光纤免疫传感器及用于免疫性疾病检测的检测装置的制作方法

本实用新型属于免疫疾病检测技术领域，更具体地说，是涉及光纤免疫传感器及用于免疫性疾病检测的检测装置。

背景技术：

肿瘤的早期诊断是挽救患者生命的关键。

现有的肿瘤诊断技术中，除临床征象及影像学手段外，肿瘤标志物检测法日益被人们重视。肿瘤标志物是由肿瘤微环境基质细胞及肿瘤细胞分泌的化学物质，存在于细胞、组织、体液中，可通过化学或免疫反应的方法进行定量检测。通常，肿瘤生长越旺盛，肿瘤标志物浓度水平越高；反之，当肿瘤生长被压制时，其浓度表达减少。检测肿瘤标志物能比CT、MRI等影像学手段更早地发现肿瘤病灶，是早期诊断不可或缺的方法。

然而，通过检测单项标志物进行早期肿瘤诊断还存在以下弱点：其一，某些肿瘤血清标志物在早期的浓度并无大变化，到中晚期才有明显升高；其二，标志物浓度升高与肿瘤的必然相关性存在局限，其升高并不一定代表癌症的发生或复发；其三，一项肿瘤标志物的升高会发生在多种肿瘤疾病中，还需要进一步进行针对性的检查。肿瘤早期诊断为标志物检测提出了新的要求：其一，选择灵敏度、特异性更高的肿瘤标志物，即该标志物在某种肿瘤早期就有明显的上调表达；其二，不断完善检测手段，提高传感器灵敏度、准确性、检测极限，并能够灵活地对血清标志物进行实时、动态的监测。

间皮素(mesothelin)是存在于腹膜、胸膜和心包体腔间皮衬里细胞表面上的糖蛋白，是早期胰腺癌患者血液和尿液中常有的一种生物指标。此外，间皮素在若干种肿瘤中有表达，例如，间皮素表达于所有卵巢癌的约占70％、乳头状浆液性腺癌的约占82％、所有胰腺癌的约占83％和所有胰腺导管腺癌的约占86％。间皮素成为胰腺癌等恶性肿瘤检测的高特异性新型标志物。

无危害、无需标记的免疫生物传感技术是国际上逐渐发展起来的新检测技术，表面等离子体共振(SPR：Surface Plasmon Resonance)生物传感器就是其中之一。无需标记的SPR传感器的优越性在于：其一，检测方法简单，无需对待测物进行标记，省时省力，可无损地对免疫反应进行实时、动态的监测；其二，检测信号直接来自免疫反应，实时记录反应的结合与解析过程，有助于研究抗体-抗原分子间的相互作用，为动态研究复杂反应机理提供新的可能。但现有的表面等离子体共振(SPR)检测设备，如通用电气公司BIAcore系列SPR检测设备，以光学棱镜(而非光纤)为光耦合介质，体积庞大、造价昂贵，其推广应用受到限制。

光纤传感技术为小型化、高灵敏度、实时的快速检测应用提供了一种有效途径。光纤传感以光为检测信号，以光纤为传输介质，利用传输光的振幅、波长、偏振态等参量受外界变量的影响，实现对外界因素的实时探测，具有高灵敏度、快速、抗电磁干扰力强、可进行远程监测等显著优点。结合光纤传感技术与表面等离子体共振检测技术的优势，研制出轻巧、柔韧、高灵敏度、响应迅速的光纤SPR传感器，是实现无标记、无损害、实时动态检测的优选方案，并可进一步适用于远程监测。

2014年，美国人Jack Andraka发明了一种检测间皮素的“癌症试纸”(WO2013172866A2)用于胰腺癌的早期筛查，其灵敏度、响应速度相对于现有的常规肿瘤检测技术显著提高。该“癌症试纸”将间皮素抗体通过碳纳米管固定在滤纸上，当间皮素抗原与其抗体结合发生特异性免疫反应，碳纳米管的导电率将发生改变，通过检测电信号即可间接反应间皮素浓度的变化；但该测癌试纸的导电性可能受其它非检测对象的因素影响，从而影响真实间皮素测试的准确性。

申请号为CN201610309318的发明专利申请，将CA19-9抗体与间皮素抗体通过胶体金等颗粒进行显色标记并固定在试纸上，制作出检测CA19-9与间皮素的双联检测试剂盒，用于胰腺癌的快速筛查。该方法操作简便、敏感度高、特异性强，能提供快速的定性检测，但无法准确定量测量标志物浓度。

然而，利用光纤传感技术与表面等离子体共振传感技术结合，用来实现间皮素等肿瘤标志物的免疫检测技术尚未见报道。现有检测肿瘤标志物的免疫生物传感技术无法实时检测、无法联网、无法进行远程监测，无法面向物联网应用中万物互连、实时监测的需求。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种光纤免疫传感器，以解决现有技术中存在的不能实时、准确检测肿瘤标志物的技术问题。

为实现上述目的，本实用新型采用的技术方案是：光纤免疫传感器，包括光纤、激发金属膜、单克隆抗体层和用于将所述单克隆抗体层组装于所述激发金属膜上的分子自组装层；

所述光纤的侧边设有凹槽，所述凹槽的底壁邻近所述光纤的纤芯；

所述激发金属膜沉积于所述凹槽的底壁上；

所述分子自组装层自组装于所述激发金属膜上；

所述单克隆抗体层涂于经活化处理后的所述分子自组装层上。

进一步地，所述凹槽的底壁到所述光纤的纤芯距离为1～2μm。

进一步地，所述激发金属膜为金膜或银膜，所述激发金属膜的厚度为40～50μm。

进一步地，所述分子自组装层为石墨烯纳米膜层或氧化石墨烯纳米膜层。

进一步地，还包括第一连接层，所述第一连接层沉积于所述凹槽的底壁上，所述激发金属膜沉积于所述第一连接层上。

进一步地，所述第一连接层为铬膜，厚度为2-3nm。

进一步地，还包括第二连接层，所述第二连接层自组装于所述激发金属膜上，所述分子自组装层自组装于所述第二连接层上。

进一步地，所述单克隆抗体层由肿瘤标志物的单克隆抗体构成。

本实用新型提供的光纤免疫传感器的有益效果在于：与现有技术相比，在光纤上沉积激发金属膜，形成光纤SPR传感器，通过分子自组装层组装于激发金属膜上的单克隆抗体层实现了光纤SPR传感器的抗体修饰；将光纤应用到SPR生物传感器，能够通过特异性免疫反应对免疫疾病标志物—抗原进行定量检测，集成了光纤传感技术的实时、准确、轻巧、抗干扰能力强和可联网等优势及SPR传感技术的无需标记和灵敏度高等优势，能高灵敏度、实时及便捷地进行免疫疾病标志物检测；凹槽的底壁邻近所述光纤的纤芯，有利于获得光纤上的强倏逝场。

本实用新型的目的之二在于提供一种用于免疫性疾病检测的检测装置，以解决现有技术中存在的不能实时、准确检测肿瘤标志物的技术问题。

为实现上述目的，本实用新型采用的技术方案是：用于免疫性疾病检测的检测装置，包括宽带光源、光纤光谱仪、终端和光纤免疫传感器，所述光纤免疫传感器的两端分别通过连接光纤连接所述宽带光源和所述光纤光谱仪，所述终端与所述光纤光谱仪通信连接。

本实用新型提供的用于免疫性疾病检测的检测装置的有益效果在于：与现有技术相比，宽带光源为光纤免疫传感器提供覆盖的输入光，光信号进入光纤免疫传感器并在传感区域与待测液体样本发生光-物质作用，输出光信号由光纤光谱仪采集，终端安装数据处理软件，对光纤光谱仪采集的数据进行计算得到输出光的谐振峰，谐振峰的波长可定量反映免疫疾病标志物的浓度值；无需标记、无损、实时、准确地对液体样本中的肿瘤标志物进行快速检测，并可进一步应用于需要联网、远程检测的物联网中。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本实用新型实施例提供的一种光纤免疫传感器的检测状态示意图；

图2为本实用新型实施例提供的用于免疫性疾病检测的检测装置的结构示意图；

图3为本实用新型实施例提供的光纤免疫传感器的制作及检测流程的示意图。

其中，图中各附图标记：

1、光纤免疫传感器；

11、光纤；111、凹槽；12、激发金属膜；13、单克隆抗体层；131、抗体；14、分子自组装层；16、第二连接层；17、抗原；

2、宽带光源；3、光纤光谱仪；4、终端；5、连接光纤。

具体实施方式

为了使本实用新型所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本实用新型进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件及类似用语，它可以直接在另一个元件上或者间接在该另一个元件上。当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至该另一个元件上。

此外，术语“第一”、“第二”及类似用语仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。

请参阅图1，现对本实用新型提供的光纤免疫传感器进行说明。光纤免疫传感器1，包括光纤11、激发金属膜12、单克隆抗体层13和用于将单克隆抗体层13组装于激发金属膜12上的分子自组装层14；

光纤11的侧边设有凹槽111，凹槽111的底壁邻近光纤11的纤芯113；

激发金属膜12沉积于凹槽111的底壁上；

分子自组装层14自组装于激发金属膜12上；

单克隆抗体层13涂于经活化处理后的分子自组装层14上。

本实用新型光纤免疫传感器的检测原理为：单克隆抗体层13的抗体131与测试样本中的抗原17发生特异性结合，光纤免疫传感器1的单克隆抗体层13处的表面折射率立即改变，导致光纤免疫传感器1末端测试检测得到的表面等离子体共振谐振峰波长发生明显漂移，因此,可通过谐振峰的波长漂移量定量反应测试样本中抗原的浓度变化。

本实用新型提供的光纤免疫传感器，与现有技术相比，在光纤11上沉积激发金属膜12，形成光纤SPR传感器，通过分子自组装层14组装于激发金属膜12上的单克隆抗体层13实现了光纤SPR传感器的抗体修饰；将光纤11应用到SPR生物传感器，能够通过特异性免疫反应对免疫疾病标志物—抗原进行定量检测，集成了光纤传感技术的实时、准确、轻巧、抗干扰能力强和可联网等优势及SPR传感技术的无需标记和灵敏度高等优势，能高灵敏度、实时及便捷地进行免疫疾病标志物检测；凹槽111的底壁邻近光纤11的纤芯113，有利于获得光纤11上的强倏逝场。

进一步地，作为本实用新型提供的光纤免疫传感器的一种具体实施方式，凹槽111的底壁到光纤11的纤芯113的距离为1～2μm，有利于获得光纤11上的强倏逝场，提高免疫疾病标志物检测的灵敏度。

进一步地，作为本实用新型提供的光纤免疫传感器的一种具体实施方式，激发金属膜12为金膜或银膜。

金膜或银膜均能够激发SPR谐振峰；金膜化学性能稳定并且可以直接进行生物修饰，缺点是金价格贵，激发的SPR谐振峰并不如银膜的分辨率高；采用银膜，能获得更高分辨率的SPR谐振峰，而且价格比金膜廉价许多；

金膜直接组装生物分子的效率不高，设置分子自组装层14，能够提高抗体的组装效率；

银膜在空气中容易发生氧化、硫化等化学反应，从而影响光纤免疫传感器1的稳定性，设置分子自组装层14，一方面能够保护银膜，另一方面能够保证抗体的组装效率，从而得到性能高且成本相对较低的光纤免疫传感器1。

进一步地，作为本实用新型提供的光纤免疫传感器的一种具体实施方式，激发金属膜12的厚度为40～50μm，获得更高分辨率的SPR谐振峰，尤其是银膜的厚度为40～50μm时，SPR谐振峰的分辨率显著提高。

进一步地，作为本实用新型提供的光纤免疫传感器的一种具体实施方式，分子自组装层14为石墨烯纳米膜层或氧化石墨烯纳米膜层，化学性能稳定、比表面积巨大，对生物分子的吸附力较强，其六元碳环结构更易与有机分子结合形成大π键的堆积，相对于常规的采用金膜组装生物分子，石墨烯纳米膜层或氧化石墨烯纳米膜层能获得更高的生物分子组装效率，从而提高光纤免疫传感器1的检测灵敏度及检测极限。

优选地，分子自组装层14为单层或寡层的氧化石墨烯膜层，厚度为1nm～3nm，光纤免疫传感器1检测灵敏度更高。

进一步地，作为本实用新型提供的光纤免疫传感器的一种具体实施方式，还包括第一连接层，第一连接层沉积于凹槽111的底壁上，激发金属膜12沉积于第一连接层上。第一连接层主要能增加激发金属膜12与光纤11的粘附力，避免激发金属膜12起皮、脱膜。

当激发金属膜12为金膜或银膜，优选第一连接层为铬膜，厚度为2-3nm。金膜(或银膜)时，通过铬过渡，能够大幅增加金膜(或银膜)与光纤11的粘附力。

进一步地，请参阅图1，作为本实用新型提供的光纤免疫传感器的一种具体实施方式，还包括第二连接层16，第二连接层16自组装于激发金属膜12上，分子自组装层14自组装于第二连接层16上。一方面第二连接层16为激发金属膜12(尤其是在空气中化学稳定性差的银膜)提供了保护，另一方面第二连接层16作为过渡层，连接下一层设置的分子自组装层14，提高激发金属膜12与分子自组装层14的粘附力。

当激发金属膜12为金膜或银膜时，且分子自组装层14为氧化石墨烯层时，优选第二连接层16采用厚度为纳米量级的正十八硫醇(ODT)；

采用含有巯基的ODT作为金膜与氧化石墨烯膜层之间的连接层，实现金膜的烷基化，当然金膜也可通过其它方式进行烷基化；用含有巯基的ODT作为金膜与氧化石墨烯膜层之间的连接层，通过Ag-S共价键将厚度为纳米量级的ODT自组装在银膜上，在银膜上会形成致密的保护层，能有效克服包含银膜的光纤免疫传感器1容易退化的缺点，同时还提高了激发金属膜12与分子自组装层14的粘附力。

进一步地，作为本实用新型提供的光纤免疫传感器的一种具体实施方式，单克隆抗体层13由肿瘤标志物的单克隆抗体构成，如间皮素。能够实现肿瘤诊断。

请一并参阅图1和图2，现对本实用新型提供的用于免疫性疾病检测的检测装置进行说明。用于免疫性疾病检测的检测装置，包括宽带光源2、光纤光谱仪、终端4和前述任一实施例述及的光纤免疫传感器1，光纤免疫传感器1的两端分别通过连接光纤5连接宽带光源2和光纤光谱仪，终端4与光纤光谱仪通信连接。

宽带光源2为光纤免疫传感器1提供覆盖的输入光(如波长范围为400nm～1100nm)，光信号进入光纤免疫传感器1并在传感区域与待测液体样本发生光-物质作用，输出光信号由光纤光谱仪采集，终端4(如电脑)安装数据处理软件，对光纤光谱仪采集的数据进行计算得到输出光的谐振峰，谐振峰的波长可定量反映免疫疾病标志物(如肿瘤标志物—间皮素)的浓度值；无需标记、无损、实时、准确地对液体样本(如血液或尿液)中的肿瘤标志物进行快速检测，并可进一步应用于需要联网、远程检测的物联网中。

以下对本实用新型提供的光纤免疫传感器的制作方法进行举例说明。光纤免疫传感器的制作方法，包括如下步骤：

S1、在光纤11的侧边加工出凹槽111，且凹槽111的底壁邻近光纤11的纤芯113；

S2、在凹槽111的底壁上蒸镀或溅射一层激发金属膜12；

S3、在激发金属膜12上表面自组装一层分子自组装层14；

S4、活化分子自组装层14，使分子自组装层14的表面形成活化羧基；(步骤S4未图示)

S5、将单克隆抗体滴加于分子自组装层14，单克隆抗体分子中的氨基与述分子自组装层14的表面的活化羧基发生酰胺反应，使得单克隆抗体被组装固定于分子自组装层14上而形成单克隆抗体层13。

该光纤免疫传感器1的制作方法能够用于制作前述任一实施例述及的光纤免疫传感器1。该方法通过简单工艺在光纤11上集成了激发金属膜12和单克隆抗体层13，制得选择性高、反应灵敏的光纤免疫传感器1，组装效率高，分子自组装层14能够对激发金属膜12进行保护，且激发金属膜12和单克隆抗体层13牢固的附着在光纤11上，避免性能发生退化。

进一步地，步骤S1包括：通过侧边抛磨光纤11的加工方法，将光纤11的部分包层112去除直至抛磨面接近光纤11纤芯113，去除部分包层处形成凹槽111。当然凹槽111也可通过其它方式加工。

优选地，依次采用3000目、7000目、12000目砂纸，对单模光纤进行粗磨、细磨、精抛光加工制作侧边抛磨光纤。通过监控光纤11抛磨过程中光功率损耗，发现光纤11抛磨面距离纤芯区域1～2μm(即凹槽111的底壁到光纤11的纤芯113距离为1～2μm)为最佳，有利于获得光纤11上的强倏逝场。

进一步地，步骤S2包括：在侧边抛磨光纤11上，采用真空热蒸镀或磁控溅射的方法，于光纤11抛磨面上均匀沉积一层激发金属膜12，制得光纤SPR传感器。

具体地，为增强激发金属膜12与光纤11的粘附力，优选先在光纤11上沉积第一连接层，再沉积激发金属膜12。当激发金属膜12为金膜或银膜时，先在光纤11表面沉积铬膜，再沉积金膜或银膜，铬膜的厚度具体可为2～3nm。

进一步地，步骤S3包括：

S31、在激发金属膜12的表面自组装第二连接层16；

S32、在第二连接层16的表面自组装分子自组装层14，如氧化石墨烯膜层。

进一步地，在步骤S31中：当激发金属膜12采用银膜时，采用含有巯基的正十八硫醇(ODT)作为银膜与氧化石墨烯膜层之间的第二连接层16，通过Ag-S共价键将厚度为纳米量级的ODT自组装在银膜上。

优选地，采用浓度为10mM的ODT溶液于常温封闭环境下表面自组装36小时。

优选地，采用含巯基的ODT作为起中间过渡作用的第二连接层16，在银膜上会形成致密的保护层，能有效避免基于银的光纤SPR传感器容易退化的缺点。

进一步地，在步骤S32中：将步骤S31完成ODT自组装的光纤SPR传感器放入氧化石墨烯溶胶中，置于密封的室温环境中进行表面自组装，组装完成后取出超纯水清洗，室温下晾干制得增敏型光纤SPR传感器。

具体地，氧化石墨烯膜层自组装时间为40分钟以上为宜,能够在第二连接层16上组装出寡层氧化石墨烯纳米膜层。在银膜上通过寡层氧化石墨烯来组装生物分子——单克隆抗体，氧化石墨烯膜层一方面为银膜提供了进一步的保护，另一方面由于氧化石墨烯的化学性能稳定、比表面积巨大，对生物分子的吸附力较强，其六元碳环结构更易与有机分子结合形成大π键的堆积。相对于常规的采用金膜组装生物分子，氧化石墨烯膜层能获得更高的生物分子组装效率，从而提高传感器的检测灵敏度及检测极限。

具体地，氧化石墨烯溶胶可通过下述方法制得：

采用水或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，将购买的商用氧化石墨烯粉末溶于其中搅拌均匀，置于五面震动超声波机中，对氧化石墨烯溶液进行大功率超声分散。优选地，水域温度恒定在25～30℃左右，超声4小时可获得较好的氧化石墨烯片层剥离效果，制得稳定的氧化石墨烯溶胶体系。

进一步地，步骤S4包括：

将步骤S3制得的增敏型光纤SPR传感器放入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基珀酰亚胺(NHS)溶液中，低温(4℃)活化30min，取出室温下晾干。从而对增敏型光纤SPR传感器表面的氧化石墨烯的羧基(—COOH)进行活化。

进一步地，步骤S5包括：将肿瘤标志物的特异性单克隆抗体滴涂于步骤S4处理过的增敏型光纤SPR传感器的传感区域，置于4℃冰箱中干燥晾干，制得一种用于检测相应标志物的光纤免疫传感器1，拓展了光纤11传感器在生化检测领域中的新应用。

作为实施案列，针对胰腺癌、卵巢癌等肿瘤的标志物，以间皮素作为检测对象，将间皮素单克隆抗体滴加在传感区域。表层氧化石墨烯膜层上活化后的羧基(—COOH)与单克隆抗体分子中的氨基(—NH2)发生酰胺反应，从而抗体被组装固定于传感器表面，实现肿瘤的实时、准确、特异性高的生物分子识别。

以上仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。