一种裸眼或荧光检测Ag+双菲并咪唑探针及使用方法与流程

本发明涉及一种裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针及使用方法。

背景技术：

ag⁺是人体组织内的微量元素之一，但过量的银离子也会对人体造成危害。过量的银离子能与许多生理代谢产物如胺，咪唑和羧酸等活性基团及非活的巯基酶发生相互作用从而危害人体生理环境。同时ag⁺也是生活环境中常见的重金属之一。根据世界卫生组织(who)报道，ag⁺在饮用水中的标准含量应低于0.10ppm。因此，准确、定量的检测ag⁺的含量具有十分重要的意义。目前检测ag⁺的诸多方法中，荧光分析法因高选择性和灵敏度高等特点备受学者们关注。荧光光谱分析法主要是利用荧光化学探针与特定的金属离子之间发生相互化学作用时的荧光光谱的变化实现金属离子的检测。

2013年，李斌连等人合成连一种叔丁基吲哚-螺吡喃衍生物在《光谱学与光谱分析》第33卷第4期1092页-1097页的文章《螺吡喃光响应的汞、铬、银离子探针及相互作用光谱》，并发现该化合物在甲醇溶液中对ag⁺具有选择性识别，但是不是单一性识别ag⁺。2015年，黄池宝等人在《分析化学》第43卷507-511页《用于细胞成像的双氰基二苯代乙烯衍生物双光子荧光银离子探针》报道了一种二苯代乙烯的双光子荧光探针，该探针对ag⁺具有识别能力并应用在细胞检测ag⁺，该探针检测限50μmol，并用在细胞呈现上应用，具有潜在的应用价值。除了荧光探针检测金属离子外，文献也报道了采用紫外光谱法检测金属离子的紫外探针。2018年，czhang等人在《daltontransactions》第47卷7-14页发表第文章《anewbodipy-derivedratiometricsenorwithinternalchargetransfer(ict)effect:colorimetric/fluorometricsensingofag⁺》合成的bodipy的衍生物在甲醇体系中对ag⁺有良好的选择性，是一种紫外吸收比率的ag⁺探针，ag⁺加入使主体的紫外吸收发生明显的蓝移且溶液颜色由无色变成红色，探针分子虽然对ag⁺的检测非常灵敏，但易受到水的干扰，使其应用范围收到限制。

根据的文献报道，目前荧光检测ag⁺主要存在以下缺陷：

1、ag⁺探针种类较少；

2、多数ag⁺的检测需在有机溶液中实现，对水含量要求严格；

3、ag⁺探针的检测限较高，不易检测极低含量ag⁺；

4、ag⁺探针易受外界环境的干扰，探针的使用范围受到限制。

技术实现要素：

本发明要解决现有的ag⁺探针检测环境严格、检测易受其他外界环境干扰、检测不灵敏等缺点，提供一种可以实现裸眼检测，或在水相体系中采用荧光检测、检测不受外界环境影响、具有低检出限的双菲并咪唑ag⁺荧光探针及使用方法。

本发明的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的其结构式为：

上述用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的制备按如下方法进行：

将2-(3-氨基)苯基菲并咪唑和对苯二甲醛按照2.0～5.0:1的物质的量比加入到反应器中，再加入20.0～40.0ml的醇为反应溶剂，在40～100℃搅拌5～10h，反应结束后减压浓缩，得到粗产物。粗产物用有机溶剂重结晶，经抽滤、干燥后得到用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针。

上述方法中的醇类溶剂可以为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、己醇、苄醇等醇类溶剂；重结晶溶剂可以为乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙醚等低沸点溶剂中的任何一种，也可以为上述溶剂中的任何两种溶剂的混合物。

本发明用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的合成方式如下式所示：

上述的用于裸眼检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的使用方法以下步骤进行：

一、将上述的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针溶解于体积比为1:90～99的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepses)混合液中，得到探针溶液a。其中hepes缓冲溶液混合液的ph值为7.0～7.4，用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的浓度为10～20μmol/l；

二、向探针溶液a加入待测溶液，混合均匀，得到样品溶液b；

三、若样品溶液b的颜色从无色变为粉色，可判定待测溶液中含有ag⁺，即实现了采用双菲并咪唑荧光探针裸眼检测待测样品中的ag⁺。

上述的用于荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的使用方法以下步骤进行：

一、将上述的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针溶解于体积比为1:90～99的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepses)混合液中，得到探针溶液a。其中hepes缓冲溶液混合液的ph值为7.0～7.4，用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的浓度为10～20μmol/l；

二、向探针溶液a加入待测溶液，混合均匀，得到样品溶液b；

三、用荧光分光光度计分别测试探针溶液a和样品溶液b的发射光谱。激发波长为331nm，发射波长为397nm，探针溶液a的发射强度为a1，样品溶液b的发射强度为b1。若32b1≥a1≥2b1，则可判定样品溶液中含有ag⁺。

本发明用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针即可实现通过裸眼检测水相体系中对ag⁺，也可以通过荧光光谱检测水相体系中对ag⁺，不受水相体系中其他金属离子的干扰；且ag⁺的检出限较低。裸眼检测具有直观性，检测方法简单、价格低廉，可实现ag⁺的定性检测；荧光光谱检测灵敏、准确，可实现ag⁺的定量性检测。本发明用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针在水体系中ag⁺污染的前期检测和生物体ag⁺毒检测具有极高的应用价值。

附图说明

图1是实施例1中用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针在dmf/hepes缓冲溶液(v/v＝1/90～99，ph＝7.4)体系中，在探针溶液a加入含有不同金属离子的待测溶液后的裸眼颜色变化。

图2是实施例1中用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针在dmf/hepes缓冲溶液(v/v＝1/90～99，ph＝7.4)体系中，探针溶液a的发射光谱图，激发波长为331nm。横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图3是实施例1中用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针在dmf/hepes缓冲溶液(v/v＝1/90～99，ph＝7.4)体系中，探针溶液a加入浓度为10.0μmol/l的al³⁺、zn²⁺、ag⁺、ca²⁺、mg²⁺、fe³⁺、hg²⁺、pb²⁺、na⁺、ba²⁺、ni²⁺、k⁺、cr³⁺、co²⁺、cd²⁺和cu²⁺离子后荧光光谱变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4实施例1中用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针在dmf/hepes缓冲溶液(v/v＝1/90～99，ph＝7.4)体系中，探针溶液a加入浓度为0.10μmol/l的ag⁺和1.0μmol/l的ag⁺后的荧光光谱变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图5实施例1中用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针在dmf/hepes缓冲溶液(v/v＝1/90～99，ph＝7.4)体系中，探针溶液a加入浓度为10.0μmol/l的ag⁺后，再加入浓度为10.0μmol/l的al³⁺、zn²⁺、ca²⁺、mg²⁺、fe³⁺、hg²⁺、pb²⁺、na⁺、ba²⁺、ni²⁺、k⁺、cr³⁺、co²⁺和cd²⁺其他离子的荧光光谱变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图6实施例1中用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针在dmf/hepes缓冲溶液(v/v＝1/90～99，ph＝7.4)体系中，探针溶液a检测ag⁺的标准曲线，横坐标为ag⁺浓度，纵坐标为荧光强度比值。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的结构式为：

具体实施方式二：具体实施方式一所述的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针合成方法如下：

将2-(3-氨基)苯基菲并咪唑和对苯二甲醛按照2.0～5.0:1的物质的量比加入到反应器中，再加入20.0～40.0ml的醇为反应溶剂，在40～100℃搅拌5～10h，反应结束后减压浓缩，得到粗产物。粗产物用有机溶剂重结晶，经抽滤、干燥后得到用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是上述方法中的醇类溶剂可以为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、己醇、苄醇等醇类溶剂。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是上述方法中的重结晶溶剂可以为乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙醚等低沸点溶剂中的任何一种，也可以为上述溶剂中的任何两种溶剂的混合物。其它与具体实施方式二或三相同。

用以下实例验证本发明的有益效果：

试验1：本试验的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的制备按如下方法进行：

将618mg(2.0mmol)的2-(3-氨基)苯基菲并咪唑和134mg(1.0mmol)的对苯二甲醛加入到反应器中，再加入20.0ml的甲醇为反应溶剂，在40℃下搅拌10h，反应结束后减压浓缩，得到粗产物。粗产物用乙酸乙酯重结晶，经抽滤、干燥后得到用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针。产率为91％。

本实施例制备的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的结构表征数据如下：

¹hnmr(dmso-d6,600mhz)δ:14.197(s,2h),8.940(s,2h),8.873(d,4h,j＝8.35hz)8.650(d,4h,j＝7.81hz),8.343(s,2h),8.307(d,2h,j＝7.69hz),8.227(s,4h),7.752(t,4h,j＝7.33hz)7.653(m,6h),7.461(d,2h,j＝7.62hz)；¹³cnmr(dmso-d6,150mhz),δ:174.37,161.26,152.29,139.05,130.48,130.38,129.73,128.08,127.54,125.61,124.63,124.37,122.54,119.26,40.54,40.41,40.28,40.14,40.00,49.86,39.72,39.58；ir(kbr)ν:3420,3069,1697,1625,1582,1515,1460,1427,1383,1300,1183,1041,973,883,829,794,753,724,691,648,594,535cm^–1。

从以上数据可以得到本实施例制备的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的结构式如下：

将本实施例制备的用于裸眼检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的使用方法以下步骤进行：

一、将上述的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针溶解于体积比为1:90～99的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepses)混合液中，得到探针溶液a。其中hepes缓冲溶液混合液的ph值为7.0～7.4，用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的浓度为10～20μmol/l；

二、向探针溶液a加入待测溶液，混合均匀，得到样品溶液b；

三、若样品溶液b的颜色从无色变为粉色，可判定待测溶液中含有ag⁺，即实现了采用双菲并咪唑荧光探针裸眼检测待测样品中的ag⁺。由图1可知，本实施例制备的用于荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针可判定待测溶液中含有ag⁺并且可以通过裸眼观察。

上述的用于荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的使用方法以下步骤进行：

一、将上述的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针溶解于体积比为1:90～99的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepses)混合液中，得到探针溶液a。其中hepes缓冲溶液混合液的ph值为7.0～7.4，用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的浓度为10～20μmol/l；

二、向探针溶液a加入待测溶液，混合均匀，得到样品溶液b；

三、用荧光分光光度计分别测试探针溶液a和样品溶液b的发射光谱。激发波长为331nm，发射波长为397nm，探针溶液a的发射强度为a1，样品溶液b的发射强度为b1。若32b1≥a1≥2b1，则可判定样品溶液中含有ag⁺。

探针溶液a的荧光发射光谱如图2所示，由图2可知，本实施例制备的用于荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的发射波长为397nm，发射强度为a1；探针溶液a加入浓度为10μmol/l的al³⁺、zn²⁺、ag⁺、ca²⁺、mg²⁺、fe³⁺、hg²⁺、pb²⁺、na⁺、ba²⁺、ni²⁺、k⁺、cr³⁺、co²⁺、cd²⁺和cu²⁺离子后荧光光谱如图3所示，由图3可知，探针溶液a加入ag⁺后的样品溶液发射强度为b1，此时，32b1≥a1≥2b1，可判定实施例制备的用于荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针可通过荧光检测ag⁺。探针溶液a加入其它金属离子是，荧光发射强度无明显变化。

图4为用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针在dmf/hepes缓冲溶液(v/v＝1/90～99，ph＝7.4)体系中，探针溶液加入不同浓度ag⁺后的荧光强度变化情况。探针溶液a加入浓度为0.10μmol/l的ag⁺时，样品溶液b的荧光强度b1＝1/2a1；探针溶液a加入浓度为1.0μmol/l的ag⁺时，样品溶液b的荧光强度b1＝1/32a1。说明探针溶液a加入微量ag⁺后即能出现明显的荧光淬灭现象。

探针溶液a加入浓度为10μmol/l的ag⁺后，再加入浓度为10μmol/l的al³⁺、zn²⁺、ca²⁺、mg²⁺、fe³⁺、hg²⁺、pb²⁺、na⁺、ba²⁺、ni²⁺、k⁺、cr³⁺、co²⁺和cd²⁺其他离子的荧光光谱变化情况如图5所示。由图5可知，常见的金属离子与ag⁺共存时，本实施例所制备的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针对ag⁺检测不受其它金属离子存在的干扰，其它金属离子共存时样品溶液b的荧光强度b1变化不大。

在上述结果的基础上，在ag⁺浓度0～1×10^-6mol/l范围内，本实施例制备的用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针在397nm处的荧光吸光度与ag⁺浓度变化的标准曲线见图6。根据检测限的计算公式(cdl＝3sb/m)，由空白平行实验，经过拟合得到线性回归方程y＝-0.4025x+0.4821，标准偏差r²＝0.9948，并通过计算得到络合常数ka＝1.05×10⁸mol/l，用于裸眼检测的双菲并咪唑-二甲醛银离子荧光分子探针的检测限达到0.0745μmol/l，低于who所规定的饮用水中ag⁺的最大含量(0.10ppm)。说明本实施例制备的具有良好的线性关系，并可用于检测饮用水中ag⁺浓度的标准。

试验2：本试验与试验1不同的是用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的制备用以下的操作代替：

将1236mg(4.0mmol)的2-(3-氨基)苯基菲并咪唑和134mg(1.0mmol)的对苯二甲醛加入到反应器中，再加入25.0ml的乙醇为反应溶剂，在78℃下搅拌6h，反应结束后减压浓缩，得到粗产物。粗产物用乙醚重结晶，经抽滤、干燥后得到用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针。产率为85％。

试验3：本试验与试验1不同的是用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的制备用以下的操作代替：

将773mg(2.5mmol)的2-(3-氨基)苯基菲并咪唑和134mg(1.0mmol)的对苯二甲醛加入到反应器中，再加入30.0ml的异丙醇为反应溶剂，在90℃下搅拌5h，反应结束后减压浓缩，得到粗产物。粗产物用乙酸乙酯-二氯甲烷混合物溶剂重结晶，经抽滤、干燥后得到用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针。产率为88％。

试验4：本试验与试验1不同的是用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的制备用以下的操作代替：

将1546mg(5.0mmol)的2-(3-氨基)苯基菲并咪唑和134mg(1.0mmol)的对苯二甲醛加入到反应器中，再加入40.0ml的苄醇为反应溶剂，在70℃下搅拌8h，反应结束后减压浓缩，得到粗产物。粗产物用丙酮重结晶，经抽滤、干燥后得到用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针。产率为65％。

试验5：本试验与试验1不同的是用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的制备用以下的操作代替：

将927mg(3.0mmol)的2-(3-氨基)苯基菲并咪唑和134mg(1.0mmol)的对苯二甲醛加入到反应器中，再加入30.0ml的丁醇为反应溶剂，在50℃下搅拌10h，反应结束后减压浓缩，得到粗产物。粗产物用丙酮重结晶，经抽滤、干燥后得到用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针。产率为73％。

试验6：本试验与试验1不同的是用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针的制备用以下的操作代替：

将618mg(2.0mmol)的2-(3-氨基)苯基菲并咪唑和134mg(1.0mmol)的对苯二甲醛加入到反应器中，再加入25.0ml的乙醇为反应溶剂，在80℃下搅拌7h，反应结束后减压浓缩，得到粗产物。粗产物用二氯甲烷和丙酮的混合溶剂重结晶，经抽滤、干燥后得到用于裸眼或荧光检测ag⁺的双菲并咪唑荧光探针。产率为80％。