一种双通道光纤SPR生物传感器的制作方法

本实用新型涉及生物传感器技术领域，具体涉及SPR生物传感器，尤其涉及一种双通道光纤SPR生物传感器。

背景技术：

Surface Plasmon Resonance(SPR)，中文名称为表面等离子体共振，它是一种常见的光学现象，它是指光波导中某一特定波长的入射光照射到金属(如金或银)薄膜时，光波就会与金属表面产生的等离子体波发生共振，称之为表面等离子体共振(SPR)效应。SPR效应会使反射光的能量发生锐减，从而形成共振波谷，同时，SPR对外界折射率十分敏感，当所测溶液浓度改变，即外界溶液折射率改变时，SPR的共振波谷就会随之移动，因此，本实用新型通过检测SPR共振波谷的偏移量而实现生物传感。

SPR生物传感器由于其高灵敏度和生物相容性而在生物和化学检测中引起了极大的关注。根据表面等离子体波与周围生物分子之间的相互作用，导致共振角或共振波长的偏移，就可以实现外部生物分子的检测。与基于棱镜的传统SPR生物传感平台相比，光纤SPR生物传感器具有制作简单，成本低，结构小型化和抗电磁干扰等特性。然而，传统的SPR生物传感器缺乏足够的灵敏度来检测分子质量较低的生物分子，如DNA和较低浓度的生物样品。另外，大多数光纤生物传感器只有一个检测通道，只能检测一种分析物，在检测过程中，检测结果的准确性通常会受到生物样品的非特异性吸附或外界温度波动的影响。因此，需要进一步提高传感器的检测灵敏度和精确度。

技术实现要素：

为了解决现有光纤SPR生物传感器的灵敏度和精确性较低的问题，本实用新型提出了一种双通道光纤SPR传感器。该双通道SPR传感器包括参考通道和传感通道，作为空白对照参考通道，检测由非特异性吸附引起的波长移动量；传感通道利用金膜与金纳米粒子之间的耦合效应增强局域电场强度来提高传感器的检测灵敏度，在镀有金膜的光子晶体光纤传感器的表面通过共价键结合方法来固定氧化石墨烯薄膜，利用氧化石墨烯薄膜来提高抗体的固定效率，抗体和被金纳米粒子固定的抗原之间的特异性结合引起共振波长漂移，根据光谱仪上显示的共振波长的移动量来实现抗原高灵敏度的测量；双通道光纤SPR传感器中两个通道分别使用不同的金属膜，从而产生两个共振谷，实现双通道传感。

为实现上述目的，本实用新型采用了以下技术方案：

一种双通道光纤SPR生物传感器，包括参考通道和传感通道，参考通道和检测通道通过多模光纤连接，其中：

参考通道包括第一光子晶体光纤，第一光子晶体光纤两端分别熔接多模光纤，第一光子晶体光纤表面镀银膜；参考通道作为空白对照，检测由非特异性吸附引起的波长移动量；

传感通道包括第二光子晶体光纤，第二光子晶体光纤的两端分别熔接多模光纤，第二光子晶体光纤表面镀金膜，金膜表面固定氧化石墨烯薄膜，氧化石墨烯薄膜上固化有对生物分子或化学成分具有选择性吸收的抗体膜层，对应于抗体的抗原被金纳米粒子固定，检测过程中抗体和抗原结合，使得表面固定有抗原的金纳米粒子固定在抗体薄膜上，金膜与金纳米粒子之间产生耦合效应。

进一步地，所述的参考通道的第一光子晶体光纤和传感通道的第二光子晶体光纤的长度为0.5～2cm。

进一步地，所述的参考通道的第一光子晶体表面镀银膜，银膜厚度为40～60nm。

进一步地，所述的传感通道的第二光子晶体光纤表面镀金膜，金膜厚度为40～60nm。

进一步地，所述的传感通道的金膜表面固定氧化石墨烯薄膜，金膜表面通过共价键结合方法来固定氧化石墨烯薄膜，利用氧化石墨烯薄膜来提高抗体的固定效率。

进一步地，所述的传感通道的金膜表面固定氧化石墨烯薄膜，氧化石墨烯薄膜的厚度为0.2～0.6nm。

进一步地，所述的传感通道的金纳米粒子的直径为10～50nm。

本实用新型的原理如下：

本实用新型主要利用双通道来提高光纤SPR传感器检测的灵敏度和精确度，其中一段光子晶体光纤作为传感通道，表面依次镀上金膜和氧化石墨烯薄膜，用于固定抗体，抗原和抗体之间的特异性结合及抗原的非特异性吸附都会引起传感通道的波长移动，为了排除传感通道中抗原的非特异性吸附引起的波长移动量，引入另一段镀银膜的光子晶体光纤作为参考通道，用于检测抗原的非特异性吸附引起的波长移动量，将传感通道的波长移动量减去参考通道的波长移动量就得到了抗原和抗体之间特异性结合引起的波长移动量，由此来提高检测的精确度。

由上述双通道光纤SPR生物传感器形成的双通道光纤SPR传感系统，包括以多模光纤为光路的双通道光纤SPR传感器、宽带光源和光谱仪，双通道光纤SPR传感器输入端通过多模光纤光路将宽带光源发出的光传输至双通道光纤SPR传感器，双通道光纤SPR传感器输出端连接光谱仪，光谱仪通过数据接口连接到计算机，双通道光纤SPR生物传感器置于待检测生物分子的溶液中。

进一步地，所述的双通道光纤SPR传感系统置于密闭的管状待检测容器中，待检测容器两端设置有进样口和出样口。

进一步的地，所述的管状待检测容器带有固定支架，固定支架支撑管状待检测容器并置于固定位置。

传感通道外表面从内外分别镀金膜和氧化石墨烯薄膜作为生物传感通道，利用氧化石墨烯薄膜来提高抗体的固定效率，抗体和被金纳米粒子固定的抗原之间的特异性结合引起共振波长漂移，根据光谱仪上显示的共振波长的移动量来实现抗原高灵敏度的测量。在参考通道的外表面镀银膜，作为空白对照，检测非特异性吸附引起的波长移动量，进而提高检测的精确度。

上述双通道光纤SPR传感器的制备方法，步骤如下：

(1)制备双通道光纤传感器

将第一光子晶体光纤和第二光子晶体光纤的两端通过熔接机分别熔接多模光纤，即两段光子晶体光纤之间也通过熔接的多模光纤连接，第一光子晶体光纤和第二光子晶体光纤的长度都为0.5～2cm，熔接时的放电强度为50～100mW，放电电流为3000～5000mA，熔接温度为2000～3000℃；

(2)制备参考通道

通过银镜反应对第一光子晶体光纤表面镀银膜，银膜厚度为40～60nm；

(3)制备传感通道

ⅰ镀金膜

将第二光子晶体光纤放进真空离子束溅射仪中，对第二光子晶体光纤表面镀金膜，真空离子束溅射仪的电流为5～7mA，时间为2～4分钟，金膜厚度为40～60nm；

ⅱ固定氧化石墨烯薄膜

将镀金膜的第二光子晶体光纤浸入0.5～2mmol/L的4-氨基苯硫酚乙醇溶液中6～24小时，以进行金膜表面胺化，4-氨基苯硫酚分子可以通过Au-S共价键与金膜连接，并且将胺基(-NH2)留在外面，以进一步与氧化石墨烯的环氧基结合；用蒸馏水冲洗后，第二光子晶体光纤浸入0.05～1mg/mL的氧化石墨烯水溶液中，将所述氧化石墨烯水溶液放进温度为30～60℃的恒温箱中，在20～60分钟后，氧化石墨烯分散液蒸发，通过物理蒸发方法实现在金膜表面固定氧化石墨烯薄膜，氧化石墨烯薄膜的厚度为0.2～0.6nm；

ⅲ固定抗体

将第二光子晶体光纤浸泡在0.5～1mL浓度为0.1～0.4mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.5～1mL浓度为0.1～0.4mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，15～60分钟后，蒸馏水冲洗干净；然后将其浸入入到待固定的抗体溶液中进行抗体固定；

ⅳ金纳米粒子固定抗原

将待检测抗原加入到浓度为500～1000ppm、直径为10～50nm的金纳米粒子分散液中，通过静电自组装将抗原固定在金纳米粒子的表面；

(4)检测抗原

在温度25～37℃下，向双通道光纤SPR传感器加入被金纳米粒子固定的人免疫球蛋白溶液，根据抗体和被金纳米粒子固定的抗原之间的特异性结合引起共振波长漂移，实现抗原的检测，同时根据参考通道的波长移动量来得到实际抗原-抗体之间的特异性吸附引起的波长移动量。

本实用新型与现有技术相比的有益效果是：

1、本实用新型提出的双通道光纤SPR传感器通过设置参考通道和传感通道双通道，具有的高灵敏度、消除非特异性吸附造成的测量误差和对温度不敏感的独特优势；

2、双通道的两个SPR共振谷相互分离，以确保它们在检测过程中不会相互产生不利影响，使其更有利于生物传感；

综上，本实用新型解决了现有技术中的传感器灵敏度低、易受液体折射率变化和温度波动影响的问题，非常适于在生物传感等领域广泛推广。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本实用新型实施例1中的基于双通道光纤SPR生物传感器结构示意图；

图2是本实用新型实施例1中的双通道光纤SPR生物传感系统结构示意图；

图3是本实用新型实施例1中的双通道光纤SPR传感器在不同折射率下的光谱图；

图4是本实用新型实施例1中的双通道光纤SPR传感器在不同折射率下的折射率拟合曲线图；

图5是本实用新型实施例1中的双通道光纤SPR传感器检测不同浓度的人免疫球蛋白对应的波长移动量；

图中：1、第一光子晶体光纤，2、第二光子晶体光纤，3、多模光纤，4、银膜，5、金膜，6、氧化石墨烯薄膜，7、抗体-羊抗人免疫球蛋白，8、抗原-人免疫球蛋白，9、金纳米粒子，1’、参考通道，2’、传感通道，A、高灵敏度光纤SPR生物传感器，B、宽带光源，C、光谱仪，D、多模光纤光路，E、进样口，F、出样口，G、计算机，H、玻璃管，I、支架。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本实用新型中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本实用新型。

为使本实用新型实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本实用新型及其应用或使用的任何限制。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本实用新型的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本实用新型的范围。同时，应当清楚，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员己知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任向具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。

在本实用新型的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型保护范围的限制：方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。

为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其位器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。

此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定零部件，仅仅是为了便于对相应零部件进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本实用新型保护范围的限制。

实施例1

本实施例中，制备一种用于检测人免疫球蛋白的双通道光纤SPR生物传感器，即待检测抗原为人免疫球蛋白，检测的抗体为羊抗人免疫球蛋白。

如图1所示，一种双通道光纤SPR生物传感器，包括参考通道1’和传感通道2’，参考通道1’和检测通道2’通过多模光纤连接，其中：

参考通道1’包括第一光子晶体光纤1，第一光子晶体光纤1的长度为0.5～2cm，第一光子晶体光纤1两端分别熔接多模光纤2；第一光子晶体光纤1表面镀银膜4，银膜4的厚度为40～60nm；参考通道1’作为空白对照，检测由非特异性吸附引起的波长移动量；

传感通道2’包括第二光子晶体光纤2，第二光子晶体光纤2的长度为0.5～2cm，第二光子晶体光纤2的两端分别熔接多模光纤3，第二光子晶体光纤2表面镀金膜5，金膜5的厚度为40～60nm；金膜5表面通过共价键结合方法来固定氧化石墨烯薄膜6，氧化石墨烯薄膜的厚度为0.2～0.6nm，氧化石墨烯薄膜6上固化有抗体-羊抗人免疫球蛋白7薄膜，利用氧化石墨烯薄膜6来提高抗体-羊抗人免疫球蛋白7的固定效率；待检测抗原-为人免疫球蛋白8被金纳米粒子9固定，金纳米粒子的直径为10～50nm，检测过程中抗体-羊抗人免疫球蛋白7和抗原-为人免疫球蛋白8结合，使得表面固定有抗原-为人免疫球蛋白8的金纳米粒子9固定在抗体-羊抗人免疫球蛋白7薄膜上，金膜5与金纳米粒子9之间产生耦合效应。

如图2所示，由上述双通道光纤SPR生物传感器形成的传感系统，包括双通道光纤SPR生物传感器A，系统以多模光纤为光路，即多模光纤为光路D，双通道光纤SPR生物传感器A的输入端连接光谱为可见光波段的宽带光源B，双通道光纤SPR生物传感器A输出端连接光谱仪C，光谱仪C通过数据接口连接到计算机G，双通道光纤SPR生物传感器A置于密闭的管状待检测容器中，本实施例中待检测容器为玻璃管H，玻璃管H两端设置有进样口E和出样口F，待检测的溶液通过玻璃管H的进样口E进入，从出样口F流出，从而使双通道光纤SPR生物传感器A置于待检测溶液中。玻璃管H带有固定支架I，固定支架I支撑玻璃管H并置于固定位置。

制备上述双通道光纤SPR生物传感器的方法，步骤如下：

(1)制备双通道光纤传感器

传感通道和参考通道的第一光子晶体光纤1和第二光子晶体光纤2的外径都为125μm，包含5层正六边形排列的空气孔，空气孔直径为4.8μm，空气孔间距为7.7μm，第一光子晶体光纤1和第二光子晶体光纤2的长度都为1cm，将第一光子晶体光纤1和第二光子晶体光纤2的两端通过熔接机分别熔接多模光纤3，多模光纤3的外径为125μm，纤芯直径为62.5μm，第一光子晶体光纤1、第二光子晶体光纤2和多模光纤3均为石英玻璃材料，熔接机的放电强度为130mW，放电时间3000ms，熔接温度为2000℃；

(2)制备参考通道

通过银镜反应对第一光子晶体光纤1表面镀银膜4，银膜4厚度为50nm；

(3)制备传感通道

ⅰ镀金膜

将第二光子晶体光纤2放进真空离子束溅射仪中，对第二光子晶体光纤2表面镀金膜5，真空离子束溅射仪的电流为7mA，时间为2分钟，金膜5厚度为50nm；

ⅱ固定氧化石墨烯薄膜

将镀金膜的第二光子晶体光纤2浸入盛有20mL浓度为0.5mmol/L的4-氨基苯硫酚的乙醇溶液的培养皿中，24小时后用蒸馏水冲洗，4-氨基苯硫酚分子可以通过Au-S共价键与金膜连接，并且在金膜外表面形成胺基(-NH2)；将第二光子晶体光纤2固定在载玻片上，取浓度为0.5mg/mL的氧化石墨烯分散液0.5mL，浸没第二光子晶体光纤2，并放入40℃的恒温箱中，40分钟后，氧化石墨烯分散液蒸发，通过物理蒸发方法实现在金膜5表面固定氧化石墨烯薄膜6，氧化石墨烯薄膜6厚度为0.5nm；

ⅲ固定抗体-羊抗人免疫球蛋白

将第二光子晶体光纤2浸泡在1mL浓度为0.4mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和1mL浓度为0.1mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中(1：1混合)，20分钟后蒸馏水冲洗干净；然后将第二光子晶体光纤2浸入500μL浓度为200μg/mL的抗体-羊抗人免疫球蛋白7溶液中，浸泡1小时，这样就实现了抗体-羊抗人免疫球蛋白7在氧化石墨烯薄膜6表面的固定；

ⅳ金纳米粒子固定抗原-人免疫球蛋白

将不同浓度的抗原-人免疫球蛋白8溶液加入到体积为10mL、浓度为1000ppm、直径为10nm的金纳米粒子9分散液中，通过静电自组装将抗原-人免疫球蛋白8固定在金纳米粒子9的表面；

(4)检测抗原

在温度25℃下，向双通道光纤SPR传感器加入被金纳米粒子9固定的抗原-人免疫球蛋白8溶液，抗体-羊抗人免疫球蛋白7就会和金纳米粒子9固定的抗原-人免疫球蛋白8特异性结合，引起共振波长的移动，根据波长的移动量来实现不同浓度的人免疫球球蛋白的检测，不同浓度的人免疫球蛋白对应的波长移动量如图5所示，从图5中可以看出，传感通道2’用于生物传感，参考通道1’作为空白对照，检测非特异性吸附，传感通道2’的波长移动量减去参考通道1’的波长移动量就得到了实际抗体(羊抗人免疫球蛋白)和抗原(人免疫球蛋白)之间的特异性结合引起的共振波长漂移量。

上述制备的本实用新型双通道光纤SPR生物传感器的折射率和生物传感特性测试：

为了研究本实用新型所提出的双通道光纤SPR传感器的折射率传感性能，将该传感器接入以多模光纤为光路的传感系统，输入端使用波长范围为215nm至2500nm的氘-卤灯作为光源，使用海洋光学光谱仪来检测共振光谱，然后将该双通道光纤SPR传感器浸入不同折射率的氯化钠盐溶液中，共振光谱如图3所示，随着折射率的增加，双通道光纤SPR传感器的共振波长向右漂移。传感器的灵敏度可以表示为共振波峰的偏移Δλp与待测样品折射率的改变Δna的比值，即

图4是本实用新型所提出的双通道光纤SPR传感器的折射率灵敏度拟合曲线，根据图4所示的拟合曲线的斜率，可得到本实用新型提出的双通道光纤SPR传感器的折射率灵敏度达到13592nm/RIU，线性度为0.98896，参考通道1’的折射率灵敏度为2524nm/RIU，线性度为0.9659，传感通道2’的折射率灵敏度是只镀银膜的参考通道1’的折射率灵敏度的5.4倍，这是由于传感通道2’镀有金膜和固定有氧化石墨烯薄膜，氧化石墨烯具有高效的电子迁移速率，增强传感器表面的电磁场强度与外部介质的相互作用，提高了传感器的折射率灵敏度，说明本实用新型所提出的双通道光纤SPR传感器对提高检测灵敏度具有的重要作用。

本实用新型双通道光纤SPR生物传感器利用双通道结构，参考通道作为空白对照，检测非特异性吸附引起的波长移动量，同时传感通道作为生物传感通道，利用金膜与金纳米粒子之间的耦合效应增强局域电场强度来提高传感器的检测灵敏度，在镀有金膜的光子晶体光纤表面通过共价键结合方法来固定氧化石墨烯薄膜，利用氧化石墨烯薄膜来提高抗体(羊抗人免疫球蛋白)的固定效率，抗体(羊抗人免疫球蛋白)和被金纳米粒子固定的抗原(人免疫球蛋白)之间的特异性结合引起共振波长漂移，根据共振波长的移动量来实现抗原(人免疫球蛋白)高灵敏度测量，同时提到了检测的精确度。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的范围。