一种基于金属有机骨架的智能型病毒分子印迹共振光传感器的制备及应用的制作方法

本发明属于分析化学检测技术领域，具体涉及一种基于金属有机骨架的智能型病毒分子印迹共振光传感器的制备及应用。

背景技术：

近些年来，分子印迹技术在病毒的检测领域得到了快速的发展，然而由于病毒分子的尺寸较大(通常在20～900nm之间)[shawkys.m.,awada.m.,allamw.,alkordim.h.,el-khamisys.f.,biosens.bioelectron.,2017,92:349-356.]，该技术在病毒检测领域的应用受到了很大的限制。之后，表面分子印迹技术的提出，为这一难题的突破提供了有力的手段。尽管如此，目前这一技术在病毒检测方面的应用仍存在一些不足，亟待解决。

(1)现有分子印迹技术所采用的载体材料主要有二氧化硅微球，磁性纳米粒子等[cumboa.,lorberb.,corvinif.x.,meierw.,&shahgaldianp.,nat.commun.,2013,4,1503；hek.,chenc.,liangc.,liuc.,yangb.,chenx.,caic.sens.actuatorsb,2016,233,607-614]，所制备的印迹聚合物对病毒分子的吸附量和识别位点都较少。金属有机骨架(mofs)材料是由金属离子和有机配体自组装而成的一种新型多孔材料，相比较而言，它具有密度低、比表面积大、空腔结构均匀、热稳定性良好、表面易于修饰等特点[zhangw.,lug.,cuic.,liuy.,lug.,yanw.,xingc.,chiy.r.,yangy.,huof.,adv.mater.,2014,26,4056-4060]，是一种理想的分子印迹载体材料。特别是近年来一种具有良好的水热稳定性的新材料materialinstitutlavoisier-101(mil-101)的出现，更是推动了mofs材料在多个领域的应用发展[féreyg.,mellot-draznieksc.,serrec.,millangef.,dutourj.,surblés.,margiolakii.,science，2005，309,2040-2042]。迄今为止，以mofs材料为印迹载体，构建病毒分子印迹传感器的报道尚未见到。

(2)现有的分子印迹技术，其模板病毒分子的洗脱与重新结合较为困难和复杂。这一难题可采用智能型分子印迹聚合物来解决。智能型分子印迹聚合物通常采用智能型聚合物作为印迹层材料，这使得其不仅对目标分子具有专一性识别能力，而且对特定刺激的响应敏感，因而可通过控制外部环境的变化来实现对目标分子的选择性可逆捕获或释放，从而实现对模板分子的快速与简便洗脱。

共振光散射(rls)技术自出现以来便成为了一种重要的分析手段[pasternackr.f.,collingsp.j.,science,1995,269,935-939；pasternackr.f.,bustamantec.,collingsp.j.,giannettoa.,gibbse.j.,j.am.chem.soc.,1993,115,5393-5399.]，其具有灵敏度高、快速、简便等特点(使用普通的荧光分光光度计)，已广泛应用于多种小分子和生物大分子的分析检测。病毒分子印迹共振光传感器，兼具rls技术的简便、高灵敏度等特点，又具有分子印迹技术的良好选择性等优越性能，是一种理想、高性能的生物传感器。

因此，采用mofs材料为印迹载体，智能型水凝胶为印迹层材料制备的病毒分子印迹共振光传感器，不仅具有mofs材料比表面积大的优点，可为病毒的印迹提供更多的识别位点，而且具有智能响应的特点，可更方便、更高效的实现病毒大分子的吸附与洗脱。该技术的发展，对于病毒的特异性识别与高灵敏度定量检测具有重要的理论意义和实际应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于金属有机骨架的智能型病毒分子印迹共振光传感器的制备方法，并将所述分子印迹共振光传感器应用于病毒分子的特异性识别与检测。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种基于金属有机骨架的智能型病毒分子印迹共振光传感器的制备及应用，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：

(1)基于金属有机骨架的智能型病毒分子印迹聚合物的制备：在mil-101表面接枝氨基，再加入模板分子病毒，使其与氨基键合。随后，再加入功能单体、ph敏感单体、交联剂及引发剂等进行聚合。待反应完成，用甲醇与乙酸的混合液(洗脱剂)除去病毒，得到与模板分子相匹配且具有特异性结合位点的印迹聚合物。

(2)基于金属有机骨架的智能型病毒分子印迹共振光传感器的制备及应用：取适量上述的印迹聚合物于缓冲溶液中，加入适量的病毒，在最佳的吸附条件下震荡吸附。取1ml混合物于1ml比色皿中，采用rf-5301pc荧光分光光度计测其共振光散射强度，构建一种新型的用于检测病毒的分子印迹共振光传感器。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)首次将金属有机骨架材料作为病毒分子印迹的载体材料。金属有机骨架材料比表面积大，可提供更多的结合位点；且其热稳定性能良好，表面易于修饰，更有利于保存和长期使用。

(2)使用ph敏感聚合物为印迹层材料，通过调节ph可方便、高效的实现模板分子的洗脱与重新结合。

(3)实验结果表明，所述病毒分子共振光印迹传感器对目标分子具有良好的选择性，且具有较宽的线性范围，检测限达到了0.1pm；所述印迹聚合物可回收与循环使用。

(4)所述病毒分子印迹聚合物制备成本低廉；所述分子印迹共振光传感器的构建过程简单，且检测过程操作简单，对操作人员的专业要求不高，因此具有重要的应用前景。

附图说明

[图1]所述病毒分子印迹共振光传感器的构建流程图。

[图2]所述病毒分子印迹共振光传感器用于病毒检测的可行性验证。

[图3]病毒分子印迹共振光传感器的ph敏感性能验证。

[图4]病毒分子印迹共振光传感器的热重分析图。

[图5]病毒分子印迹共振光传感器的氮气吸附解吸图。

[图6]mil-101(a),分子印迹传感器(b),非印迹传感器(c),hav(d)的红外谱图。

[图7]mil-101(a),分子印迹传感器的xrd谱图(b)。

[图8]mil-101(图a,b)和分子印迹传感器(图c,d),非印迹传感器(图e,f)颗粒的sem谱图。

[图9]病毒分子印迹共振光传感器对不同浓度hav的响应图。

[图10]病毒分子印迹共振光传感器对不同病毒的选择性吸附与检测图。

[图11]病毒分子印迹共振光传感器用于加标回收hav。

具体实施方案

在此，将结合附图及实施例，对本发明的具体实施方案作进一步的详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的应用范围及扩展。

实施例1：一种基于金属有机骨架的智能型病毒分子印迹共振光传感器的制备方法

(1)金属有机骨架mil-101的制备：将cr(no3)3·9h2o(2.00g)，对苯二甲酸(tpa，0.82g)加入到25ml浓度为0.05mol/l的乙酸钠水溶液中，磁力搅拌30min后，将溶液转移至50.0ml的聚四氟乙烯反应釜，然后将反应釜密封并置于200℃的恒温鼓风干燥炉中。12h后，取出反应釜，待冷却至室温后将样品用超纯水充分洗涤并过滤，然后于50℃的恒温干燥箱中干燥5h，即可得到深绿色晶体mil-101。之后，在塑料离心管中加入0.2gmil-101，并加入10ml无水乙醇，将整个体系密封并置于60℃水浴中，3h后加入15ml浓度为30mm的nh4f并继续在60℃的水浴中加热3h。反应完成后将产物进行超声和离心洗涤，再以6000rpm的转速离心15min，弃去上清液。最后，将产物在30℃的恒温下干燥12h以备后用。

(2)mil-101@mips粒子的制备：将hav(2ml，0.2μm)，thf(3ml)和0.02g事先制备的mil-101、0.9mlaptes加入到25ml圆底烧瓶中，超声溶解后，在氮气保护下搅拌60min。之后加入15mgmba，60μldma和5mgaps继续搅拌0.5h后，将预聚合的产物密封，然后在60℃的油浴中搅拌24h。反应完成后，用甲醇/乙酸(9：1，v/v)和超纯水反复洗涤多次，直到上清液中检测不到模板分子，便得到hav印迹的mil-101@mips粒子。

(3)所述病毒分子印迹共振光传感器(mil-101@mips传感器)的制备：取适量上述的印迹聚合物mil-101@mips于缓冲溶液中，加入适量的病毒，在优化的吸附条件下震荡吸附。取1ml混合物于1ml比色皿中，采用rf-5301pc荧光分光光度计进行同步扫描，扫描范围为220.0～700.0nm，激发和发射的狭缝宽分别为1.5nm和3.0nm，并记录在470nm处的共振光强度，构建成一种检测病毒的分子印迹共振光传感器。

实施例2：所述mil-101@mips共振光传感器检测病毒的可行性验证

为了验证本发明的可实施性，本实施例对所述传感器的构建原理进行了验证。如图2所示，470nm处的共振光强度大小比较为：hav+mil-101@mips>mil-101@mips>mil-101>hav。这说明本发明所述的mil-101@mips传感器能很好地吸附hav粒子，从而引起整个传感器的粒径变化，使得共振光散射强度显著增强。

实施例3：所述mil-101@mips共振光传感器及中间产物的性能、形貌和结构表征。

为了验证mil-101@mips传感器的ph响应性能，我们研究了不同ph值对mil-101@mips颗粒溶胀速率的影响(图3)：当溶液的ph值从9.0降低到2.0时，sr值缓慢增加，这是由于形成印迹层的试剂属于阳离子型，当ph降低时，聚合物变得更亲水，从而导致聚合物层膨胀。

采用热重实验以评估用来构建mil-101@mips共振光传感器的热稳定性(图4)。如图4所示，当温度为50～100℃时，印迹聚合物的重量减少了20.01％，明显地，这是其结构中水分子的消失导致的。而在300～400℃范围内的重量损失对应于mofs结构的分解。所有这些现象表明合成的具有良好的热稳定性，可用于相关研究。采用氮气吸附-脱附等温线实验测定其吸附表面积(图5)，可计算出所述分子印迹传感器的吸附表面积约为900.7765m²/g。

利用傅里叶变换红外光谱仪、x-射线衍射仪、扫描电镜对制备的所有材料进行了结构和形貌的表征。图6为各种材料的红外谱图，(a)、(b)、(c)、(d)分别对应mil-101载体材料、印迹传感器、非印迹传感器、hav。745cm^-1附近的峰为cr-o的特征峰，1100cm^-1附近和1600～700cm^-1之间的峰分别归属于o-c-o和c＝c。3300cm^-1附近为-nh2的特征峰。1550cm^-1、1457cm^-1分别为芳香族c-h弯曲振动峰和n-h的剪切振动峰。1016cm^-1附近的吸收峰为o-si-o的对称伸缩振动吸收峰、745cm^-1处的弱吸收峰为o-si-o的反对称伸缩振动吸收峰。2930cm^-1附近为烷烃的c-h伸缩振动吸收峰。图7为x-射线衍射图，从图中可以看出，mil-101主要的特征峰都出现在2θ2°～20°之间，且印迹后峰的强度大幅度减弱。图8为mil-101(图a,b)，印迹传感器(图c,d)和非印迹传感器(图e,f)的扫描电镜图。从图a,b可以看出，mil-101颗粒的分散性较好且表面光滑，平均尺寸范围为100～200nm。图c,d表明，印迹后，粒子主要呈现八面体形态，粒子的尺寸范围为200～300nm。因此，印迹层厚度至少为50nm。另外，相比mil-101粒子，印迹粒子和非印迹粒子的分散性都相对较差，这是在其表面进行聚合之后粒子发生团聚造成的。这些结果均可表明，我们成功制备了所述的病毒分子印迹传感器。

实施例4：mil-101@mips共振光传感器的应用

本实施例的实验条件为：mil-101@mips的用量为100ng/ml，ph为8.0，吸附时间为20min,温度为室温，所用缓冲溶液为pb缓冲液。具体实施方案为：取特定浓度的hav和100ng/ml的mil-101@mips于pb缓冲液，将整个体系的ph调节为8.0。在此条件下，振荡20min后，测其共振光强度irls。

(1)mil-101@mips共振光传感器对不同浓度hav的分析

按上述实验步骤，以本发明所述的mil-101@mips传感器对不同浓度的hav进行检测分析，结果如图9所示，所制备的传感器对hav的分析浓度范围为0.02～2nm，检测限为0.1pm，结果显示线性范围较宽，检测限较低，总体效果良好。

(2)mil-101@mips共振光传感器对hav的选择性吸附

本实施例选择了浓度均为1.0nm的hav，jev，rv和lv作为目标物来考察mil-101@mips对hav的吸附与检测能力。实验按上述步骤进行，重复三次，取平均值，计算δirls＝irls–i0(i0为没有hav时的共振光强度)。实验结果如图10所示。可以看出，本发明所述的mil-101@mips传感器对hav的吸附能力明显优于对其它病毒的吸附能力，说明其选择性较好。

(3)mil-101@mips共振光传感器对hav的加标回收

采用了加标回收的方法来评估前面所述的方法对实际样品的分析能力。将从湘潭大学医院采集的人血清样品(保存在4℃下)用磷酸盐缓冲溶液(20mm，ph＝8)稀释至1000倍，分别向其中加入浓度为0.1nm，0.6nm，1.3nm的hav，用本发明制备的mil-101@mips共振光传感器进行检测。实验结果如图11所示，加标回收率为90％～106.7％之间。