一种大鼠CD4抗体包被磁珠及其制备方法和应用以及含该磁珠的试剂盒与流程

本发明涉及一种大鼠cd4抗体包被磁珠及其制备方法和应用以及含该磁珠的试剂盒。

背景技术：

现有市面上，还没有一种试剂盒，能够用来检测大鼠肾移植后的免疫排斥反应。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种大鼠cd4抗体包被磁珠及其制备方法和应用以及含该磁珠的试剂盒。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种大鼠cd4抗体包被磁珠的制备方法，步骤1：将磁珠通过c1试剂洗涤，之后放在磁铁上吸附后去上清液；

步骤2：将步骤1预处理的磁珠中加入抗体、c1试剂、c2试剂后，在室温条件下离心旋转16-24h；

步骤3：将步骤2处理的磁珠通过磁铁沉淀，后通过hb试剂进行清洗；

步骤4：将步骤3处理的磁珠通过磁铁沉淀后去上清，后通过lb试剂进行清洗；

步骤5：将步骤4处理的磁珠通过磁铁沉淀后去上清，后通过sb试剂进行清洗；该过程可根据抗体渗漏情况重复多次；

步骤6：将步骤5处理的磁珠再加入sb试剂，离心处理，之后放置于磁铁吸附后去除上清液，完成大鼠cd4抗体包被磁珠的制备；

其中，c1试剂为60-100％丙烯醛缓冲液，c2试剂为pbs缓冲液。

它还包括步骤7：将步骤6处理的磁珠中加入sb试剂，在2-8℃下储存。

步骤7中还包括防腐剂叠氮化钠。

进一步的，步骤2中，磁珠和抗体、c1试剂、c2试剂的重量体积比为1mg∶20ul∶30ul∶50ul。

进一步的，步骤3中，磁珠和hb试剂的重量体积比为1mg∶40ul。

进一步的，步骤4中，磁珠和lb试剂的重量体积比为1mg∶40ul。

进一步的，步骤5中，磁珠和sb试剂的重量体积比为1mg∶40ul。

所述hb试剂、lb试剂、sb试剂均为0.01％-0.1％tween20。

所述磁珠为环氧树脂磁珠。

所述抗体为兔抗鼠的抗体。

一种通过上述制备方法制得的大鼠cd4抗体包被磁珠。

一种试剂盒，所述试剂盒包括大鼠cd4抗体包被磁珠的制备方法所制得的大鼠cd4抗体包被磁珠。

大鼠cd4抗体包被磁珠在检测大鼠肾移植后的免疫排斥反应中的应用。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：大鼠cd4抗体包被磁珠的制备方法，通过上述方法制成的大鼠cd4抗体包被磁珠结合immuknowtm-cylex免疫细胞功能测定试剂盒，能够用于检测大鼠肾移植后的免疫排斥反应。

附图说明

图1正常大鼠和肾移植大鼠atp水平测定对比图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

实施例1：

一种大鼠cd4抗体包被磁珠的制备方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1：用适量75％是丙烯醛缓冲液试剂洗环氧树脂磁珠，涡旋。洗完后放在磁铁上吸附1min，然后去上清。该过程中，只要保证丙烯醛缓冲液的量能够清洗环氧树脂磁珠即可，即便过量也无妨。

步骤2：将步骤1预处理的环氧树脂磁珠中加入丙烯醛缓冲液、pbs缓冲液后，在37℃室温条件下离心旋转16h；其中各组分的占比如下：5mg环氧树脂磁珠、100ul兔抗鼠抗体、150ul丙烯醛缓冲液、250ulpbs缓冲液。

步骤3：将步骤2处理的环氧树脂磁珠通过磁铁沉淀1min，后通过hb试剂进行清洗；5mg的环氧树脂磁珠用200ul0.05％tween20试剂进行清洗。

步骤4：将步骤3处理的环氧树脂磁珠通过磁铁沉淀1min后去上清，后通过lb试剂进行清洗；5mg的环氧树脂磁珠用200ul0.05％tween20进行清洗。

步骤5：将步骤4处理的环氧树脂磁珠通过磁铁沉淀1min后去上清，后通过sb试剂进行清洗；5mg的环氧树脂磁珠用200ul0.05％tween20试剂进行清洗。

步骤6：将步骤5处理的环氧树脂磁珠再加入0.05％tween20试剂，离心处理，之后放置于磁铁吸附后去除上清液，完成大鼠cd4抗体包被磁珠的制备。

步骤7：将步骤6处理的磁珠中加入0.05％tween20试剂，在2-8℃下储存。其中，按100ulsb试剂/mg磁珠的配比关系，添加0.05％tween20试剂。

实施例2

一种试剂盒，所述试剂盒包括实施例1中大鼠cd4抗体包被磁珠的制备方法所制得的大鼠cd4抗体包被磁珠。

实施例3

对发明制得的大鼠cd4抗体包被磁珠进行atp检测，具体实验过程如下：

1.试验第一部分：细胞刺激。

预先从冰箱取出试剂盒中相关组分并平衡至室温。

1.1小心地颠倒混匀质控对照和大鼠cd4全血样本，重复多次以确保血细胞分布均匀。：

1.2用样本稀释液按1:3稀释质控和全血样本(例如：250ul全血+750ul样本稀释液)。

1.3稀释后，每个样本使用一条8孔培养板板条，按照工作表组装培养板。

1.4将25ul样本稀释液加入每个板条的前4个孔中，作为非刺激孔。

1.5将25ul样本稀释液加入每个板条的其余4个孔中，作为刺激孔。

1.6将100ul已稀释的质控样本加入板条1的各孔中。

1.7根据工作表，将100ul已稀释的待测样本加入相应板条的各孔中。

1.8盖上培养板盖，在平板振荡器上震荡30秒。

1.9将带盖的培养板在37℃/5％co2/加湿处理的培养箱中孵育16-18小时。

2.实验第2部分：cd4细胞选择和atp释放。

预先从冰箱取出试剂盒中相关组分并平衡至室温。

2.1从培养相中拿出培养板，置于平板振荡器上震荡3分钟。

2.2小心颠倒cd4磁珠溶液试剂瓶若干次以充分悬浮磁珠；用单通道移液器或连续加样移液器向各孔分别加入50ul磁珠。磁珠在吸取前应充分悬浮以确保各孔加入量一致。

注意：因为磁珠不易在储液槽中充分悬浮，请不要用多通道微量移液器操作这一步骤。

2.3盖上培养板盖，在平板振荡器上震荡30秒，室温下静置(18-28℃)孵育15分钟。震荡培养板30秒，室温(18-28℃)再次静置孵育15分钟。最后，再次震荡培养板30秒以重新悬浮磁珠。

2.4从培养板上取出板条，放在组装好的磁座上，等待1-2分钟使磁珠聚集在孔的一侧；按以下步骤从全血中分离cd4细胞。

2.5用连接到负压抽吸真空泵系统的8通道吸头伸入微孔吸除磁珠以外的的含红细胞培养液。注意轻柔操作，避免吸走磁珠。

2.6洗涤板条三次，以清除残余的未结合的游离细胞和孔中的其他干扰物质。

注意：加入洗涤液时，需垂直提持多通道微量移液器，避免移液器吸头触碰微孔内壁上的磁珠。

洗涤#1：向各孔加入200ul洗涤液，等待一分钟，然后吸走洗涤液。

洗涤#2：向各孔加入200ul洗涤液，检查微孔内壁，若有凝血斑，则用微量移液器吸头将其移除。等待1分钟，然后吸走洗涤液。

洗涤#3：向各孔加入200ul洗涤液，从磁座上移去板条架，将板条放在平板振荡器上振荡1分钟，然后将板条架放在磁座上。等待1分钟，待磁珠聚集在孔的一侧，然后吸走洗涤液。

2.7向各孔加入200ul裂解试剂。

2.8将板条架从磁座上移开，在平板振荡器上振荡5分钟。

2.9将板条架放在磁座上，等待1-2分钟。

2.10继续进行试验第3部分。

注意：如果不能立即(4小时内)进行试验第3部分，应将板条冷冻保存：将板条从磁座板条架上取下来，放在培养板框架上；密封板条，盖上培养板盖，-20℃冷冻保存。冷冻的板条至少在1个月内保持稳定。若要继续进行后续检测试验，从冰箱中取出培养板，将其平衡至室温(18-28℃)，把板条放入磁座板条架上，然后重复上述2.8和2.9步骤。

3.试验第3部分：atp测量。

3.1参照试验工作表组装测量板：测量板包括质控测量条，大鼠cd4样本测量条，校准品测量条。

3.2依据工作表，用多道微量移液器从培养板各孔取出50ul裂解产物，加入测量板条相应孔中；将裂解产物加入每一板条之前，需更换新的移液器吸头。

3.3依照工作表，从各浓度水平atp校准品中各取出50ul分别加入测量板的相应孔(通常做2个复孔)

3.4发光试剂：使用前，轻轻颠倒使其充分混匀。用多道微量移液器取150ul发光试剂加至测量板的各孔中；将测量板置于平板振荡器上振荡30秒，以确保充分混合。在加入发光试剂后3-10分钟内读取相对发光强度(rlu)。最终结果参见图1，正常大鼠检测发现atp结果为601.08±10.65ng/ml，而肾移植之后的大鼠atp结果为294.96±48.59ng/ml，与正常对照组相比p<0.05，差异具有统计学意义。本发明制备的大鼠cd4抗体包被磁珠能够用于检测大鼠肾移植后的免疫排斥反应。