

evi-1蛋白为低表达，crt蛋白为高表达组：无进展的时间间隔在3年以上；

evi-1蛋白为高表达，crt蛋白为低表达组：无进展的时间间隔在1年以上；

evi-1蛋白，crt蛋白为双高表达组：无进展的时间间隔在1年以下。

本发明的三阴乳腺癌预后预测标志物及其检测方法，通过脱蜡和水化、高压加热、阻断内源性过氧化物酶等步骤，对标志物进行了检测，根据evi-1蛋白，crt蛋白表达的不同，得到了不同程度的多个表达组。

本发明对三阴乳腺癌预后的预测给出了新的标志物及其特定的检测方法，避免了免疫组化基础上检测不一致、甚至相反结论的情况。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。