基于上转换纳米材料的多焦点结构光照明显微成像装置的制作方法

本实用新型属于光学显微成像技术领域，具体涉及一种基于上转换纳米材料的多焦点结构光照明显微成像装置。

背景技术：

图像扫描显微镜(ISM)通过使用阵列探测器探测荧光信号，在后期图像处理中采用数字针孔达到进一步抑制离焦信号、缩小点扩散函数进而提高成像分辨率的目的，与共焦显微镜采用物理针孔相比，既起到了缩小点扩散函数的作用同时又不牺牲信噪比，成像质量与之相比有显著提升。但是ISM的缺点也十分明显，使用阵列探测器采集信号，数据量大，成像速度太慢，不利于观察细胞活动过程。

基于DMD(数字微镜器件)的多焦点结构光显微成像技术(MSIM)，通过使用DMD调制出阵列的、多焦点结构光照明光场激发样品，后期加入数字针孔，与ISM相比，大大减少了成像的时间，为活体组织成像提供了可能。MSIM还具有优异的光学切片的能力，可实现三维成像。另外，多焦点结构光显微成像技术可得到媲美共聚焦成像的分辨率，后期通过反卷积算法，还能进一步提高成像分辨率到宽场荧光成像的2倍。采用DMD调制来实现多焦点光场的扫描，能够很方便地结合到宽场照明显微镜中；成本低、速度更快的非机械扫描设计，使得基于DMD的MSIM更加经济实用。但是，由于DMD的衍射效率较低，形成的多焦点光场强度较弱，基于DMD的MSIM只能应用到激发效率高的单光子激发的荧光成像。要实现的近红外激发普通染料的多光子成像，目前只能采用微透镜阵列聚焦近红外飞秒激光形成较强的多焦点光场，结合振镜扫描装置的复杂系统来实现。高昂的系统成本使这种方案没能广泛应用。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于上转换纳米材料的多焦点结构光照明显微成像装置，该装置根据上转换纳米材料的特性，利用近红外连续波激光器作为激发光源，采用DMD作为产生多焦点光场和实现扫描的装置，具有成本低，易实现的优点。

本实用新型的目的通过以下的技术方案实现：基于上转换纳米材料的多焦点结构光照明显微成像装置，包括激发光生成模块、多焦点图案发生模块、透镜组、图像采集模块及计算机，激发光生成模块用于生成用作激发光的近红外波长连续激光束，该激光束通过多焦点图案发生模块生成阵列的多焦点图案，再经过透镜组缩放，聚焦在载物台上标记了稀土掺杂上转换纳米材料的样品上，图像采集模块采集上述样品被近红外波长连续激光束激发的上转换过程荧光图像，图像采集模块与多焦点图案发生模块分别与计算机相连。

优选的，所述激发光生成模块包括近红外连续波激光器、半波片、偏振分束器，近红外连续波激光器发射的近红外波长连续激光束经过半波片改变光束的偏振方向，然后经过偏振分束器后成为一束线偏振光。

更进一步的，在偏振分束器和多焦点图案发生模块之间还设有一用于确定是否让偏振光通过的开关，该开关的开启和关闭均由计算机控制。通过设置该开关，可便于自动控制图像的采集。

优选的，所述多焦点图案发生模块包括数字微镜器件，数字微镜器件上每个镜片的开关均由计算机分别控制，用于生成多阵列、点分布的结构光图案。通过计算机控制数字微镜器件的图案，可使图案产生平移，完成样品的二维扫描成像。

更进一步的，所述数字微镜器件上每个镜片均可独立向正负方向12°翻转，在样品面上形成阵列的、间距可调的、多焦点照明图案，晶格点成近似等边三角形分布。从而可减少不同焦点之间信号的串扰。

优选的，所述透镜组与从多焦点图案发生模块发出的调制光共轴放置，包括沿光路依次设置的第一透镜、第二透镜、第三透镜、二向色镜和第四透镜，第一透镜、第二透镜组成4f系统，第三透镜进行缩放，二向色镜为高反低透的二向色镜，第四透镜设置在显微镜中物镜的前方，激光经第四透镜、物镜后聚焦在样品上。上述的高反低透二向色镜反射波长大于上转换荧光的波长，透过波长小于近红外激发光波长。

更进一步的，图像采集模块和样品之间的光路上还设有荧光滤光片和镜筒透镜，激光激发样品标记的上转换纳米材料发生上转换过程产生荧光，荧光信号依次经过显微镜内的物镜、第四透镜，再依次经过二向色镜、荧光滤光片和镜筒透镜，最后进入图像采集模块。

优选的，所述图像采集模块采用EMCCD相机。

优选的，所述上转换纳米材料采用稀土掺杂的纳米晶颗粒，纳米晶体用氟化物或氧化物，在其中掺杂一种或多种镧系稀土元素离子。这种颗粒可应用于细胞、组织的结构标记，在低功率近红外波长连续波激光激发下即可产生高效上转换荧光发射。

优选的，所述载物台在垂直于成像面方向的位置可调。便于将激光聚焦到样品的不同平面，进行三维成像。

本实用新型与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、本实用新型在现有基于DMD的多焦点结构光照明显微成像装置的基础上，利用上转换材料无光漂白、无光闪烁等光学特性，搭建一新的显微成像装置，可以解决ISM成像速度慢、共聚焦显微镜和传统多光子激发系统成本昂贵的问题。

2、本实用新型中所使用的激发光为近红外连续光，具有穿透深度大，光损伤小，光散射小，不会激发细胞的自发荧光等优点。

附图说明

图1为本发明的基本结构示意图。

图2为实施例中所述DMD点阵分布图。

图3为实施例中所述DMD部分晶格点图及扫描移动过程示意图。

图4为实施例中采集多焦点图像得到高分辨成像的流程示意图。

图5实为施例中合成的NaYF4:Nd³⁺/Yb³⁺/Er³⁺@NaYF4:Nd³⁺纳米颗粒电镜图。

图6为实施例中合成的NaYF4:Nd³⁺/Yb³⁺/Er³⁺@NaYF4:Nd³⁺纳米颗粒发光机制能级图。

图7为实施例中激光器激发下的NaYF4:Nd³⁺/Yb³⁺/Er³⁺@NaYF4:Nd³⁺纳米颗粒发光光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本实用新型作进一步详细的描述，但本实用新型的实施方式不限于此。

实施例

本实施例基于上转换纳米材料的多焦点结构光照明显微成像装置如图1所示，其中1为近红外连续波激光器，2为第一平面镜，3为半波片，4为偏振分束器，5为第二平面镜，6为开关，7为第三平面镜，8为数字微镜器件(DMD)，9为第一透镜、10为第二透镜、11为第三透镜、12为二向色镜，13为第四透镜，14为物镜，15为样品，16为荧光滤光片，17为镜筒透镜，18为EMCCD相机，19为计算机。

本实例所述的超分辨显微成像装置按照实现的功能分为以下几个部分：激发光生成模块、多焦点图案发生模块、透镜组、图像采集模块及计算机，下面结合附图，对各个部分的机构和功能进行具体的说明。

激发光生成模块用于生成近红外波长的连续激光，包括近红外连续波激光器1、半波片3、偏振分束器4、第一平面镜2、第二平面镜5、第三平面镜7、开关6。连续激光器1用于发出近红外波长的连续激光，半波片3用于改变光束的偏振方向，配合偏振分束器4用于产生一束线偏振光并且调节光强，所述开关6与外部计算机19连接，用于控制是否偏振光的通过，三个平面镜2、5、7用于改变光束行进方向。

多焦点图案发生模块，采用数字微镜器件(DMD)8，用于生成多阵列、点分布的结构光图案，数字微镜器件是通过FPGA进行硬件控制其中的每个镜片独立向正负方向12°翻转以达到切换数字透镜阵列，在样品面上形成阵列的、间距可调的、多焦点照明图案，为了减少不同焦点之间信号的串扰，晶格点设计为近似等边三角形的分布，透镜组9、10、11与从数字微镜器件8发出的调制光共轴放置，经过透镜组9、10、11的缩放，形成大小合适的照明区域。

透镜组，与从多焦点图案发生模块发出的调制光共轴放置，包括沿光路依次设置的第一透镜9、第二透镜10、第三透镜11、二向色镜12和第四透镜13，第一透镜、第二透镜组成4f系统，第三透镜进行缩放，二向色镜为高反低透的二向色镜，第四透镜设置在显微镜中物镜的前方，激光经第四透镜、物镜后聚焦在样品上。上述的高反低透二向色镜反射波长大于上转换荧光的波长，透过波长小于近红外激发光波长。

本实施例中图像采集模块采用EMCCD相机。图像采集模块和样品之间的光路上还设有荧光滤光片16和镜筒透镜17，二向色镜12、荧光滤光片16、镜筒透镜17和EMCCD相机18设置在沿耦合激光束前进方向的反方向上。稀土材料掺杂上转换纳米材料标记的样品15在结构光激发下发射沿各个方向上的上转换荧光，一部分荧光信号被物镜14收集，依次经过高反低透二向色镜12、荧光滤光片16、镜筒透镜17后由EMCCD相机18接收，所述EMCCD相机18与外部计算机19连接。所述高反低透二向色镜反射波长大于上转换荧光的波长，透过波长小于于近红外激发光波长。

本实施例通过控制数字微镜器件8上每个镜片的开关，形成阵列的、多焦点的照明模式，如图2所示，虚线框内的三个像素点呈三角形排列，每个亮点占DMD上2×2个微镜像素点，且点阵间距为横向28像素点，纵向16个像素(图2)，可减小不同焦点信号之间的串扰。如图3所示，再控制DMD图像的平移，使聚焦在样品面上的多焦点图样每次平移一个像素点的距离，通过将EMCCD相机与DMD图案切换进行同步，先后采集224张多焦点图像，即可完成整个成像区域的扫描。得到一系列多焦点荧光图像之后，如图4所示，通过一系列数字针孔滤波去除离焦荧光信号，再通过缩放、加和得到完整的高分辨荧光图像，再通过反卷积算法，进一步提高成像分辨率。

不同于共聚焦扫描显微方式，MSIM成像采用多点扫描方式，即利用经过DMD调制的阵列的结构光进行扫描成像，进一步提高成像速度。相较于普通宽场荧光成像，MSIM成像使用数字针孔处理，具有层析能力，通过改变样品台纵向位移对样品不同焦平面进行二维扫描，最终可得到三维图像。

本发明中上转换纳米材料可采用稀土掺杂的纳米晶颗粒，纳米晶体用氟化物或氧化物，在其中掺杂一种或多种镧系稀土元素离子。本实施例中以下面材料为例，稀土掺杂上转换纳米材料：NaYF4:Nd³⁺/Yb³⁺/Er³⁺@NaYF4:Nd³⁺，该材料可以在808nm近红外激光激发下实现多焦点成像。

合成的NaYF4:Nd³⁺/Yb³⁺/Er³⁺@NaYF4:Nd³⁺纳米颗粒电镜图如图5所示。此上转换发光过程中，Nd³⁺和Yb³⁺作为敏化剂离子。Er³⁺因具有的丰富的能级而作为发光中心掺杂进基质，称为激活剂。外层Nd³⁺经808nm的激光激发至亚稳态，处于激发态的离子会将能量传递至内层Nd^3+,自身产生无辐射跃迁，回到基态。内层Nd³⁺接收到激光照射能量同样跃迁至4f激发态,并接收外层Nd³⁺离子传递的能量，此时粒子不稳定，将进一步将能量传递至Yb³⁺并伴随自身无辐射跃迁回基态。作为敏化剂的Yb³⁺离子最终将获得的能量传递给激活剂Er³⁺,Yb³⁺离子能将吸收的红外光子能量有效地传递给激活剂，使离子之间的交叉弛豫效率很高，从而使上转换发光效率得到显著提高。能量经多次传递，加和，使得发射光的波长小于激发光的波长，即反stokes反光。该过程具体能级间跃迁示意图如图6。在该上转换发光过程中Er³⁺离子所产生的各波段范围的发光强度如图7光谱图所示，荧光发射主要为波长550nm附近的绿光和650nm附近的红光。由于稀土离子4f激发态的平均寿命一般较长，因此稀土离子掺杂的上转换发光材料是高效的发光材料。

本实施例所述装置的工作方法如下：

近红外连续波激光器1发出一束稳定的近红外波长激光，激光经过半波片3和偏振分束器4调节光强成为一束线偏振光，经过第二平面镜5、计算机19控制的开关6、第三平面镜7，再经过DMD8的调制成为阵列的、多焦点的结构光，再经过由第一透镜9、第二透镜10组成的4f系统和第三透镜11的缩放，经过二向色镜12进入显微镜，经过第四透镜13、物镜14聚焦到样品15上。

激光激发上转换纳米材料发生上转换过程产生荧光，荧光信号经过显微镜内的物镜14、第四透镜13，经过二向色镜12，再经过荧光滤光片16，经过镜筒透镜17进入EMCCD相机18。

上述实施例为本实用新型较佳的实施方式，但本实用新型的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本实用新型的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本实用新型的保护范围之内。