定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒的制作方法

本实用新型属于医学领域，特别涉及一种定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析试剂盒，可以快速定量地检测末梢血降钙素原。

背景技术：

PCT是一种无激素活性的糖蛋白，由116个氨基酸组成，分子量为13kDa。 1993年Assicot首先提出PCT可以作为细菌感染的标志物，随后的研究证实 PCT水平与严重细菌感染相关，在病毒感染时PCT始终不升高或轻度升高。这一研究发现使PCT其成为鉴别细菌与病毒性感染的研究热点。

PCT由特异蛋白酶将其剪切为降钙素、降钙蛋白(katacacin)和N一末端残基。PCT于20世纪80年代研究肿瘤标志物时偶然发现。90年代初，研究ALI 标志物时发现血清PCT明显提高者多伴有脓毒症及感染性休克，人们开始猜测PCT与感染之间的联系。在炎症早期较CRP出现早或同步，其在脓毒症和感染患者血清中明显升高，升高程度可以反映脓毒症的严重程度及预后。 2001年国际脓毒症会议已将PCT作为脓毒症诊断指标之一。CRP是机体在应激状态下由肝脏合成的一种急性相反应蛋白，测定血清CRP的浓度对炎症的诊疗有一定意义，但其敏感性低于PCT。

脓毒症(Sepsis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合征(SIRS)。脓毒症、严重脓毒症(severe sepsis)、脓毒症休克(septic shock)所导致的多器官功能衰竭所致的死亡率仍高达35％一70％，主要是由于缺乏早期诊断。近年来，血清降钙素原(procaleitonin，PCT)作为一个新的炎症指标，在脓毒症的诊断和治疗中起到了有价值的指导应用。

降钙素原(PCT)是降钙素的前肽，是严重细菌感染时需早期检测的实验室指标之一。测定降钙素原(PCT)可以用于全身细菌感染或败血症的早期诊断，系统性感染、脓毒症的多器官脏器衰竭的严重性评判、治疗监控以及预后评估，全身炎症反应综合症(SIRS)和脓毒症(Sepsis)的鉴别诊断，细菌性感染和病毒性感染的鉴别诊断。

降钙素原在儿科感染及指导抗生素用药等方面有重大应用。但是目前临床上常用的PCT检测免疫方法有很多，其中免疫层析法大多数取血量比较大，需要50-100uL全血，不支持末梢血。其存在如下缺陷：静脉血采血过程相对繁琐，且需抗凝管保存，成本提高，浪费社会资源；且由于采血量相对较大，造成部分患者(如婴幼儿)采血痛苦或血量不足等一些列的取样困难因素。

技术实现要素：

本实用新型的主要目的在于提供一种定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析试剂盒，所述的试剂盒采用荧光免疫侧向层析技术，快速定量地检测末梢血降钙素原；所述的检测试剂盒的待测样本量小，减少采血量，降低采血痛苦，有效降低患者(如婴幼儿等)血量要求；采样简单快捷，无需抗凝管保存，样本即取即测，能够快速得到检测结果，有效降低医疗成本，从而更加适于实用。

本实用新型的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本实用新型提出的一种定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析试剂盒，其包括：卡壳；荧光免疫层析试纸条,其包括检测线和质控线；所述荧光免疫层析试纸条卡接于所述卡壳内；样品混合单元，连接于所述卡壳的一端，其包括第一底座；所述样品混合单元还包括卡接于所述第一底座上的第一容器；所述第一容器的开口端用铝箔封口形成密封结构；缓冲液单元，与所述样品混合单元相邻设置，其包括第二底座；所述缓冲液单元还包括卡接于所述第二底座上的第二容器；所述第二容器的开口端用铝箔封口形成密封结构；所述第一容器内封装有红色纳米荧光微球标记的第一末梢血降钙素原特异性抗体；所述第二容器内封装有末梢血降钙素原样本缓冲液；所述检测线上固定有红色纳米荧光微球标记的第二末梢血降钙素原特异性抗体；所述质控线上固定有鼠源性抗体。

本实用新型的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述荧光免疫层析试纸条设置有包含近样品端和远样品端的底板，所述底板上由近样品端到远样品端依次搭接设置有样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫；所述检测线和质控线设置于所述硝酸纤维素膜上；所述质控线设置在所述检测线与吸水垫之间。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述卡壳包括卡底和盖在其上的卡盖；所述荧光免疫层析试纸条放置于所述卡底内；所述卡盖的内部设置有若干用于压紧所述荧光免疫层析试纸条的卡点；所述卡盖上还设置有加样孔和观察窗；所述样品垫位于所述加样孔的下方；所述检测线和质控线位于所述观察窗的下方。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述红色纳米荧光微球的激发发射波长对为570-590nm和610-620nm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述第二末梢血降钙素原特异性抗体为鼠抗人末梢血降钙素原单克隆抗体。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述鼠源性抗体为抗鼠IgG多克隆抗体。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述第二容器内的末梢血降钙素原样本缓冲液包括若干人份的缓冲液；所述缓冲液的单人份体积为100-400uL。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述底板为白色，且附着有不干胶；所述卡壳、硝酸纤维素膜、底板及不干胶均不含有荧光剂。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述试剂盒的待测样本的体积为10-20uL。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述底板采用PVC胶板，其尺寸为长度6-8cm，宽度4-6mm，厚度 0.25-0.5mm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述的样品垫采用玻璃纤维过滤膜，其尺寸为长度15-30mm，宽度 4-6mm，厚度0.5-1mm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述硝酸纤维素膜的尺寸为长度20-35mm，宽度4-6mm，厚度0.2-0.3mm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述的吸水垫的尺寸为长度10-30mm，宽度4-6mm，厚度0.9-1.8mm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述检测线和加样孔正投影位置之间的距离为15-25mm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒，其中所述质控线距离所述检测线3-6mm。

借由上述技术方案，本实用新型提出的一种定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析试剂盒至少具有下列优点：

1)本实用新型的试剂盒采用红色纳米荧光微球标记抗体，不仅可以避免血液本底荧光物质的干扰，而且具有发光强度高、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化、稳定性好及灵敏度高等优势；

2)本实用新型的试剂盒组成部件中的卡壳、底板以及硝酸纤维素膜不含荧光物质，可以减少对荧光微球荧光信号获取的影响，从而保证获得高的荧光信背比，进而达到提高灵敏度的目的；

3)本实用新型的试剂盒采用荧光免疫层析法快速定量地检测末梢血降钙素原(PCT)，可减少非特异性吸附，降低荧光本底，增强特异性结合，进而提高检测灵敏度，有利于样品中末梢血降钙素原(PCT)含量极低时的准确定量；

4)本实用新型的试剂盒相比于常规荧光免疫层析试剂盒，其具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势；

5)本实用新型的试剂盒的待测样本量小，减少采血量，降低采血痛苦，有效降低患者(如婴幼儿等)血量要求，尤其对于新生儿血容量低，取血困难的情况特别适用；

6)本实用新型的试剂盒检测末梢血降钙素原，避免了繁冗复杂的取样流程，取而代之的是简单快捷的操作方法，能够更为快速、简单的得到检测结果；

7)本实用新型的试剂盒的待测样本无需抗凝管保存，样本即取即测，有效降低医疗成本，避免不必要的医疗资源浪费。

上述说明仅是本实用新型技术方案的概述，为了能够更清楚了解本实用新型的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本实用新型的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本实用新型的试剂盒俯视结构示意图；

图2是图1的A-A剖面结构示意图；

图3是本实用新型的荧光免疫层析试纸条的结构示意图。

具体实施方式

为更进一步阐述本实用新型为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本实用新型提出的一种定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析试剂盒，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。

如附图1至附图3所示，本实用新型提出的一种定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析试剂盒，其包括：卡壳1；荧光免疫层析试纸条2,其包括检测线231和质控线232；所述荧光免疫层析试纸条2卡接于所述卡壳 1内；样品混合单元3，连接于所述卡壳1的一端，其包括第一底座；所述样品混合单元3还包括卡接于所述第一底座上的第一容器；所述第一容器的开口端用铝箔封口形成密封结构；缓冲液单元4，与所述样品混合单元3 相邻设置，其包括第二底座；所述缓冲液单元4还包括卡接于所述第二底座上的第二容器；所述第二容器的开口端用铝箔封口形成密封结构；所述第一容器内封装有红色纳米荧光微球标记的第一末梢血降钙素原特异性抗体；所述第二容器内封装有末梢血降钙素原样本缓冲液；所述检测线231 上固定有红色纳米荧光微球标记的第二末梢血降钙素原特异性抗体；所述质控线232上固定有鼠源性抗体。

所述卡壳1为所述的荧光免疫层析试纸条2的外部壳结构。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述荧光免疫层析试纸条2设置有包含近样品端和远样品端的底板21，所述底板21上由近样品端到远样品端依次搭接设置有样品垫22，硝酸纤维素膜23和吸水垫24；所述检测线231和质控线232设置于所述硝酸纤维素膜23上；所述质控线232设置在所述检测线231与吸水垫24之间。

当所述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析试剂盒用于检测末梢血降钙素原时，待测样品为血清、血浆或全血。所述的待测样品在所述的第一容器内与红色纳米荧光微球标记的第一末梢血降钙素原特异性抗体结合，制得待层析的样品；所述的待层析的样品经所述的加样孔111加入到样品垫22中，沿硝酸纤维素膜23向吸水垫24方向层析运动，所述的层析时间优选15分钟。此时所述的荧光免疫层析试纸条2的样品垫22同时具有样品收集、释放及过滤的作用。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述卡壳1包括卡底12和盖在其上的卡盖11；所述荧光免疫层析试纸条2放置于所述卡底12内；所述卡盖11的内部设置有若干用于压紧所述荧光免疫层析试纸条2的卡点；所述卡盖11上还设置有加样孔111和观察窗112；所述样品垫22位于所述加样孔111的下方；所述检测线231和质控线232位于所述观察窗112的下方。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述红色纳米荧光微球的激发波长为570-590nm，发射波长为 610-620nm。

所述的红色纳米荧光微球可以是单一化合物的荧光微球或者由几种化合物组成的复合荧光微球；所述的荧光微球优选单一化合物荧光微球、且优选具有较强的光稳定性的荧光微球。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述第二末梢血降钙素原特异性抗体为鼠抗人末梢血降钙素原单克隆抗体。

所述第二末梢血降钙素原特异性抗体包被于所述检测线231上。

所述的第一容器内表面固定的红色纳米荧光微球标记的第一末梢血降钙素原(PCT)特异性抗体与所述的检测线231上包被的红色纳米荧光微球标记的第二末梢血降钙素原特异性抗体识别的抗原决定簇不同。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述鼠源性抗体为抗鼠IgG多克隆抗体。

所述的鼠源性抗体包被于所述质控线232上，用以捕获多余的荧光微球。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述第二容器内的末梢血降钙素原样本缓冲液包括若干人份的缓冲液；所述缓冲液的单人份体积为100-400uL。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述的底板21为白色，且表面附有不干胶；所述样品垫22，硝酸纤维素膜23和吸水垫24通过不干胶粘结于所述的底板21上；所述卡壳1、硝酸纤维素膜23、底板21及不干胶均不含有荧光剂。

为了降低试剂盒对荧光微球荧光信号的影响，本实用新型采用不含荧光的硝酸纤维素膜23、底板21以及卡壳1，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述试剂盒的待测样本的体积为10-20uL。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述底板21采用PVC胶板，其尺寸为长度6-8cm，宽度4-6mm，厚度 0.25-0.5mm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述的样品垫22采用玻璃纤维过滤膜，其尺寸为长度15-30mm，宽度 4-6mm，厚度0.5-1mm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述硝酸纤维素膜23的尺寸为长度20-35mm，宽度4-6mm，厚度 0.2-0.3mm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述的吸水垫24的尺寸为长度10-30mm，宽度4-6mm，厚度0.9-1.8mm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述检测线231和加样孔111正投影位置之间的距离为15-25mm。

优选的，前述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析的试剂盒,其中，所述质控线232与所述检测线231之间的距离3-6mm。

所述的吸水垫24采用玻纤和棉绒的混合材料。

上述的定量检测末梢血降钙素原的荧光免疫层析试剂盒的制备方法如下：

1)荧光免疫层析试纸条的构建：

A、在硝酸纤维素膜上分别设置一条检测线和一条质控线，其中，质控线上固定有能与质控分子特异性结合的鼠源性抗体，检测线上固定有红色纳米荧光微球标记的第二末梢血降钙素原(PCT)特异性抗体，且该特异性抗体所识别的抗原决定簇与固定在第一容器上的红色纳米荧光微球标记的第一末梢血降钙素原(PCT)特异性抗体所识别的抗原决定簇不同；

在一个优选的方案中，将第二末梢血降钙素原(PCT)特异性抗体、质控抗体分别用包被缓冲液稀释为0.5-3.0mg/ml的固定浓度；所述的包被缓冲液为0.01M的磷酸缓冲液(PBS)，加3％的蔗糖作为保护剂；所述的包被采用专门的包被设备-BIODOT公司的XYZ3060将上述两个液体包被到硝酸纤维素膜(检测膜)上，37℃的干燥箱中干燥4小时，备用。

B、将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接搭载于底板上构建成荧光免疫层析试纸条；

所述的样品垫使用样品处理液按所需浓度浸泡，或者将样品处理液喷在样品垫内或样品垫表面，干燥备用。优选的样品处理液包括：50毫摩尔 Tris-HCl，0.5wt％Casein，0.5wt％BSA，0.1wt％Tween-20，0.05wt％PEG， 0.1wt％Tween-80，0.05％PVP，0.3wt％二水合柠檬酸酸钠和2wt％蔗糖，其中，Tris-HCl为“三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液”，Casein为“酪蛋白”， BSA为“牛血清白蛋白”，PEG为“聚乙二醇”，Tween-20为“吐温20”， Tween-80为“吐温80”，PVP为“聚乙烯吡咯烷酮”。

2)装卡：

将荧光免疫层析试纸条装入卡壳内，安装方向需使得卡盖上的加样孔正对所述的样品垫，观察窗正对所述的检测线和质控线；

3)缓冲液单元封装：

在所述的第二容器内装入设计人份的末梢血降钙素原样板缓冲液，铝箔封口形成密闭结构；然后将所述的密闭结构卡接于所述的第二底座上；

所述的样本缓冲液包括：50毫摩尔Tris-HCl，0.1wt％Tween-80和0.73 wt％二水合柠檬酸三钠。

4)样品混合单元封装：

在所述的第一容器内装入红色纳米荧光微球标记的第一末梢血降钙素原(PCT)特异性抗体，干燥，铝箔封口形成密闭结构；然后将所述的密闭结构卡接于所述的第一底座上。

所述的红色纳米荧光微球标记的末梢血降钙素原(PCT)特异性抗体是通过化学交联的方法获得。所采用的化学交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等。

所述的红色纳米荧光微球标记的末梢血降钙素原(PCT)特异性抗体标记之后，先储存在储存液内，备用；所述的储存液为50毫摩尔Tris和0.5％ BSA，其pH值为7.8。待需要时，将此备用的抗体封装入所述的第一容器内。

本实用新型所采用的红色纳米荧光微球标记的末梢血降钙素原(PCT) 特异性抗体为北京康思润业生物技术有限公司的产品。

本实用新型的检测使用荧光定量仪。所述的荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块以及软件系统。其中激发光源模块包含光源及聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，且波长位于550～750nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应的荧光信号。光电转换模块包括图像传感器或者光电倍增管。

将待测样品在样品混合单元中与红色纳米荧光微球标记的第一末梢血降钙素原(PCT)特异性抗体结合后，通过加样孔将待层析的样品滴加至样品垫上进行层析；待层析结束后，采用波长为570-590nm的光源照射所述的试纸条，所述的试纸条上的荧光物质发射出波长为610-620nm的荧光。所述的试纸条产生的荧光信号经滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，获得数字信号。质控线获得的荧光信号强度与检测线获得的荧光信号强度具有相关性：如果质控线荧光信号强度超出荧光定量仪内部设定的可接受值，说明检测结果无效；在检测结果有效前提下，检测线获得的荧光信号强度与质控线荧光信号强度的比值越高，表示样品中目标检测物的浓度越高，反之越低。

本实用新型采用荧光定量仪检测一系列不同浓度的标准品，绘制标准曲线。然后检测样品，依据标准曲线获得待测样品中降钙素原(PCT)的浓度。

人体的血液本身具有荧光特性，其激发-发射对主要有260-630nm、 280-340nm、340-460nm、450-520nm，其所对应的内源性荧光物质分别为卟啉、色氨酸、还原烟碱腺嘌呤二核苷酸和黄色腺嘌呤二核苷酸，因此，在采用血液作为待测样品的检测中，如何避免血液中内源性荧光物质对检测结果的干扰是不得不思考的问题。

本实用新型的试剂盒采用红色纳米荧光微球标记抗体，采用波长为 570-590nm的光源照射所述的试纸条，所述的试纸条上的荧光物质发射出波长为610-620nm的荧光，不仅可以避免血液本底荧光物质的干扰，而且其具有发光强度高、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化、稳定性好及灵敏度高等优势。

在相同条件下，取20个检测样本，分别抽取75ul静脉血与15ul末梢血对比检测，所得的检测结果如下表1所示：

表1 75ul静脉血与15ul末梢血的降钙素原检测结果比较

由上述表1的测试结果可见，本试剂盒检测降钙素原较原方法的取样量减少了5倍，降钙素原(PCT)项目上检测结果相对偏差皆控制在10％以内，准确度并未受到影响，说明15ul末梢血的样品检测准确度符合要求。由于待测样本的血液需求量变小，将静脉血更换为末梢血，使得采血方便快捷，且无需抗凝管保存，达到了降低了医疗成本的目的，即取即测，提高检验工作效率；且由于待测样本的血液需求量变小，将静脉血更换为末梢血，降低了患者采血痛苦，克服部分患者(如婴幼儿等)血量不足、取样困难等采血过程中遇到的问题；进一步的，本试剂盒检测降钙素原，采血简单快捷，无需抗凝保存，医疗成本降低，有效减少了社会资源浪费。

本实用新型的荧光免疫层析试剂盒的工作原理为：采用荧光免疫层析技术及双抗体夹心法原理定量检测样品(全血、血清或血浆)中的末梢血降钙素原(PCT)的含量。检测时，将样品在第一容器内与荧光微球标记物相结合，在滴加到加样孔中，沿着硝酸纤维素膜向吸水垫方向毛细运动，分别流经硝酸纤维素膜上的定量带及质控带。若样品中含有末梢血降钙素原(PCT)，则与被荧光微球标记的末梢血降钙素原(PCT)抗体相结合，当层析至检测线时，会被预先包被于该条带的捕获抗体所捕获，从而构成双抗体夹心复合物。采用特定波长的光源激发下，采用荧光定量仪可获取检测线和质控线的荧光信号强度，依据荧光定量仪获取的标准曲线，进而可分析出样品中含有PCT的浓度。

以上所述，仅是本实用新型的较佳实施例而已，并非对本实用新型作任何形式上的限制，依据本实用新型的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本实用新型技术方案的范围内。