基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用的制作方法

本发明涉及一种电化学发光传感器及其检测方法，尤其是涉及基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。

背景技术：

组蛋白乙酰化转移酶(hat)是一种典型的的生物酶，它通过将乙酰辅酶a上的乙酰基转移至底物组蛋白或者非组蛋白底物多肽的特定赖氨酸残基上，达到调节染色体结构进而调控基因的表达的目的。组蛋白乙酰化功能紊乱或者乙酰转移酶的异常作用与一系列疾病有关，如癌症、代谢综合征和神经失调等。测定hat活性和它们抑制剂的效力将大大有助于基因转录的生化研究以及抗癌剂的药物发现。通过抗体识别和酶联免疫的方法对hat进行检测的工作最为典型，如基于多肽连接的量子点以及乙酰基特异性抗体的荧光检测方法和抗体介导的金纳米粒子的比色分析方法等。这些方法虽然具有一定的优势，但是它们还是存在一些内在的缺点，如不同批次之间抗体的差异以及昂贵的抗体标记等。

dna是遗传信息的载体，携带着引导生物发育与生命机能运作的遗传指令，主要功能是储存遗传信息，所以被誉为生命的“蓝图”。随着dna纳米技术飞速发展，很多研究者可以利用dna分子自身的识别性质自下而上可控地构建一些精美的dna纳米结构。goodman等利用4条单链dna成功地构建了dna四面体结构，并尝试用这些合成的dna四面体研究药物输运控释体系。2010年，樊春海等发现，巯基四面体可组装到金电极的表面，作为电化学的载体，发展了dna分子传感、免疫传感、核酸适体传感等电化学传感器。研究表明，dna四面体有良好刚性结构和稳定性，修饰过程中能避免单链的探针间互相缠绕，不需要采用巯基乙醇等小分子来封闭电极，并能较好地“立”在修饰电极表面。他们还发现这种电极有较好的抵抗蛋白质吸附的能力，对于酶放大生物传感器的研制有很大优势。最有意思的是dna纳米结构能够使电极表面保持类似溶液相性质，这能提高dna纳米结构悬挂端与目标dna的结合能力。由于这种dna纳米结构具有很多特别的性质，如高稳定性、良好抵抗蛋白质吸附能力和核酸强结合能力，尤其这是一种均一的可控纳米界面，能够极大地提高目标分子与传感界面探针间的结合能力。

本发明构建了一种新型电化学发光生物传感器，检测组蛋白乙酰转移酶(以hatp300为例)活性。该传感器构建过程中，合成了dna三棱柱结构(prism)，该dna三棱柱底端有3个巯基，这使得prism能够稳固地吸附在金电极表面，再利用三个悬挂端捕捉“辅酶a(coa)-适配体-辅助dna(cdna)”体系释放出来的cdna，依次反复打开两条发卡dna，通过杂交链反应(hcr)形成长的dna阶梯，通过嵌入电化学发光体，产生电化学发光信号，构建了一种新型的hatp300电化学发光生物传感器。目前国内外未见联合prism、hcr扩增技术和coa适配体构建hatp300电化学发光传感器的相关报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，具体步骤如下：

(1)hat-适配体反应

①乙酰化反应：分别取hatp300(100～1200nm，0.1～1.2μl)与多肽(0.5～1.5mm，0.1～1.2μl)，乙酰辅酶a(0.5～1.5mm，0.5～1.5μl)在磷酸缓冲溶液中(pbs，10mm，ph7.0)充分混合，总体积1～5μl。将反应液置于28～38℃恒温水浴锅中孵育25～55min；②向①中溶液加入coa适配体(0.5～3.5μl，0.5～1.5μm)振荡混合均匀，28～38℃水浴反应0.5～3.5h；③向②中加入cdna(0.5～3.5μl，0.5～1.5μm)振荡混合均匀，总体积5～10μl，28～38℃水浴反应0.5～1.5h，备用。

(2)电化学发光传感器的制备

a.au电极

金电极(au)使用前分别用直径为0.3μm和0.05μm的al2o3粉末进行打磨，利用超纯水通过超声清洗3次，之后置于氮气流中干燥，再将其浸泡于0.1mh2so4溶液中，在-0.3v～+1.2v范围内进行循环伏安扫描5～30min，最后再经超纯水清洗后氮气吹干备用。

b.prism/au电极

将2～12μl合成的prism滴涂于处理好的au表面反应4～12h，通过au-s键固定dnaprism的自组装单分子层，随后蒸馏水缓缓冲洗电极。

c.cdna/prism/au电极

将(1)中溶液2～12μl滴涂于prism/au电极上，28～38℃下静置40～80min，随后蒸馏水缓缓冲洗电极。

d.h1-h2/cdna/prism/au电极

h1(1～5μl，2～6μm)和h2(1～5μl，2～6μm)混合均匀加热至90～100℃，1～5min，立即在冰上冷却1～5min，滴涂于cdna/prism/au电极表面，室温下静置1～3h，随后蒸馏水缓缓冲洗电极。

e.ru/h1-h2/cdna/prism/au电极

取发光体ru(2.5～7.5μl，5～15mm)滴涂于h1-h2/cdna/prism/au电极，4℃冰箱存放过夜，随后缓缓冲洗电极，之后用于电化学发光检测。

步骤(2)中使用的prism(分别将形成prism的三条链标记为l3，sa和sb)的合成步骤如下：①将l3(0.1～1.5μm，5～15μl)，sa(0.1～1.5μm，10～50μl)，10×tae/mg²⁺(2～10μl)和三(2-羧乙基)膦(tcep)(10～50mm，1～5μl)混合，加二次蒸馏水至总体积20～100μl，混匀，退火；②将l3(0.1～1.5μm，5～15μl)，sb(0.1～1.5μm，10～50μl)和10×tae/mg²⁺(2～10μl)混合，加二次蒸馏水至总体积20～100μl，混匀，退火；③按照1∶1的比例混匀①和②溶液，进行退火组装，退火。

10×tae/mg²⁺的组成：40mm三羟甲基氨基甲烷(tris)，20mm醋酸，2mm乙二胺四乙酸(edta)以及12.5mmmg²⁺，ph为7.4。

prism合成步骤中退火条件为：95℃，5min；65℃，30min；50℃，30min；37℃，30min；22℃，30min；4℃，30min；hold，4℃。

在乙酰化反应中，改变p300浓度，探究其对电化学发光信号的影响。所述的电化学参数条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0.25s；脉冲间隔：30s；初始电压：-1.5v；脉冲电压：-1.5v。

发明原理：利用上述基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，采用三条dna链作为原料，经过退火杂交能够形成prism，该结构一个底面含有3个巯基，可以通过au-s相互作用修饰到金电极表面，另一个底面还有3个悬挂端，可以通过碱基互补配对原则捕获cdna(部分能与适配体或dna纳米三棱柱的悬挂端杂交，部分能作为hcr反应的引物链)，达到检测目的。乙酰化反应过程中，随着p300浓度变大，生成的coa的量增多，可以释放出更多的cdna参与hcr反应，增加发光体的负载量。显然，在浓度一定范围内，目标物浓度越大，电流响应越明显。实验结果表明，电流的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测。其优点在于：

(1)高灵敏度。实验得出传感器的电化学发光响应对p300浓度对数值的线性相关方程为y＝2867lgcp300+5818，r²＝0.9971，线性范围为0.01～100nm，检测限为2.6pm，由此说明传感器对p300可实现高灵敏检测。

(2)高特异性。常见其他相关酶对本检测体系均无干扰。原因在于：本发明是基于p300催化乙酰化反应生成coa，生成coa的量影响到发光体的插入，其他酶无法催化乙酰化反应，故对本检测体系无干扰。

(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。

(4)抑制剂。利用该电化学发光生物传感器对插入发光体的电化学发光响应，实现对hatp300抑制剂(如漆树酸、c646)的检测，可以得出传感器的电化学发光响应与hatp300抑制剂的相关关系。

(5)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。

综上所述，本发明制备基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度hatp300的检测及其小分子抑制剂的筛选，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明传感器的可行性实验图；

图2为本发明传感器对有无p300的电化学发光响应；

图3为本发明传感器对不同浓度p300的电化学发光响应对p300浓度的对数校准曲线图；

图4为不同浓度漆树酸对p300活性的抑制作用；

图5为不同浓度c646对p300活性的抑制作用；

图6为本发明传感器的选择性实验图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1传感器的制备

(1)hat-适配体反应

①乙酰化反应：分别取hatp300(1000nm，0.2μl)与多肽(1mm，0.4μl)，乙酰辅酶a(1mm，1μl)在磷酸缓冲溶液中(pbs，10mm，ph7.0)充分混合，总体积2μl。将反应液置于30℃恒温水浴锅中孵育30min；②向①中溶液加入coa适配体(2μl，1.25μm)振荡混合均匀，30℃水浴反应2h；③向②中加入cdna(2μl，1.25μm)振荡混合均匀，总体积6μl，30℃水浴反应1h，备用。

(2)电化学发光传感器的制备

a.au电极

金电极(au)使用前分别用直径为0.3μm和0.05μm的al2o3粉末进行打磨，利用超纯水通过超声清洗3次，之后置于氮气流中干燥，再将其浸泡于0.1mh2so4溶液中，在-0.3v～+1.2v范围内进行循环伏安扫描10min，最后再经超纯水清洗后氮气吹干备用。

b.prism/au电极

将10μl合成的prism滴涂于处理好的au表面反应4h，通过au-s键固定prism的自组装单分子层，随后蒸馏水缓缓冲洗电极。

c.cdna/prism/au电极

将(1)中溶液10μl滴涂于prism/au电极上，30℃下静置60min，随后蒸馏水缓缓冲洗电极。

d.h1-h2/cdna/prism/au电极

h1(2.5μl，4μm)和h2(2.5μl，4μm)混合均匀加热至96℃，3min，立即在冰上冷却3min，滴涂于cdna/prism/au电极表面，室温下静置2h，随后蒸馏水缓缓冲洗电极。

e.ru/h1-h2/cdna/prism/au电极

取发光体ru(5μl，10mm)滴涂于h1-h2/cdna/prism/au电极，4℃冰箱存放过夜，随后缓缓冲洗电极，之后用于电化学发光检测。

步骤(2)中使用的prism(分别将形成prism的三条链标记为l3，sa和sb)的合成步骤如下：①将l3(1.18μm，10μl)，sa(1.21μm，29.2μl)，10×tae/mg²⁺(5.9μl)和tcep(30mm，3μl)混合，加二次蒸馏水至总体积59μl，混匀，退火；②将l3(1.18μm，10μl)，sb(1.1μm，32.2μl)和10×tae/mg²⁺(5.9μl)混合，加二次蒸馏水至总体积59μl，混匀，退火；③按照1∶1的比例混匀①和②溶液，进行退火组装，退火。

检测制备的五种电极对pbs(0.1m，ph7.0)电解质溶液的电化学发光响应，见图1。可看出制备的传感器e相比较于其他四种电极，电化学响应很明显。

实施例2有无p300的电化学发光响应

基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，基于实施例1制备我们的生物传感器。见图2，无p300时，传感器在pbs(0.1m，ph7.0)中基本无电化学发光响应，而在p300存在时，存在明显的电化学发光响应，证明该传感器可用于p300活性检测。

实施例3p300活性检测

基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，传感器的制备步骤同具体实施例1，在乙酰化反应过程中，依次改变p300的浓度，p300的浓度为：0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，100，500nm，随后用于制备传感器。记录传感器在pbs(0.1m，ph7.0)中的电化学发光响应，根据实验结果，获得一系列不同浓度p300对应的电化学响应曲线，建立电化学响应电流大小与p300浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中p300的浓度。实验结果如图3所示，说明随着p300浓度增大，传感器的电化学响应越明显，线性相关方程为y＝2867lgcp300+5818，r²＝0.9971，线性范围为0.01～100nm，检测限为2.6pm，说明传感器对p300活性可实现高灵敏检测。

实施例4p300抑制剂漆树酸(anacardicacid)的检测

基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，传感器的制备步骤同具体实施例1，在乙酰化反应过程中，p300的浓度为100nm，依次加入不同浓度的抑制剂漆树酸，漆树酸浓度为0，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200，500μm，随后用于制备传感器。记录传感器在pbs(0.1m，ph7.0)中的电化学发光响应。根据实验结果得知(如图4)，随着抑制剂漆树酸浓度的增大，相对应的电流响应越弱，说明漆树酸对p300活性的抑制作用越强，半抑制浓度为2.90μm。

实施例5p300抑制剂c646的检测

基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，传感器的制备步骤同具体实施例1，在乙酰化反应过程中，p300的浓度为100nm，依次加入不同浓度的抑制剂c646，c646浓度为0，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200μm，随后用于制备传感器。记录传感器在pbs(0.1m，ph7.0)中的电化学发光响应。根据实验结果得知(如图5)，随着抑制剂c646浓度的增大，相对应的电流响应越弱，说明c646对p300活性的抑制作用越强，半抑制浓度为1.27μm。

实施例6特异性检测

选择性实验中p300及其他酶的浓度均为100nm，所用到的其他酶的缩写如下：乙酰胆碱酯酶(ache)、胆碱氧化酶(chox)、溶菌酶(lzm)、蛋白激酶(pka)、木瓜蛋白酶(papain)、碱性磷酸酶(alp)。按上述实施例1的传感器制备步骤，乙酰化反应中，用其他相同浓度的酶代替p300，制备得到传感器。结果如图6所示，与p300对比，传感器对其他酶的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于p300的检测有很好的选择性。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。