一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法与流程

本发明属于多组分生化药技术分析领域，具体涉及一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法。
背景技术：
：转移因子(transterfactor，简称tf)又称传输因子，是一种天然双向免疫调节剂，是目前治疗免疫功能低下、缺陷等相关疾病的理想药物。转移因子的主要成分为健康猪或牛脾脏中提取的多肽、氨基酸和核糖核酸。准确测定转移因子中的核糖核酸含量对于优化转移因子生产工艺及控制产品质量具有重要的意义。从健康猪脾脏提取分离的核糖核酸(rna)，是由几十至几千个核苷酸聚合而成的长链，每一种rna都有一定的核苷酸排列顺序和二级、三级结构。现有技术核糖核酸含量测定的方法采用紫外吸收系数法，但因一方面样品中的杂蛋白和苯酚等在相同波长处均有吸收，干扰测定结果；另一方面rna片段的长短以及二级结构状态会对吸光度值产生较大影响，导致测定结果不准确。查阅相关文献，有采用高效液相色谱法测定核糖核酸含量的文献报道，但一般采用离子对-hplc法或者离子色谱法进行分离，且只用于单独分离核苷酸或脱氧核苷酸。离子对色谱法平衡时间较长，且色谱峰容易漂移，色谱柱使用寿命短。如上所述，目前关于核糖核酸含量测定的研究尚少，因此目前法定对照品仅有4种脱氧核苷酸(腺嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸)，其他4种核苷酸(腺嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸)及4种核苷(腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷)暂无法定对照品。技术实现要素：为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，该方法能够实现对转移因子口服溶液中核糖核酸进行准确定量，排除其他物质的干扰且相邻组分峰间分离度佳，重现性好，检测效率高。本发明是通过以下技术方案来实现：本发明公开的转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，包括以下步骤：1)配制转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液采用蛇毒磷酸二酯酶对转移因子口服溶液进行酶解，获得转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液；2)构建核糖核酸的标准曲线方程以鸟嘌呤脱氧核苷酸为对照品，配制线性系列溶液，利用高效液相色谱法检测获得色谱图，以鸟嘌呤脱氧核苷酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程及线性相关系数；其中，高效液相色谱检测条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以流动相a和流动相b进行梯度洗脱，其中：流动相a为甲醇；流动相b为ph值为3.55～3.65、浓度为0.1mol/l的磷酸二氢钾溶液；检测过程中：波长为210～320nm，进样量为1～50μl，流速为0.6～1.0ml/min，柱温为33～37℃；3)转移因子口服液中核糖核酸的检测精密量取步骤1)制得的转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液，利用高效液相色谱法在与步骤2)相同的色谱检测条件下获得色谱图，由相对保留时间定位核糖核酸基本组成物质即4种核苷酸和4种核苷的色谱峰；4)转移因子口服液中核苷酸类物质的含量计算根据步骤2)获得的标准曲线方程和步骤3)的色谱峰，从标准曲线方程中求出各待测物质的含量，乘以相应的相对校正因子并加和即得核糖核酸含量。优选地，步骤1)中，采用蛇毒磷酸二酯酶对转移因子口服溶液进行酶解，具体操作步骤如下：步骤a：取蛇毒磷酸二酯酶，加缓冲液制成5iu/ml的溶液，每支1.5μl分装，用时加缓冲液13.5μl；所述缓冲液包括110mmol/ltris-hcl，15mmol/lmgcl2，110mmol/lnacl，ph8.9；步骤b：精密量取转移因子口服溶液3μl，加蛇毒磷酸二酯酶溶液15μl，涡旋混匀，置37℃反应30min后，加水至100μl，混匀，沸水浴5min，离心15min，取上清液，即完成酶解操作。优选地，步骤2)中，构建核糖核酸的标准曲线方程具体操作步骤如下：步骤a：精密量取鸟嘌呤脱氧核苷酸对照品20.0mg，置于100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；然后，分别精密量取对照品贮备液0.1ml、0.5ml、1.0ml、2.5ml及5ml，分别置于25ml量瓶中，加水稀释至刻度、摇匀，制得对照品系列溶液；步骤b：分别精密量取上述标准曲线系列溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以鸟嘌呤脱氧核苷酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归，求出标准曲线方程及线性相关系数。优选地，利用高效液相色谱法，进行梯度洗脱时，流动相a与流动相b的变化比例如下：0min，流动相a：2％、流动相b：98％；10min，流动相a：2％、流动相b：98％；10.1min，流动相a：15％、流动相b：85％；20min，流动相a：15％、流动相b：85％；20.1min，流动相a：2％、流动相b：98％；30min，流动相a：2％、流动相b：98％。优选地，十八烷基键合硅胶色谱柱的填料粒度为5～10μm，内径为2～5mm，长度为10～30cm。优选地，流动相b的ph值为3.55；检测波长为260nm；进样量为2μl，流速为0.8ml/min，柱温为35℃。优选地，步骤3)中，核糖核酸基本组成物质的相对保留时间如下：序号化合物名称相对保留时间1胞嘧啶核苷酸0.542尿嘧啶核苷酸0.593鸟嘌呤核苷酸0.674胞嘧啶核苷0.795腺嘌呤核苷酸0.836尿嘧啶核苷1.167鸟嘌呤核苷2.088腺嘌呤核苷2.68。优选地，步骤4)中，相对校正因子，是以对照品鸟嘌呤脱氧核苷酸内参物，测定核糖核酸基本组成物质4种核苷酸及4种核苷得到的相对校正因子，具体如下：与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：第一，采用酶水解-高效液相色谱法测定转移因子口服溶液中核糖核酸含量，可排除干扰物质，方法专属性强；且本发明采用的高效液相色谱条件较文献报道方法可操作性强，检测能力高。第二，通过筛选色谱柱、流动相组成、流动相ph值、色谱柱柱温及优化洗脱时间梯度等措施，确定了最优检测色谱条件；采用该条件检测，液相色谱图中，各氨基酸峰峰形好，分离度高，提高了检测准确度。第三，通过系统的验证研究确定了拟定色谱条件下核糖核酸基本组成物质4种核苷酸及4种核苷的相对校正因子及相对保留时间，检测中可采用“一测多评”方法，以法定标准物质鸟嘌呤脱氧核苷酸为内参物，实现核糖核酸类物质的定量检测，解决了外标法需要对照品较多，不易获得且检测成本较高，操作繁琐的技术难题。本发明适用于转移因子口服溶液中核糖核酸的检测与监控。附图说明图1为本发明实施方案中系统适用性溶液的液相色谱图。图2为发明实施方案中转移因子口服溶液供试品溶液的液相色谱图。具体实施方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明实施例所用转移因子口服溶液为“金花转移因子口服溶液”，国药准字h20013288。本发明公开的转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液的制备方法，包括下述步骤：a、取蛇毒磷酸二酯酶，加缓冲液(110mmol/ltris-hcl，15mmol/lmgcl2，110mmol/lnacl，ph8.9)制成5iu/ml的溶液，每支1.5μl分装，用时加缓冲液13.5μl。b、精密量取转移因子口服溶液3μl，加蛇毒磷酸二酯酶溶液15μl，涡旋混匀，置37℃反应30min后，加水至100μl，混匀，沸水浴5min，离心15min，取上清液，即得。进一步的上述转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液的制备方法的步骤a中的蛇毒磷酸二酯酶的活力优先3～7iu/ml，最优选5iu/ml。进一步的上述步骤b中转移因子口服溶液加蛇毒磷酸二酯酶溶液混匀后，37℃反应时间对核糖核酸含量测定结果影响较大，反应时间太短，样品酶解不完全，反应时间太长，影响样品检测效率，经考察能达到完全酶解的最短时间为30min。进一步的上述步骤b中混合溶液于沸水浴的时间对其核糖核酸含量测定结果影响较大，沸水浴时间太短，样品酶解不完全，核糖核酸含量检测结果偏低；沸水浴时间太长易导致酶解出来的核苷酸类基础物质降解，核糖核酸含量检测结果同样会偏低。沸水浴时间优选3～5min，最优选5min。本发明转移因子口服溶液核糖核酸含量测定采用高效液相色谱法，依据鸟嘌呤脱氧核苷酸及核糖核酸基本组成物质4种核苷酸及4种核苷的性质及转移因子口服溶液中所含核糖核酸的情况，建立检测色谱条件；对建立的色谱条件进行系统的方法学验证研究，保证所建立色谱条件的耐用性、重现性及准确性。以上所述的4种核苷酸包括腺嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸；4种核苷包括腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷。所述检测色谱条件包括：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以甲醇为流动相a，0.1mol/l磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节ph值为3.6)为流动相b进行梯度洗脱。所述的十八烷基键合硅胶色谱柱填料粒度为5～10μm，优选5μm；内径为2～5mm，优选4.6mm；长度为10cm～30cm，优选25cm。所述流动相b中磷酸盐缓冲溶液的ph值为3.55～3.65，优选3.60。所述流动相a-流动相b梯度洗脱的体积比为2:98(0min)，2:98(10min)，15:85(10.1min)，15:85(20min)，2:98(20.1min)，2:98(30min)。所述的检测方法中，检测波长为210-320nm，优选260nm。所述的检测方法中进样量为1～10μl，优选2μl。所述的检测方法中流速为0.6～1.0ml/min，优选0.8ml/min。所述的检测方法中柱温为33～37℃，优选35℃。本发明提供一种“一测多评”的方法，测定转移因子口服溶液中核糖核酸含量，其步骤包括：a、相对校正因子的测定，以中检院可购得且性质相对稳定的法定对照品，即鸟嘌呤脱氧核苷酸内参物，测定核糖核酸基本组成物质4种核苷酸及4种核苷的相对校正因子。b、相对校正因子耐用性考察，考察内容包括：相对校正因子在各种色谱条件(流动相的组成比例、ph值、柱温、流速及检测波长等的微小改变时和使用不同仪器、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、不同操作人员等)的耐用性。c、待测物质在拟定色谱条件下色谱峰的定位，在上述相对校正因子耐用性考察时，以鸟嘌呤脱氧核苷酸为内参物计算其余待测物质峰的相对保留时间，同时考察其耐用性。d、依据上述测得的相对校正因子及相对保留时间，以鸟嘌呤脱氧核苷酸为对照品，配制线性系列溶液，测得标准曲线；由相对保留时间定位核糖核酸基本组成物质4种核苷酸及4种核苷的色谱峰，从标准曲线中求出各待测物质的含量，乘以相应的相对校正因子并加和即得核糖核酸含量。进一步的，上述“一测多评”法测定转移因子口服溶液中核糖核酸含量步骤a中相对校正因子的测定方法采用“标准曲线法”，以鸟嘌呤脱氧核苷酸为内参物，4种核苷酸及4种核苷相对校正因子检测结果如下表1所示：表1相对校正因子检测结果序号化合物名称相对校正因子1胞嘧啶核苷酸1.842尿嘧啶核苷酸1.203鸟嘌呤核苷酸0.804胞嘧啶核苷0.965腺嘌呤核苷酸0.846尿嘧啶核苷0.707鸟嘌呤核苷0.708腺嘌呤核苷0.51进一步的，上述“一测多评”法测定转移因子口服溶液中核糖核酸含量步骤b中所述的耐用性考察条件如下表2所示，考察结果均符合要求。表2相对校正因子耐用性考察条件条件拟定值考察值1考察值2流动相ph值3.63.553.65柱温35℃33℃37℃流速0.8ml/min0.6ml/min1.0ml/min检测波长260nm258nm262nm不同色谱柱kromasil岛津菲罗门不同仪器安捷伦戴安(uv)戴安(dad)不同人员检验员a检验员b检验员c进一步的，上述“一测多评”法测定转移因子口服溶液中核糖核酸含量步骤c中以鸟嘌呤脱氧核苷酸为内参物，4种核苷酸及4种核苷相对保留时间检测结果如下表3所示：表3相对保留时间检测结果序号化合物名称相对保留时间1胞嘧啶核苷酸0.542尿嘧啶核苷酸0.593鸟嘌呤核苷酸0.674胞嘧啶核苷0.795腺嘌呤核苷酸0.836尿嘧啶核苷1.167鸟嘌呤核苷2.088腺嘌呤核苷2.68实施例1转移因子口服溶液酶解条件的筛选以3因素3水平正交试验筛选转移因子口服溶液酶解条件，酶解条件考察的3个因素分别为酶活力浓度、反应时间、酶解样品浓度；通过单因素试验考察确定3个因素的最佳水平值分别为酶活力浓度5iu/ml、反应时间30min、酶解样品浓度1mg/ml。依据上述3个因素的最佳水平值设计的3因素3水平正交试验表见表4，正交试验结果分析见表5：表4转移因子口服溶液酶解条件筛选正交试验表水平酶活力浓度a反应时间b酶解样品浓度c13iu/ml20min0.8mg/ml25iu/ml30min1.0mg/ml37iu/ml40min1.2mg/ml表5转移因子口服溶液酶解条件筛选正交试验结果分析表由表5可见，通过3因素3水平正交试验确定最佳的水解条件组合为：酶活力浓度5iu/ml、反应时间30min、酶解样品浓度1mg/ml；并经极差分析发现影响样品检测结果的最显著因素为酶解样品浓度。实施例2单对照“一测多评”法测定转移因子口服溶液中核糖核酸含量1、色谱条件：采用agilent高效液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以甲醇为流动相a，0.1mol/l磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节ph值为3.6)为流动相b进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml，检测波长为260nm，柱温为35℃，进样体积为2μl。洗脱梯度时间如表6所示：表6洗脱梯度时间表时间(min)流动相a(％)流动相b(％)03971039710.1109020109020.1397303972、标准曲线的测定对照品贮备液的制备精密称取鸟嘌呤脱氧核苷酸对照品20.0mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。标准曲线系列溶液的制备分别精密量取对照品贮备液0.1ml、0.5ml、1.0ml、2.5ml、5.0ml，分置于25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液1～5。测定法分别精密量取上述标准曲线系列溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以鸟嘌呤脱氧核苷酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归，求出标准曲线方程及线性相关系数。3、样品的测定1)供试品溶液的制备精密量取转移因子口服溶液3μl，加蛇毒磷酸二酯酶溶液15μl，涡旋混匀，置37℃反应30min后，加水至100μl，混匀，沸水浴5min，离心15min，取上清液，即得。2)测定，精密量取上述供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。依据表3中各氨基酸的相对保留时间定位4种核苷酸及4种核苷的色谱峰，各色谱峰面积代入标准曲线方程中求出相应的含量，乘以表1中各待测物质相应的相对校正因子并加和即得核糖核酸含量，结果如图2所示，从回归方程中求出核苷酸含量。实施例3单对照“一测多评”法及多对照外标法测定转移因子口服溶液核糖核酸含量结果比较分别采用单对照“一测多评”法及多对照外标法测定同10批转移因子口服溶液中核糖核酸含量，结果显示单对照“一测多评”法及多对照外标法测定结果基本一致；检测结果见下表7：表7两种方法测定转移因子口服溶液中核苷酸含量结果比较表结果显示，单对照“一测多评”法相对多对照外标法检测效率高且需要对照品少、检测效率高且检测成本显著降低。综上所述，本发明方法经过科学系统的验证，其能够实现对转移因子口服溶液中核糖核酸进行准确定量，排除其他物质的干扰且相邻组分峰间分离度佳，重现性好，检测效率高；克服现有技术中的不足；以便对转移因子口服溶液的生产实施有效的监督控制。当前第1页12