一种新型比率型免标记荧光传感器及其应用的制作方法

本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种重金属pb²⁺的快速检测方法。本发明属于检测技术领域。

背景技术：

铅离子(pb²⁺)是一种不可降解的环境污染物，对人体健康的危害十分严重。例如，血液中即使存在微量的pb²⁺也会对人体造成不可逆的脑损伤和精神发育的迟滞，特别是对于血脑屏障尚不完善的婴幼儿和儿童而言，其危害更甚。因此，开发可靠的超灵敏的pb²⁺传感器来实现环境和生物样品中的pb²⁺检测具有重要的意义。目前对于重金属pb²⁺检测方法的文献报道较多(chemicalcommunications,2015，51，979-995.；j.am.chem.soc.,2007，129，262-263.；analyticalchemistry,2012，84，3703-3709.；chemicalcommunications,2011，47，6278-6280.；analyst,2014，139，6326-6342.)，大多数是基于“8-17”dnazyme的设计，利用不同的读出信号，如电化学，比色法和荧光技术实现对pb²⁺的检测。其中荧光检测技术因具有超高的灵敏度而备受关注，然而单一荧光信号的荧光探针具有不可忽视的缺点，容易受环境因素影响从而产生假阴性或假阳性结果。因此，亟需开发出新型荧光探针用于pb²⁺的超灵敏检测。比率型荧光探针具有内校正性质，可以有效消除环境因素的影响。基于以上考虑，我们开发了一种免标记、特异性强、稳定性好、检测速度快、操作简单且成本低的快速pb²⁺检测方法。其检测结果具有良好的重现性，确保了检测结果的准确度。

技术实现要素：

本发明针对pb²⁺检测的重大需求，设计并合成出适用于现场快速、准确检测实际样品中低浓度pb²⁺的新型比率型免标记荧光传感器。该体系也可进一步应用于研制相关试剂盒、试纸条。为达到上述目的，本发明创造的技术方案如下：

本方法将dna为模板的银纳米团簇与pb²⁺依赖的dna酶相结合，基于pb²⁺对其特异性识别位点的切割，在加入pb²⁺室温孵育3.5h后，使得ds-dna-agncs荧光发生变化，其荧光强度比值(f560/f685)与pb²⁺浓度的对数呈现线性关系，可用于标准样品和实际样品中pb²⁺的定量检测。

本发明pb²⁺生物传感器的构建具体包括以下步骤：

(1)g-dna-agncs纳米团簇的合成：首先将0.5μmg-dna模板进行退火处理(90℃，8min)，降至室温后加入3.0μmagno3溶液和3.0μmnabh4溶液，4℃过夜反应后，用荧光分光光度仪器检测该体系的荧光强度。生成的g-dna-agncs纳米团簇，在470nm波长激发下发射绿色荧光，在560nm处达到最大荧光强度f560，在610nm波长激发下发射较弱的红色荧光，在685nm处达到最大荧光强度f685；

(2)pb²⁺传感体系的构建：在g-dna-agncs体系中加入r-dna进行杂交反应，形成由g-dna与r-dna，双链的g-dna/r-dna为模板的银纳米团簇(命名为ds-dna-agncs)，由于双链的形成，银纳米团簇在560nm处的荧光降低，而685nm处的荧光得到极大增强。本发明所构建新型比率型免标记荧光传感器用于快速检测pb²⁺。

本发明新型比率型免标记荧光传感器的应用，用于快速检测pb²⁺的具体方法是：

(1)所述ds-dna-agncs传感体系中g-dna包含形成pb²⁺特异切割位点的dnazyme序列g1及可结合agncs的模板序列g2；r-dna包含有与g1互补的r1序列、pb²⁺可切割位点的ra序列及与g2-1部分互补的模板r2-1序列，r-dna被分裂为两部分，其中r2部分从ds-dna-agncs中释放，导致685nm处荧光降低，而560nm处荧光得到显著恢复，以f560/f685为检测信号，以pb²⁺浓度的对数为横坐标对检测数据进行处理，通过拟合得到线性回归方程；

(2)检测实际样品时在待测样品溶液中加入ds-dna-agncs和不同浓度的pb²⁺，室温孵育3.5小时后，用荧光分光光度仪检测ds-dna-agncs的荧光强度，激发波长为470nm、610nm，发射波长为560nm、685nm；根据步骤(1)得到的线性回归方程计算样品中pb²⁺的浓度。

因为所获得的实际水样、血样中不含有铅离子。所以需要人为的进行添加，以模拟实际样品中铅离子的检测，用以说明本发明的方法的准确性和有效性。

本发明所述的是一种快速检测pb²⁺的新方法。相对于现有技术，本发明创造所述的pb²⁺的检测方法具有以下优势：本发明将具有pb²⁺特异性的dna模板与银纳米团簇相结合(ds-dna-agncs)，制备了有pb²⁺响应的比率型荧光探针，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测速度快、免标记、操作简单且成本低的优势。

附图说明

构成本发明创造的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1为本发明创造实施例所述的ds-dna-agncs单荧光团比率型探针用于pb²⁺的超灵敏检测的原理验证相关实验数据。

图2为本发明创造实施例所述的ds-dna-agncs的透射电子显微镜。

图3为本发明创造实施例所述dna-agncs溶液中g2-1和r2-1碱基互补数对检测pb²⁺生物传感体系的影响。

图4为本发明创造实施例所述的检测pb²⁺所用缓冲溶液ph的优化实验。

图5为本发明创造实施例所述的在传感体系中加入pb²⁺后反应时间的优化实验。

图6为本发明创造实施例所述的ds-dna-agncs生物传感体系对不同浓度pb²⁺的荧光响应。

图7为本发明创造实施例所述的方法检测pb²⁺的特异性验证实验数据。

具体实施方式

为了使本发明上述特征和发明创造中优化条件更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下ds-dna-agncs与pb²⁺二者反应的体系为300μl(包括dna-agncs和不同浓度的pb²⁺)，下面给出二者的浓度都是在300μl体系下的浓度。

实施例1

(1)g-dna-agncs纳米团簇的合成：首先将0.5μmg-dna模板进行退火处理(90℃，8min)，降至室温后加入3.0μmagno3溶液和3.0μmnabh4溶液，4℃过夜反应后，用荧光分光光度仪器检测该体系的荧光强度。生成的g-dna-agncs纳米团簇，在470nm波长激发下发射绿色荧光，在560nm处达到最大荧光强度f560，在610nm波长激发下发射较弱的红色荧光，在685nm处达到最大荧光强度f685；

(2)pb²⁺传感体系的构建：在g-dna-agncs体系中加入r-dna进行杂交反应，形成由g-dna与r-dna，双链的g-dna/r-dna为模板的银纳米团簇(命名为ds-dna-agncs)，由于双链的形成，银纳米团簇在560nm处的荧光降低，而685nm处的荧光得到极大增强。本发明所构建新型比率型免标记荧光传感器用于快速检测pb²⁺。

传感体系荧光响应验证pb²⁺检测原理：如图1所示，实施例1得到的g-dna-agncs在560nm和685nm的特征峰(a和a')，此时该探针在560nm处响应比较强，因此呈现绿色荧光信号；与r-dna形成双链后，得到实施例1的ds-dna-agncs由于形成双链，r-dna中的r2序列接近g-dna-agncs，560nm处荧光响应降低，685nm处荧光响应得到增强(c和c')，导致绿色发射的g-dna-agncs被转化为红色发射的双链dna模板化agnc(ds-dna-agncs)；在pb²⁺作用下，r-dna的ra位点被pb²⁺切割，释放出ds-dna-agncs中的r2片段，从而引起绿色荧光信号恢复而红色荧光响应降低(b和b')；而在形成双链ds-dna-agncs前，pb²⁺对g-dna-agncs的荧光响应不产生影响(d和d’)。以上结果证明所构建检测方法切实可行。所用激发波长为470nm、610nm，发射波长分别为560nm、685nm。

实施例2

图2为dna-agncs的透射电子显微镜，由此可知ds-dna-agncs的粒径约为3nm。

实施例3

优化r2-1与g2-1形成双链所含碱基对对传感体系荧光响应(f560/f685)的影响：探究影响pb²⁺荧光传感体系因素的实验中，pb²⁺的比率检测是基于g-dna/r-dna中释放r2引起信号改变，碱基配对数是影响g-dna/r-dna杂交过程的重要因素。如果互补碱基对数太少，则不能有效地形成依赖于pb²⁺的切割位点，则pb²⁺引起的信号改变不明显。当互补碱基对数越多，双链越稳定，就越难释放出r2，从而降低检测灵敏度。从图3得知，当互补碱基对数为9时，r-dna存在时可以有效地将绿色发射的g-dna-agncs转换为红色发射的ds-dna-agncs。加入pb²⁺后，可以恢复绿色荧光，产生最明显的荧光比率变化。因此，选择g2-1和r2-1为9个碱基对的g-dna/r-dna进行pb²⁺检测。

实施例4

优化传感体系所用缓冲溶液ph优化。如图4所示，缓冲溶液ph值对ds-dna-agncs的荧光响应影响不大；加入pb²⁺后，在ph7.4时传感体系检测信号变化达到最佳。

实施例5

图5说明在所构建生物传感体系加入pb²⁺后，所引起的信号变化随反应时间的延长而增大，在反应时间达到210min时检测信号变化达到最高值，之后不再随时间的延长而增加。根据上述结果，孵育时间为210min为最佳反应条件。

实施例6

pb²⁺灵敏度检测。如图6所示，随着pb²⁺浓度的增加，传感体系在560nm处荧光逐渐增强，而685nm处荧光逐渐减弱，其比值(f560/f685)与pb²⁺浓度的对数表现出极好的线性相关，检出限为1.0pm，检测线性范围为0.001nm至10nm(r²＝0.9987)，通过线性拟合获得线性方程：

y＝0.245x+0.985(r²＝0.9987)(1)

本发明所构建的dna-agncs传感体系检测限低于大多数之前文献报道值。且检测误差分布在一个非常窄的范围内，表明所发展的分析方法具有良好的重现性。

实施例7

pb²⁺特异性检测。选择k⁺，ca²⁺，cr³⁺，ni²⁺，cu²⁺，pb²⁺，mn²⁺，mg²⁺，cd²⁺，fe²⁺，zn²⁺和fe³⁺等金属离子(5000nm)作为本实验检测的干扰物质，研究该方法的特异性。如图7所示，只有pb²⁺可引起明显的荧光增强，而其它金属离子都没有引起明显的荧光响应。结果表明所制备的传感器对pb²⁺具有良好的选择性，能够满足实际样品检测要求。

实施例8

以湖水、自来水及稀释过的人血清作为实际样品，在待测样品溶液中加入ds-dna-agncs和不同浓度的pb²⁺，室温孵育3.5小时后，用荧光分光光度仪检测ds-dna-agncs的荧光强度，激发波长为470nm、610nm，发射波长为560nm、685nm；根据实施例1步骤(3)得到的线性回归方程(1)计算样品中pb²⁺的浓度。所发展的比率荧光检测结果与icp-ms的检测结果相一致，证实了所构建的比率型荧光传感器适用于实际样品中pb²⁺的测定。湖水(表1)、自来水(表2)及稀释过的人血清(见表3)中pb²⁺加标回收率分布在81％-110.2％，证明此方法可应用于实际样品检测。

表1

表2

表3

实施例8

本发明研究中使用的dna模板如下：

实施例9

(1)g-dna-agncs纳米团簇的合成：首先将0.5μmg-dna模板进行退火处理(90℃，8min)，降至室温后加入3.0μmagno3溶液和3.0μmnabh4溶液，4℃过夜反应后，用荧光分光光度仪器检测该体系的荧光强度。生成的g-dna-agncs纳米团簇，在470nm波长激发下发射绿色荧光，在560nm处达到最大荧光强度f560，在610nm波长激发下发射较弱的红色荧光，在685nm处达到最大荧光强度f685；

(2)pb²⁺传感体系的构建：在g-dna-agncs体系中加入r-dna进行杂交反应，形成由g-dna与r-dna，双链的g-dna/r-dna为模板的银纳米团簇(命名为ds-dna-agncs)，由于双链的形成，银纳米团簇在560nm处的荧光降低，而685nm处的荧光得到极大增强。本发明所构建新型比率型免标记荧光传感器用于快速检测pb²⁺。

同样可以按照实施例1的方法进行验证。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例，并不用于限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。