养精种玉方剂的指纹图谱构建方法和检测方法与流程

本发明涉及中药制剂质量控制领域，特别是涉及养精种玉方剂的指纹图谱构建方法和检测方法。
背景技术：
：养精种玉汤是传统的中药方剂，来源于《傅青主女科》卷上，其处方为大熟地30克(九蒸)、当归15克(酒洗)、白芍15克(酒炒)、山萸肉15克(蒸熟)，主要用于肾亏血虚，身体瘦弱，久不受孕。目前市场上在售的养精种玉方的制剂有养精种玉煎膏和养精种玉颗粒，已有文献对养精种玉煎膏进行了指纹图谱和含量测定研究，对养精种玉颗粒进行了含量测定研究，但研究仅是分别建立了多批养精种玉煎膏的指纹图谱比较方法，并对煎膏和颗粒剂中的芍药苷和马钱苷两个成分的建立了含量测定。关于养精种玉方的制剂的检测，目前还没有统一的方法标准对汤剂、颗粒剂、煎膏进行全面测定。因此，亟待提供一种统一的方法对养精种玉汤剂、养精种玉颗粒剂、养精种玉煎膏等养精种玉方剂进行测定。技术实现要素：基于此，本发明的主要目的是提供一种养精种玉方剂的指纹图谱的构建方法。本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：一种养精种玉方剂的指纹图谱的构建方法，该构建方法包括如下步骤：供试品溶液制备：将养精种玉汤剂制备成冻干粉，将所述冻干粉溶于有机溶剂，过滤，得供试品溶液；对照品溶液制备：将阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷对照品溶于有机溶剂，得对照品溶液；指纹图谱的构建：吸取所述的供试品溶液、对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，得到具有共有特征峰的养精种玉方剂指纹图谱。在其中一些实施例中，所述测定采用的色谱条件包括：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.08％～0.12％的磷酸水溶液为流动相b；梯度洗脱方式：0min～25min，流动相a的体积百分数由5％变化至15％，流动相b的体积百分数由95％变化至85％；流动相由25min～40min，流动相a的体积百分数由15％变化至20％，流动相b的体积百分数由85％变化至80％；40min～60min，流动相a的体积百分数由20％变化至50％，流动相b的体积百分数由80％变化至50％。在其中一些实施例中，所述的流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min；所述的色谱柱的柱温为25℃～35℃；所述测定采用的检测波长为210nm～250nm。在其中一些实施例中，所述的有机溶剂为体积浓度为70％～100％的甲醇溶液。在其中一些实施例中，每25ml～50ml所述的有机溶剂中加入所述冻干粉0.5g～1g。在其中一些实施例中，所述冻干粉的制备包括：取熟地黄、酒当归、酒白芍、酒萸肉饮片，按重量比为2：1：1：1混合，用水浸泡30分钟；煎煮两次：第一次加水为饮片总重量的8倍，煎煮1小时，滤过，滤液备用；第二次加水为饮片总重量的8倍，煎煮1小时，滤过，滤液与第一次煎煮所得滤液合并，减压浓缩至投料量与浓缩液重量比为1：1～1：1.5的清膏后，加入占所述清膏重量为7％～15％的微粉硅胶，在-20℃到-45℃预冻，再在-80℃、＜100pa的条件下冻干成粉末，即得冻干粉。在其中一些实施例中，每1ml所述的对照溶液中含阿魏酸0.6μg～24μg、芍药苷2.1μg～84.2μg、莫诺苷2.0μg～80.6μg、马钱苷2.5μg～101.3μg。本发明的另一目的是提供一种养精种玉方剂的测定方法，该测定方法包括如下步骤：供试品溶液制备：将待测养精种玉方剂溶于有机溶剂，过滤，得供试品溶液；对照品溶液制备：将阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷对照品溶于有机溶剂，得对照品溶液；供试品溶液测定：吸取所述的供试品溶液、对照品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，得到待测养精种玉方剂的图谱；比较所述待测养精种玉方剂的图谱与杉树构建的指纹图谱中各峰的相对保留时间和/或各峰的峰面积，完成对待测养精种玉方剂的定性和/或定量测定。本发明所述的养精种玉方剂包括颗粒剂、浸膏、汤剂。在其中一些实施例中，所述测定采用的色谱条件包括：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.08％～0.12％的磷酸水溶液为流动相b；梯度洗脱方式：0min～25min，流动相a的体积百分数由5％变化至15％，流动相b的体积百分数由95％变化至85％；流动相由25min～40min，流动相a的体积百分数由15％变化至20％，流动相b的体积百分数由85％变化至80％；40min～60min，流动相a的体积百分数由20％变化至50％，流动相b的体积百分数由80％变化至50％。在其中一些实施例中，所述的流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min；所述的色谱柱的柱温为25℃～35℃；所述测定采用的检测波长为210nm～250nm。在其中一些实施例中，所述的有机溶剂为体积浓度为70％～100％的甲醇溶液。与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：发明人在长久经验积累的基础上以及大量实验后，挑选阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷作为参照品构建指纹图谱，不仅能够很好的表征养精种玉汤这一经典剂型的质量而且还能够表征其现代制剂养精种玉煎膏、养精种玉颗粒剂的质量。特别是，配合选用合适的色谱条件构建指纹图谱，不仅能够定性、定量表征养精种玉汤，而且还能定性、定量的表征养精种玉煎膏、养精种玉颗粒剂。以此指纹图谱构建的测定方法，不仅可使养精种玉汤标准汤剂定性、定量同步进行，关键是还能够同时适用于养精种玉汤现代制剂养精种玉煎膏、养精种玉颗粒剂的定性定量测试，很好的揭示养精种玉方的物质传递。并且该测定方法具有简便、稳定、精密度高及重现性好等特点。附图说明图1为实施例1中养精种玉标准汤剂的指纹图谱和含量(专属性试验)图谱；其中，峰6为莫诺苷，峰7为马钱苷，峰11为芍药苷，峰8为异绿原酸c，峰12为阿魏酸；图2为实施例1中9批养精种玉标准汤剂的指纹图谱和含量图谱；图3为实施例1中养精种玉标准汤剂的对照指纹图谱；图4为实施例1中9批养精种玉标准汤剂的相似度评价结果；图5为实施例1中精密度试验结果叠加图；图6为实施例1中重复性实验结果叠加图；图7为实施例1中中间精密度试验-不同人员结果叠加图；图8为实施例1中中间精密度试验-不同日期结果叠加图；图9为实施例1中中间精密度试验-不同仪器结果叠加图；图10为实施例1中稳定性试验结果叠加图；图11为实施例1中阿魏酸标准曲线；图12为实施例1中芍药苷标准曲线；图13为实施例1中莫诺苷标准曲线；图14为实施例1中马钱苷标准曲线；图15为实施例2的实验结果；图16为对比例1的图谱结果；图17为对比例2的图谱结果；图18为对比例3的图谱结果；图19为对比例4的图谱结果；图20为对比例5的图谱结果；图21为对比例6的图谱结果；图22为对比例7的图谱结果。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。实施例11.仪器与试药1.1仪器：电子天平mettlertoledoxp205dr(d＝0.01mg)、mettlertoledoms204s(d＝0.1mg)、高频数控超声波清洗器(kq-300td，昆山市超声仪器有限公司)simplicityuv纯水机(millipore)、高效液相色谱仪(agilent1260)、冷冻干燥机(德国christ,alpha2-4ldplus)、旋转蒸发仪n-1200a(eyela上海埃朗仪器有限公司)。1.2试剂：乙腈、磷酸为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。1.3试药：芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，110736-201539、110736-201741)、阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究院，110773-201313)、马钱苷对照品(中国食品药品检定研究院，111640-201005、111640-201707)、莫诺苷对照品(中国食品药品检定研究院，111998-201501、111998-201602)、熟地黄、酒白芍、酒当归、酒萸肉(湖北天济中药饮片有限公司、亳州市沪谯药业有限公司、广州康圣药业有限公司提供和安徽蜀中药业有限公司提供)、微粉硅胶(湖州展望药业有限公司)。2.方法与结果2.1标准汤剂的制备取熟地黄60g、酒当归30g、酒白芍30g、酒萸肉30g，共150g，将其用水浸泡30分钟，煎煮两次，第一次加水为总重量的8倍，煎煮1小时，200目筛滤过，滤液备用；第二次加水为总重量的8倍，煎煮1小时，200目筛滤过，滤液与第一次滤液合并，在50℃条件下减压浓缩，直至形成投料量：浓缩液质量为1：1～1：1.5的清膏后，加入8％的微粉硅胶，在-20到-45℃预冻，在-80℃、＜100pa的条件下冻干成粉末，即得标准汤剂冻干粉。以熟地黄、酒当归、酒白芍和酒萸肉中化学成分含量为四因素，每种中药饮片有3个批次，以这3个批次作为三个水平，进行l9(34)正交试验，得到9批冻干粉。饮片因素水平表见表1，正交设计试验表见表2。表1熟地黄、酒当归、酒白芍和酒萸肉饮片因素水平表表2正交设计试验表2.2色谱条件色谱柱：phenomenexc18(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，按表3中的规定进行梯度洗脱；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；检测波长：240nm；进样量：10μl。表3流动相梯度洗脱条件时间(min)乙腈(a)％0.1％磷酸(b)％0～255～1595～8525～4015～2085～8040～6020～5080～502.3供试品溶液的制备取标准汤剂冻干粉适量得到的粉末，研细，取约1g，精密称定，精密加入加70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％(体积百分比)的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。2.4混合对照品溶液的制备分别精密称定阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷对照品，混合后加70％(体积百分比)甲醇制成每1ml含阿魏酸12μg、芍药苷42.11μg、莫诺苷40.29μg、马钱苷50.64μg的混合溶液，即得混合对照品溶液。2.5测定法分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，高效液相色谱法测定，记录色谱图，即得养精种玉标准汤剂的指纹图谱和含量，见图1。图1中，9号峰、10号峰和11号峰归属于酒白芍，12号峰归属于酒当归，2号峰、6号峰、7号峰、8号峰和13号峰归属于酒萸肉，熟地黄中的成分含量极低无法指认。2.6对照指纹图谱的建立和相似度评价比较9批养精种玉汤标准汤剂，按共有峰出现率100％计，确定了14个共有峰，将9批养精种玉汤标准汤剂导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，生成对照指纹图谱，9批养精种玉汤标准汤剂相似度均在0.99以上。见图2、图3、图4。2.79批标准汤剂冻干粉中阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷含量测定每批标准汤剂样品平行制备两份，每份进两针按外标两点法计算标准汤剂中阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷等指标成分的含量(取平均值)，测定结果见表4。表49批标准汤剂中阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷的含量3.指纹图谱方法学考察3.1专属性试验为考察空白溶剂和辅料微粉硅胶是否有干扰，分别取供试品溶液、混合对照品溶液、空白溶剂(70％甲醇)、辅料微粉硅胶溶液，按“2.2色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，测定结果见图1。结果表明，辅料和空白溶剂均无干扰。3.2精密度试验取养精种玉标准汤剂样品1份，按“2.3供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取同一供试品溶液10μl，连续进样6次，按“2.2色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其相似度进行计算，其相似度测定结果见图5，表5。结果表明，相似度均在1.000，表明仪器精密度良好。表5精密度试验相似度评价表次数123456对照指纹图谱11.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00021.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00031.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00041.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00051.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00061.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0003.3重复性试验取养精种玉标准汤剂样品6份，按“2.3供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取同一供试品溶液10μl，按“2.2色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其相似度进行计算，其相似度测定结果见图6，表6。结果表明，相似度均在1.000，表明重复性良好。表6重复性试验相似度评价表份数重复性1重复性2重复性3重复性4重复性5重复性6对照指纹图谱重复性11.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000重复性21.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000重复性31.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000重复性41.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000重复性51.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000重复性61.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0003.4中间精密度取同一批养精种玉标准汤剂样品，按“2.3供试品溶液制备”项下方法制备，分别在不同时间由不同人员在不同仪器上，按“2.2色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其相似度进行计算，其相似度测定结果见图7、图8、图9，表7、表8、表9。结果表明，相似度均在0.999以上，表明中间精密度良好。表7不同人员相似度评价表不同人员刘陈对照指纹图谱刘1.0000.9991.000陈0.9991.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.000表8不同日期相似度评价表不同日期2017082320170803对照指纹图谱201708231.0000.9991.000201708030.9991.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.000表9不同仪器相似度评价表不同仪器watersagilent对照指纹图谱waters1.0000.9970.999agilent0.9971.0000.999对照指纹图谱0.9990.9991.0003.5稳定性试验取养精种玉标准汤剂样品1份，按“2.3供试品溶液制备”项下方法制备，分别于0，2，4，8，16，24，36，48，60，72h，按“2.2色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其相似度进行计算，其相似度测定结果见图10，表10。结果表明，相似度均在1.000，表明供试品溶液在72h内稳定性良好。表10稳定性相似度评价表4含量测定方法学考察4.1专属性试验同“3.1”项下测定，记录色谱图。结果表明，空白溶剂、辅料微粉硅胶溶液在与阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷相应的保留时间没有色谱峰。结果表明空白溶剂和辅料微粉硅胶对阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷的测定无干扰，以本法测定本品中阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷的含量具有专属性。4.2线性关系的考察分别精密称定阿魏酸、芍药苷、莫诺苷、马钱苷对照品，混合后加70％甲醇溶解，即得混合对照品溶液，每1ml所述混合对照中含阿魏酸12.00μg、芍药苷42.11μg、莫诺苷40.29μg、马钱苷50.64μg。分别精密吸取上述对照品溶液0.5μl、2μl、5μl、8μl、10μl、12μl、15μl，按“2.2色谱条件”项下方法测定，记录色谱图。以进样量(mg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见表11、表12、表13、表14，图11、图12、图13、图14。阿魏酸回归方程为y＝3,110.5432x+0.6280，r2＝0.9997；芍药苷回归方程为y＝1,104.5941x-3.7299，r2＝0.9999；莫诺苷回归方程为y＝1,669.1956x+2.2166，r2＝0.9998；马钱苷回归方程为y＝1,632.6540x+3.3200，r2＝0.9996。结果表明，阿魏酸在0.0060mg～0.1800mg、芍药苷在0.0211mg～0.6317mg、莫诺苷在0.0201mg～0.6044mg、马钱苷在0.0253mg～0.7596mg范围内线性良好。表11线性关系的考察结果-阿魏酸含量表12线性关系的考察结果-芍药苷含量表13线性关系的考察结果-莫诺苷含量表14线性关系的考察结果-马钱苷含量4.3精密度试验同“3.2”项下测定，记录色谱图，对峰面积进行计算，结果见表15、表16、表17、表18，结果各成分rsd<2％，表明仪器精密度良好。表15精密度试验结果-阿魏酸含量表16精密度试验结果-芍药苷含量表17精密度试验结果-莫诺苷含量表18精密度试验结果-马钱苷含量4.4重复性试验同“3.3”项下测定，记录色谱图，对峰面积进行计算，结果见表19，rsd<2％，说明本方法的重复性良好。表19重复性试验结果(n＝6)编号123456平均值rsd(％)阿魏酸含量(mg/g)0.1790.1840.1820.1860.1810.1830.1831.33芍药苷含量(mg/g)6.0556.1526.2426.3216.3526.2096.2221.76莫诺苷含量(mg/g)3.3073.3793.4163.4693.4733.3993.4071.82马钱苷含量(mg/g)1.6311.6651.811.7081.7131.6721.6781.804.5稳定性试验同“3.4”项下测定，记录色谱图，对峰面积进行计算，测定结果见表20。阿魏酸、芍药苷、莫诺苷和马钱苷的rsd分别为1.43％、0.69％、1.28％和0.81％，表明供试品溶液在72小时内稳定性良好。表20稳定性试验结果4.6准确度试验采用加样回收法，取本品粉末约0.26g，精密称定(共9份)，分置具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照品溶液1ml、2ml、3ml(各3份)，再分别精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表21、表22、表23、表24，阿魏酸、芍药苷、莫诺苷和马钱苷的平均回收率分别为103.74％，97.63％、101.04％、103.50％，rsd分别为3.48％、2.11％、2.01％、1.60％，表明本方法准确度良好。表21准确度试验结果-阿魏酸表22准确度试验结果-芍药苷表23准确度试验结果-莫诺苷表24准确度试验结果-马钱苷实施例2本实施例利用实施例1制备的指纹图谱对原料缺失的不合格养精种玉汤剂进行检测。参照实施例1的2.1的方法，制备不合格样品1(原料配方为熟地黄：酒当归：酒萸肉＝2：1：1)、不合格样品2(原料配方为熟地黄：酒白芍：酒萸肉＝2：1：1)、不合格样品3(原料配方为熟地黄：酒当归：酒白芍＝2：1：1)、不合格样品4(原料配方为酒当归：酒白芍：酒萸肉＝1：1：1)，并参照实施例1的2.3的方法制备不合格样品供试品溶液、参照实施例1的2.4的方法制备混合对照品溶液，然后参照实施例1的2.2的色谱条件及2.5的测定法进行检测。以上述实施例1指纹图谱对该上述不合格品进行检测，记录色谱图(见图15)并导入中药色谱相似度评价系统软件，与实施例1得到的对照图谱比较，计算相似度，结果如下表25所示。从结果可以看出，不合格品的相似度均小于0.9。表明实施例1指纹图谱可以作为养精种玉汤剂的质量控制和评价指标。表25实施例3本实施例利用实施例1制备的指纹图谱对养精种玉煎膏进行检测。供试品溶液的制备：取养精种玉煎膏约1g，精密称定，精密加入加70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％(体积百分比)的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。其余操作方法同实施例1。指纹图谱结果显示，其与对照指纹图谱相比较，14个共有峰均有出现，且相似度在0.95以上。结果表明，实施例1构建的指纹图谱还能够用于质控养精种玉煎膏。实施例4本实施例利用实施例1制备的指纹图谱对养精种玉颗粒剂进行检测。供试品溶液的制备：取养精种玉颗粒剂约1g，精密称定，精密加入加70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％(体积百分比)的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。其余操作方法同实施例1。指纹图谱结果显示，其与对照指纹图谱相比较，14个共有峰均有出现，且相似度在0.95以上，说明实施例1构建的指纹图谱还能够用于质控养精种玉颗粒剂。对比例1本对比例是实施例1的对比例，与实施例1相比，主要差别之处包括色谱条件不同。具体色谱条件如下：色谱柱：phenomenexc18(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，按下表中的规定进行等度洗脱(参见表26)；柱温：25℃；流速：1ml/min；检测波长：240nm；进样量：10μl。表26流动相等度洗脱条件时间(min)乙腈(a)％0.1％磷酸(b)％0～501387本对比例构建的指纹图谱结果见下图16，图中，1：莫诺苷；2：马钱苷；3：芍药苷；4：阿魏酸。结果显示，莫诺苷干扰峰较多，难以将其单独分开。对比例2本对比例是实施例1的对比例，与实施例1相比，主要差别之处包括色谱条件不同。具体色谱条件如下：色谱柱：phenomenexc18(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，按下表27中的规定进行梯度洗脱；柱温：25℃；流速：1ml/min；检测波长：240nm；进样量：10μl。本对比例构建的指纹图谱结果见图17，图中，1：莫诺苷；2：马钱苷；3：芍药苷；4：阿魏酸。结果显示莫诺苷干扰峰较多，难以将其单独分开。表27流动相梯度洗脱条件时间(min)乙腈(a)％0.1％磷酸(b)％0～1010～1290～8810～1512～1488～8615～3014～2086～8030～4020～3880～62对比例3本对比例是实施例1的对比例，与实施例1相比，主要差别之处包括色谱条件不同。具体色谱条件如下：色谱柱：phenomenexc18(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，按下表28中的规定进行梯度洗脱；柱温：25℃；流速：1ml/min；检测波长：240nm；进样量：10μl。本对比例构建的指纹图谱结果见18图，图中，1：莫诺苷；2：马钱苷；3：芍药苷；4：阿魏酸。结果显示莫诺苷干扰峰较多，难以将其单独分开。表28流动相梯度洗脱条件时间(min)乙腈(a)％0.1％磷酸(b)％0～2510～1490～8625～6014～2686～74对比例4本对比例是实施例1的对比例，与实施例1相比，主要差别之处包括色谱条件不同。具体色谱条件如下：色谱柱：phenomenexc18(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，按下表29中的规定进行梯度洗脱；柱温：25℃；流速：1ml/min；检测波长：240nm；进样量：10μl。本对比例构建的指纹图谱结果见图19，图中，1：莫诺苷；2：马钱苷；3：芍药苷；4：阿魏酸。结果显示莫诺苷干扰峰较多，难以将其单独分开。表29流动相梯度洗脱条件对比例5本对比例是实施例1的对比例，与实施例1相比，主要差别之处包括色谱条件不同。具体色谱条件如下：色谱柱：phenomenexc18(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，按下表30中的规定进行梯度洗脱；柱温：25℃；流速：1ml/min；检测波长：240nm；进样量：10μl。本对比例构建的指纹图谱结果见图20，图中，1：莫诺苷；2：马钱苷；3：芍药苷；4：阿魏酸。结果显示莫诺苷干扰峰较多，难以将其单独分开。表30流动相梯度洗脱条件时间(min)乙腈(a)％0.1％磷酸(b)％0～2510～1490～8625～4614～2786～7346～6027～8573～15对比例6本对比例是实施例1的对比例，与实施例1相比，主要差别之处包括采用的洗脱梯度不同。具体色谱条件如下：色谱柱：phenomenexc18(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，按下表31中的规定进行梯度洗脱；柱温：25℃；流速：0.8ml/min；检测波长：240nm；进样量：10μl。本对比例采用该色谱条件构建指纹图谱，并用于检测养精种玉方煎膏。本对比例构建的指纹图谱结果见图21，其中，1：莫诺苷；2：马钱苷；3：芍药苷；4：阿魏酸；5：毛蕊花糖苷。结果显示莫诺苷干扰峰较多，难以将其单独分开。同时，发明人发现，构建的指纹图谱与养精种玉方煎膏的图谱相似度差异较大，根本不能用于质控养精种玉方煎膏。表31、流动相梯度洗脱条件时间(min)乙腈(a)％0.1％磷酸(b)％0～2510～1490～8625～4614～2786～7346～5027～8073～20对比例7本对比例构建的指纹图谱本对比例是实施例1的对比例，与实施例1相比，主要差别之处包括采用的洗脱梯度不同。具体色谱条件如下：色谱柱：phenomenexc18(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，按下表32中的规定进行梯度洗脱；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；检测波长：240nm；进样量：10μl。本对比例采用该色谱条件构建指纹图谱，并用于检测养精种玉方颗粒剂。本对比例构建的指纹图谱结果见下图22，图中1：莫诺苷；2：马钱苷；3：芍药苷；4：阿魏酸。结果显示莫诺苷干扰峰较多，难以将其单独分开。同时，发明人发现，构建的指纹图谱与养精种玉方颗粒剂的图谱相似度差异较大，根本不能用于质控养精种玉方煎膏。表32流动相梯度洗脱条件时间(min)乙腈(a)％0.1％磷酸(b)％0～305～2595～7530～6025～8075～20以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12