一种纸芯片适配体传感器及其制备方法与流程

本公开涉及一种纸芯片适配体传感器及其制备方法。

背景技术：

核酸适配体是一小段经过体外筛选得到的寡合苷酸序列，可与靶分子结合，并显示出非常高的亲和力。相较于抗体，适配体成本低廉；无免疫特性，室温下即可保存；受体范围广，除抗原外，还可用于小分子、蛋白质、抗生素、多肽、细胞、致病菌、病毒等的检测。因此，基于适配体-抗原特异性结合原理制备的适配体传感器具有低成本、高稳定性、高检测灵敏度和选择性等优点。

微流控纸芯片是在纸张上建立的一种新兴的微流控分析技术平台，具有成本低、生物兼容性好、制备工艺成熟和可便携式使用等优点，在临床诊断、环境监控以及食品安全分析等领域具有很大的应用前景。纸芯片与免标记电化学快速检测方法结合，提供了一种即时诊断的检测平台。纳米材料修饰的电极具有更大的比表面积、更高的催化活性和更快的电子传递能力，并具有在电极表面调控局部环境的能力，从而被广泛应用于电化学生物传感器中。

生长因子受体家族(egfr、her2，her3，her4)的过表达及egfr的19外显子缺失型突变和21外显子l858r型突变的检测在对临床治疗具有重要的意义，对于其检测面临着快速、低成本以及便携式检测等挑战。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

本公开提供了一种纸芯片适配体传感器及其制备方法，至少解决以上技术问题。

(二)技术方案

本公开提供了一种纸芯片适配体传感器，包括：四层滤纸，自上往下依次为第一层滤纸、第二层滤纸、第三层滤纸和第四层滤纸；微流控沟道，设置在所述第一层滤纸和第三层滤纸上；过滤膜，设置在所述第一层滤纸、第二层滤纸和第三层滤纸上，并与所述微流控沟道连通；反应区，设置在所述第三层滤纸上，并与所述第三层滤纸上的微流控沟道连通；对电极和参比电极，均设置在所述第二层滤纸上，并位于所述反应区上方；工作电极，设置在所述第四层滤纸上，并位于所述反应区的下方，其中，所述工作电极表面修饰有纳米复合材料，并固定有适配体。

可选地，所述第一层滤纸的孔隙度为1μm，所述第二层滤纸、第三层滤纸和第四层滤纸的孔隙度为11μm。

可选地，所述对电极的材料为导电炭浆，所述参比电极的材料为导电的银/氯化银浆，所述工作电极的材料为导电炭浆。

可选地，所述对电极和参比电极均为圆弧形，所述工作电极为圆形，所述工作电极的直径为3mm。

可选地，所述对电极、参比电极和工作电极的数量为一个及以上，并且所述对电极、参比电极和工作电极之间一一对应。

可选地，所述适配体为与待检测物质之间亲和力常数最高的适配体。

可选地，所述纳米复合材料的组成为导电材料、电活性物质和纳米金。

可选地，所述导电材料为多壁碳纳米管、氨基化石墨烯或聚3，4乙烯二样噻吩。

可选地，所述电活性物质为硫堇、普鲁士蓝、亚甲基蓝或铁氰化钾。

本公开还提供了一种纸芯片适配体传感器的制备方法，包括：步骤1：根据预设图案在四层滤纸上制备亲水区和疏水区；步骤2：在所述亲水区上制备微流控沟道、过滤膜和反应区；步骤3：分别将对电极、参比电极和工作电极印刷在所述疏水区上；步骤4：制备纳米复合材料，对所述工作电极的表面进行修饰；步骤5：将与待检测物质之间亲和力常数最高的适配体固定在所述工作电极表面的纳米复合材料上；步骤6：对所述工作电极表面的活性位点进行封闭；步骤7：对所述四层滤纸进行集成封装。

(三)有益效果

本公开提供的纸芯片适配体传感器及其制备方法，具有以下有益效果：

(1)采用适配体作为识别元件，适配体制备工艺成熟，从而显著降低传感器的制备成本，与抗体相比，适配体在室温下即可进行长期保存，并且其检测范围更广，从而提高了传感器的稳定性和检测范围，此外，还提高了传感器的检测灵敏度，可以对目标待检测抗原进行痕量检测；

(2)合成新型的纳米复合材料对纸芯片工作电极表面进行修饰，显著提高传感器的性能，提高检测灵敏度；

(3)采用免标记快速电化学检测方法，无需对抗原或适配体进行预标记处理，检测所需样品量低，实现了对目标检待测抗原的即时快速检测；

(4)通过设置多对三电极体系，可以实现多参数同时检测。

附图说明

图1示意性示出了本公开实施例提供的纸芯片适配体传感器的结构示意图。

图2示意性示出了本公开实施例提供的纸芯片适配体传感器的制备方法的流程图。

附图标记说明：

1-微流控沟道；2-过滤膜；3-反应区；4-对电极；5-参比电极；6-工作电极。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

本公开提供的纸芯片适配体传感器及其制备方法，通过喷蜡打印和丝网印刷的方式制备微流控纸芯片，然后合成导电材料/电活性物质/纳米金组成的新型纳米复合材料，并用该纳米复合材料对微流控纸芯片的工作电极进行修饰，以提高电极的导电性能并辅助固定适配体，从而对肿瘤标志物进行高灵敏度地、即时快速地检测。

本公开的第一实施例示出了一种纸芯片适配体传感器的结构。图1示意性示出了本公开实施例提供的纸芯片适配体传感器的结构示意图。如图1所示，本公开实施例中纸芯片适配体传感器包括：四层滤纸、微流控沟道1、过滤膜2、反应区3、对电极4、参比电极5和工作电极6。

以下分别对本公开提供的纸芯片适配体传感器的各个组成部分进行详细的说明。

四层滤纸，自上往下依次为第一层滤纸、第二层滤纸、第三层滤纸和第四层滤纸，其中，第一层滤纸的孔隙度为1μm，第一层滤纸采用较小的孔隙度可以有效过滤待检测样品，第二层滤纸、第三层滤纸和第四层滤纸的孔隙度为11μm。可以理解，这四层滤纸的孔隙度也可以为其它合适的孔隙度。此外，滤纸表面设置有亲水沟道和疏水沟道。

微流控沟道1，设置在第一层滤纸和第三层滤纸上，且微流控沟道1为亲水区。

过滤膜2，设置在第一层滤纸、第二层滤纸和第三层滤纸上，且这三层滤纸上的过滤膜2彼此对准，第一层滤纸上的过滤膜2与第一层滤纸上的微流控沟道1连通，第三层滤纸上的过滤膜2与第三层滤纸上的微流控沟道1连通。过滤膜2为亲水区。

反应区3，设置在第三层滤纸上，并且与第三层滤纸上的微流控沟道1连通，反应区3为亲水区。

对电极4和参比电极5，均设置在第二层滤纸上，并位于反应区3的上方。对电极4为圆弧形，其材料为导电碳浆；参比电极5为圆弧形，其材料为导电的银/氯化银浆。

工作电极6，设置在第四层滤纸上，位于反应区3的下方，其表面修饰有纳米复合材料，并且固定有适配体。工作电极6为圆形，其材料为导电碳浆，其直径优选为3mm。工作电极6直径越小，制备的纸芯片适配体传感器的检测灵敏度越高，但是工作电极能承受的电流也越小，当其直径为3mm时，其灵敏度和承受电流综合性能最佳，因此，可以理解，工作电极6的直径也可以为其他值。

纳米复合材料的组成为导电材料、电活性物质和纳米金，其中，导电材料包括但不限于多壁碳纳米管、氨基化石墨烯或聚3，4乙烯二样噻吩，电活性物质包括但不限于硫堇、普鲁士蓝、亚甲基蓝或铁氰化钾。适配体为与待检测物质之间亲和力常数最高的适配体，即与待检测物质特异性结合最好。该适配体包括但不限于核酸适配体(包括dna适配体和rna适配体)。

对电极4、参比电极5和工作电极6组成电化学三电极体系，它们之间一一对应，并且其数量为一个及以上，以同时对多参数进行检测，如图1所示，形成了两套电化学三电极体系。

待检测物质的样品由侧端进样孔流入器件，流经微流控沟道1和过滤膜2，完成样品过滤后到达反应区3，在电化学三电极体系中，样品与工作电极6表面固定的适配体发生反应。检测过程中，样品由侧端进入，保证了检测样品量的稳定性和操作的简便性，同时集成了样品处理功能，能够对检测样品进行自动过滤。

本公开中的纸芯片适配体传感器，其检测范围包括但不限于肿瘤标志物，还可进行其它小分子、蛋白质、多肽、细胞、病毒等的检测。

本公开的第二实施例示出了一种纸芯片适配体传感器的制备方法。图2示意性示出了本公开实施例提供的纸芯片适配体传感器的制备方法的流程图。如图2所示，该制备方法包括：

步骤1：根据预设图案在四层滤纸上制备亲水区和疏水区。

首先，通过电脑绘图软件，对微流控纸芯片的结构进行设计，包括微流控沟道1、过滤膜2、反应区3和三电极体系的结构，该结构设计即为预设图案。设计的微流控纸芯片具有四层结构。

其次，将a1幅面的滤纸裁剪成a4幅面的滤纸，采用喷蜡打印机将微流控沟道1、过滤膜2和反应区3的图形印刷到滤纸表面。

然后，将喷蜡打印后的滤纸放入烘箱内，120℃温度下烘烤3min，使滤纸表面的蜡融化渗透进滤纸内部，从而将喷蜡区域变为疏水区，而未喷蜡区域为亲水区。通过精确控制加热的温度和时间，可以精确控制纸芯片亲水区和疏水区面积大小。

步骤2：在亲水区上制备微流控沟道1、过滤膜2和反应区3。

根据预设图案，在滤纸的亲水区制备微流控沟道1、过滤膜2和反应区3，其中，过滤膜2设置在第一层滤纸、第二层滤纸和第三层滤纸上，反应区3设置在第三层滤纸上，微流控沟道1设置在第一层滤纸和第三层滤纸上，并通过微流控沟道1连通过滤膜2和反应区3，待检测样品通过第一层滤纸上的微流控沟道1流入过滤膜2，经过滤膜2过滤后，经第三层滤纸上的微流控沟道1到达反应区3。

步骤3：分别将对电极4、参比电极5和工作电极6印刷在疏水区上。

采用丝网印刷技术，将对电极4、参比电极5和工作电极6印刷分别印刷到滤纸表面的疏水区上。其中，对电极4材料为导电碳浆，参比电极5材料为导电的银/氯化银奖，工作电极6材料为导电碳浆；对电极4和参比电极5印刷在第二层滤纸表面，工作电极6印刷在第四层滤纸表面。

步骤4：制备纳米复合材料，对工作电极6的表面进行修饰。

新型的纳米复合材料的具体组成为电材料/电活性物质/纳米金复合物，其中，导电材料包括但不限于碳纳米材料(石墨烯、多壁碳纳米管)和导电聚合物，电活性物质包括但不限于硫堇、普鲁士蓝、亚甲基蓝。

步骤5：将与待检测物质之间亲和力常数最高的适配体固定在工作电极6表面的纳米复合材料上。

在步骤5中，通过指数富集的配基系统进化技术，筛选得到与待检测物质特异性结合最好的核酸适配体，并在核酸适配体的5’端修饰巯基，通过金-硫键的作用，将适配体固定在工作电极6表面的纳米金粒子上。

步骤6：对工作电极6表面的活性位点进行封闭。

在步骤6中，使用巯基乙醇溶液对工作电极6表面的活性位点进行封闭，即对工作电极6周围的空隙进行物理封闭，以提高工作电极6的选择性。至此，形成四层纸芯片。

步骤7：对四层滤纸进行集成封装。

在步骤7中，通过刻绘机对双面胶进行刻绘，利用双面胶将上述四层纸芯片集成封装在一起，以便于检测。

本公开的第三实施例示出了一种同时检测egfr和her2的纸芯片适配体传感器。

新型的肿瘤标志物egfr和her2的联合检测在肺癌检测过程中的准确性和特异性都较高，因此，选取egfr和her2进行双参数联合检测。其操作流程包括：

步骤1-步骤3与第二实施例中的步骤1-步骤3相同，这里不再赘述。

步骤4：对于本实施例中的双参数检测，需要对两个工作电极6的表面进行修饰。包括以下操作：

(1)合成纳米复合材料氨基化石墨烯/硫堇/纳米金溶液，对其中一个工作电极6的表面进行修饰，从而提升工作电极6的导电能力并固定egfr野生型蛋白适配体到工作电极6表面。具体地，取2mg氨基化石墨烯，溶解到2ml水溶液中，取2ml浓度为1mg/ml的氨基化石墨烯溶液和2ml浓度为2mg/ml的硫堇溶液溶液混合，激烈搅拌24h后通过离心去除未结合的硫堇分子；取200μl上述混合液与1ml粒径为15nm的纳米金溶液混合，激烈搅拌12h，通过离心从而制备得到氨基化石墨烯/硫堇/纳米金复合物；取10μl制备得到的氨基化石墨烯/硫堇/纳米金混合溶液滴涂到纸芯片工作电极6的表面。

(2)合成聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝/纳米金溶液，对其中另一个工作电极6的表面进行修饰，从而提升工作电极6的导电能力并固定her2适配体到工作电极6表面。具体地，取50μl的3，4乙烯二氧噻吩溶解于5ml乙醇溶液中，加入25ml浓度为0.1m的盐酸溶液，搅拌形成稳定溶液；同时，在超声状态下，取13.2mg铁氰化钾和10.8mg氯化铁溶解于10ml浓度为0.1m的盐酸溶液；将上述两种溶液混合，激烈搅拌，制得聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝混合液；取10ml粒径为15nm的纳米金溶液与2ml上述混合液，搅拌12h，通过离心从而制备得到聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝/纳米金复合物；取10μl制备得到的聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝/纳米金混合溶液滴涂到该另一个纸芯片工作电极6的表面。

步骤5：对于本实施例中的双参数检测，通过指数富集的配基系统进化技术，分别筛选得到与egfr野生型蛋白和her2特异性结合最好的核酸适配体，并在核酸适配体的5’端修饰巯基，分别将这两种适配体固定在工作电极6表面的纳米复合材料上。包括以下操作：

(1)取10μl浓度为28μg/ml的egfr野生型蛋白适配体到工作电极6表面，在4℃条件下放置6h，用于结合适配体。其中，该工作电极6表面修饰有聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝/纳米金溶液。

(2)取10μl浓度为10μm的her2适配体到作电极6表面，在4℃条件下放置6h，用于结合适配体。其中，该工作电极6表面修饰有聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝/纳米金溶液。

步骤6：在室温下，利用10μl浓度为1％的巯基乙醇溶液，用于覆盖这两个工作电极6中其余的活性位点。

步骤7：对四层纸芯片进行集成封装，纸芯片适配体传感器制备完成。

利用该纸芯片适配体传感器，对肿瘤标志物egfr和her2同时进行检测，具体为：取10μl临床血清溶液，由侧端进样孔经微流控沟道1流入传感器，经过滤膜2过滤后到达反应区3，在室温下静置20min，使得待检测抗原与工作电极6表面的适配体充分结合，然后通过后端接口将上述纸芯片适配体传感器与电化学工作站连接，采用差分脉冲伏安法，对工作电极6进行测试扫描，根据电流峰值的变化量，即可获得待测样品中egfr和her2的浓度。

本公开的第四实施例示出了一种同时检测egfr第19外显子缺失型突变和第21外显子l858r型突变的纸芯片适配体传感器。

表皮生长因子受体egfr是上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。对egfr基因突变的检测可以指导临床用药，预测病情发展，对临床医生具有重要的指导意义。egfr酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18～21外显子，其中19外显子和21外显子突变占突变总数的90％，因此，检测egfr第19外显子缺失型突变和第21外显子l858r型突变对肺癌患者的靶向治疗具有重要的意义。其操作流程包括：

步骤1-步骤3与第二实施例中的步骤1-步骤3相同，这里不再赘述。

步骤4：对于本实施例中的双参数检测，需要对两个工作电极6的表面进行修饰。包括以下操作：

(1)合成纳米复合材料多壁碳纳米管/硫堇/纳米金溶液，对其中一个工作电极6的表面进行修饰，从而提升工作电极6的导电能力并固定egfr第19外显子缺失型突变适配体到工作电极6表面。具体地，取2mg多壁碳纳米管，溶解到20ml聚醚酰亚胺水溶液中，取2ml浓度为1mg/ml的多壁碳纳米管的分散液和2ml浓度为2mg/ml的硫堇溶液溶液混合，激烈搅拌24h后通过离心去除未结合的硫堇分子；取200μl上述混合液与1ml粒径为15nm的纳米金溶液混合，激烈搅拌12h，通过离心从而制备得到多壁碳纳米管/硫堇/纳米金复合物；取10μl制备得到的多壁碳纳米管/硫堇/纳米金混合溶液滴涂到纸芯片工作电极6的表面。

(2)合成聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝/纳米金溶液，对其中另一个工作电极6的表面进行修饰，从而提升工作电极6的导电能力并固定egfr第21外显子l858r型突变适配体到工作电极6表面。具体地，取50μl的3，4乙烯二氧噻吩溶解于5ml乙醇溶液中，加入25ml浓度为0.1m的盐酸溶液，搅拌形成稳定溶液；同时，在超声状态下，取13.2mg铁氰化钾和10.8mg氯化铁溶解于10ml浓度为0.1m的盐酸溶液；将上述两种溶液混合，激烈搅拌，制得聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝混合液；取10ml粒径为15nm的纳米金溶液与2ml上述混合液，搅拌12h，通过离心从而制备得到聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝/纳米金复合物；取10μl制备得到的聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝/纳米金混合溶液滴涂到该另一个纸芯片工作电极6的表面。

步骤5：对于本实施例中的双参数检测，通过指数富集的配基系统进化技术，分别筛选得到与egfr发生第19外显子缺失型突变和第21外显子l858r型突变后特异性结合最好的核酸适配体，并在核酸适配体的5’端修饰巯基，分别将这两种适配体固定在工作电极6表面的纳米复合材料上。包括以下操作：

(1)取10μl浓度为10μm的egfr第19外显子缺失型突变适配体到电极表面，在4℃条件下放置6h，用于结合适配体。其中，该工作电极6表面修饰有多壁碳纳米管/硫堇/纳米金溶液。

(2)取10μl浓度为10μm的egfr第21外显子l858r型突变适配体到电极表面，在4℃条件下放置6h，用于结合适配体。其中，该工作电极6表面修饰有聚3，4乙烯二氧噻吩/普鲁士蓝/纳米金溶液。

步骤6：在室温下，利用10μl浓度为1％的巯基乙醇溶液，用于覆盖这两个工作电极6中其余的活性位点。

步骤7：对四层纸芯片进行集成封装，纸芯片适配体传感器制备完成。

利用该纸芯片适配体传感器，对肿瘤标志物egfr第19外显子缺失型突变和第21外显子l858r型突变同时进行检测，具体为：取10μl临床血清溶液，由侧端进样孔经微流控沟道1流入传感器，经过滤膜2过滤后到达反应区3，在室温下静置20min，使得待检测抗原与工作电极6表面的适配体充分结合，然后通过后端接口将上述纸芯片适配体传感器与电化学工作站连接，采用差分脉冲伏安法，对工作电极6进行测试扫描，根据电流峰值的变化量，即可获得待测样品中egfr第19外显子缺失型突变和第21外显子l858r型突变的程度。

还需要说明的是，实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向，并非用来限制本公开的保护范围。贯穿附图，相同的元素由相同或相近的附图标记来表示。在可能导致对本公开的理解造成混淆时，将省略常规结构或构造。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。