一种抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒及其制备方法、操作方法和应用与流程

本发明属于生物医学检验领域，更具体地说，本发明涉及一种抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒及其制备方法、操作方法和应用。

背景技术：

肿瘤早期诊断和早期治疗是提高肿瘤治愈率的关键。恶性肿瘤患者普遍存在氨基酸代谢异常的现象，即蛋白质分解为氨基酸的过程增强，而氨基酸的分解代谢则减弱，多余而无法利用的氨基酸则排出体外。氨基酸代谢异常在肿瘤发生早期就存在，其中一个重要表现是尿液中对羟基苯丙氨酸(酪氨酸)的含量升高。肿瘤细胞代谢越活跃，氨基酸代谢异常越显著，酪氨酸含量升高越明显。临床研究表明，几乎所有恶性肿瘤病人尿液中的酪氨酸含量明显升高的结果。因此，基于单羟酚类物质的尿液检测试剂在原发肿瘤的发现、肿瘤高危人群的筛选、肿瘤治疗效果的观察和评价等方面具有重要的临床参考价值。中国专利《对羟基苯丙氨酸尿液检测试剂及其制备方法》(zl201310247724.1)、《一种恶性乳腺疾病筛查尿检试剂及其应用》(zl200710049244.9)中都有这方面的报道。

目前，含单羟酚类物质的尿液检测试剂的制备都是以米伦(millon)反应原理为基础。米伦试剂是用浓硝酸与汞反应来制备，在反应中生成硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和少量的亚硝酸等物质。它可与含酚羟基氨基酸衍生物产生颜色反应。一般认为，米伦显色反应是由一系列较为复杂的反应构成，其中主要有汞盐参与的酚的亚硝基化反应、经互变异构后成为颜色更深的邻醌肟物质的反应和形成红色稳定含汞配合物的反应等，如下式一所示。

米伦(millon)试剂对单羟酚类物质的检测有着很高的灵敏度，故在生物医学检测领域具有重要的应用价值。但米伦试剂在临床上的应用也存在非常明显的缺陷，这就是临床尿样成分物质中的尿素和蛋白质量均可干扰米伦反应，可以造成临床阳性尿液的漏检，而且这个问题未被人们注意到。

众所周知，尿液成分物质除了大量的水之外，主要是尿素和蛋白质，而其中的尿素可与亚硝酸反应生成氮气，消耗米伦试剂中的亚硝酸；蛋白质可与汞盐生成沉淀，而汞盐是催化和显色反应的必须物质。由于尿样的复杂性，其成分含量是波动起伏的。当尿样中尿素含量较低时，它的影响小或不影响单羟酚类物质的亚硝基化反应，显色反应基本正常或正常，可获得正确的阳性检测结果；但当尿样中尿素含量较高时，即可影响酚类物质的亚硝基化反应，使米伦反应不正常甚至不显色，造成阳性样品的漏检。同样，蛋白质含量较高时，也可因消耗汞盐而干扰米伦反应，影响催化反应和显色反应，也可以造成临床阳性尿液的漏检。

米伦试剂的制备较为繁琐和存在着污染，一般难以“现制现用”。目前主要采用尿检试剂方式，即预先制备、装入安瓿瓶保存、待临床检测时开瓶使用的方式。这样以来，除了上述尿样中干扰物质影响外，还增加了尿检试剂因制备、放置分解的新问题，即因其中的亚硝酸极不稳定，只能存在于稀溶液中，且易于分解，使试剂不稳定的问题。因此，当前临床尿检试剂存在明显的不足，因不能抵抗尿液成分物质的干扰和试剂不稳定，而造成临床阳性尿液的漏检，使尿检的临床意义大大降低。

基于上述理由，提出本申请。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的缺点和不足，提供一种抗尿液成分干扰的单羟酚类物质的尿检试剂盒及其制备方法、操作方法和应用。本发明提出了抗尿液成分物质干扰的尿检试剂新思路，通过添加新物质cuso4、nano2和相应的操作，分别排除了尿液中蛋白质、尿素对米伦反应的干扰，保证了米伦反应(系列)的正常进行，并提高了显色反应的色度和速度，保证了尿检试剂对含酚羟基氨基酸衍生物检测的有效性和客观性。同时，减少了医学检验废弃物的毒性及污染。

为了实现本发明的第一个目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒，所述试剂盒由主瓶(安瓿瓶)试剂和副瓶(塑料瓶)试剂构成，其中：所述主瓶试剂由汞、浓硝酸、硫酸铜和蒸馏水为原料制得，所述副瓶试剂由亚硝酸钠和蒸馏水组成。

进一步，上述技术方案，所述主瓶试剂由如下质量份的各原料制得：按质量份数计，汞1份，浓硝酸2.4～3.6份，蒸馏水12～16份，硫酸铜1.5份。

优选地，上述技术方案，所述硫酸铜优选为五水硫酸铜。

进一步，上述技术方案，所述副瓶试剂按质量份数计，由1份亚硝酸钠、6～8份蒸馏水组成。

进一步，上述技术方案，所述主瓶试剂与副瓶试剂的体积比为1：0.2～1，更优选为1：0.5～0.7。

本发明的第二个目的在于提供上述所述抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)a溶液的制备：按质量份数，称取1份汞和2.4～3.6份浓硝酸，搅拌混合均匀后升温至30～50℃恒温反应50～120min；反应结束后冷却至室温，然后向反应体系中加入12～16份蒸馏水和1.5份硫酸铜，继续搅拌至充分溶解，即配制成a溶液；

(2)b溶液的配制：按质量份数，称取1份亚硝酸钠，完全溶解于6～8份蒸馏水中，即配制成b溶液；

(3)将步骤(1)所得a溶液分装到灭菌过的安瓿瓶中，每瓶1ml，压盖密封，获得主瓶试剂；将步骤(2)所得b溶液分装到灭菌过的塑料瓶中，每瓶0.5～0.7ml，压盖密封，获得副瓶试剂。

本发明的第三个目的在于提供上述所述抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒的操作方法，具体如下：

打开主瓶，向主瓶试剂中滴入1～3ml尿液样品，摇匀；然后打开副瓶，将副瓶试剂滴入到主瓶内，继续混合摇均后静置15～25min，观察沉淀和上清液颜色，对照色标卡判定结果。

进一步，上述技术方案，所述尿液样品加入量优选为2ml。

本发明的第四个目的在于提供上述所述抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒的应用。

本发明上述所述的抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒可用于制备肿瘤或癌症早期筛查检测试剂。

本发明以汞、浓硝酸、硫酸铜和亚硝酸钠为原料，经化学反应和溶液配制，制得抗尿液成分物质干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒。

本发明原理如下：

本发明提出了通过新的化学物质配合米伦试剂，改变米伦显色反应机制和保障显色反应关键条件，排除尿液成分物质尿素和蛋白质干扰的新方法。在新方法中，通过新物质cuso4改变了显色反应机制，利用cu²⁺能与邻醌肟物质形成更稳定、砖红色更深的含铜配位化合物来发生显色反应，替代了汞盐参与的显色反应，使汞盐主要在米伦反应中发挥其催化作用，降低了后续显色反应对汞盐含量的依赖，避免了因蛋白质消耗使汞盐量不足而导致的弱显色或不显色，即阳性漏检结果；还因含铜配位化合物颜色的加深及显色加快(本试剂在～20℃下，5min即可明显显色)而提高了显色反应的显示度及效率。由于汞盐主要仅发挥其催化作用，故其用量可相对减少，降低了医疗废弃物的毒性和污染。同时，通过副瓶中的新物质nano2与主瓶试剂中强酸生成的hno2补充了尿液中尿素对试剂中关键物质hno2的消耗，使单羟酚类物质的亚硝化反应充分完全，确保了后续显色反应的顺利进行；副瓶分装nano2的方法避免了hno2的挥发和分解，保证了本试剂盒的稳定性。本发明丰富了米伦反应原理在医学检验中应用的理论基础，从根本上解决了米伦试剂在临床应用中易于受到尿液成分干扰的难题。

与现有技术相比，本发明涉及的一种抗尿液成分干扰的单羟酚类物质的尿检试剂盒及其制备方法、操作方法和应用具有以下优点和有益效果：

(1)本发明尿检试剂盒具有抵抗临床尿样成分物质尿素和蛋白质干扰的功能，同时稳定性高，使尿检试剂对各种临床尿样的适用程度增大，提高了尿检的有效性和客观性，可避免临床阳性样品因尿样成分尿素和蛋白质干扰的漏检。

(2)本发明尿检试剂盒的显色反应时间缩短，生成的配合物的砖红色色度加深，提高了尿检工作的效率和显色的灵敏度。

(3)本发明试剂盒降低了汞盐的用量，减少了医学检验废弃物的毒性及污染。

(4)本发明丰富、完善了米伦反应原理在医学检验中应用的理论基础，从根本上解决了米伦试剂在临床应用的难题。

(5)与传统的制备方法相比，本发明具有抗尿样成分物质尿素和蛋白质干扰、显色反应时间短，显色变化明显，稳定性高和污染减少等优点，可显著降低尿样阳性漏检率。大大提高了尿检试剂在临床早期亚健康及癌症排查中的应用价值。

附图说明

图1为4例尿检试剂检测结果对比照片(其中a：健康样本；b,c,d：癌症样本)，图中左侧为本试剂检测结果，右侧为对比试剂检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

实施例1

本实施例的一种抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒，所述试剂盒由主瓶(安瓿瓶)试剂和副瓶(塑料瓶)试剂构成；

其中：按质量份数计，所述主瓶试剂由1份汞、2.4份浓硝酸、1.5份五水硫酸铜硫酸铜和13份蒸馏水制得，所述副瓶试剂由1份亚硝酸钠和6份蒸馏水组成；所述主瓶试剂与副瓶试剂的体积比为1：0.5。

本实施例上述所述抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒采用如下方法制得，步骤如下：

(1)在150ml烧杯中加入1份汞和2.4份浓硝酸，搅拌均匀后升温至50℃反应50min，此时体系为透明均匀溶液，停止加热，待温度降至室温后，加入13份蒸馏水和1.5份五水硫酸铜充分搅拌溶解，即制备成a溶液(淡蓝色)。

(2)在另一50ml烧杯中加入称取好的1份亚硝酸钠，并溶解于6份蒸馏水中，即配制成b溶液。

试剂盒使用方法：于安瓿瓶中加入1ml步骤(1)所得a溶液，然后加入2ml待检新鲜晨尿尿样，摇动混合；再加入步骤(2)所得0.5mlb溶液，摇动混合，此时有许多气泡产生(为尿样中的尿素与亚硝酸反应生成的氮气)，于室温(～20℃)静置20min，观察沉淀和上清液颜色，如果是样品含有单羟酚类物质，即呈现深棕红色上清液和沉淀，其色度与单羟酚类物质含量呈正比关系，对照色标卡判定结果。

实施例2

本实施例的一种抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒，所述试剂盒由主瓶(安瓿瓶)试剂和副瓶(塑料瓶)试剂构成；

其中：按质量份数计，所述主瓶试剂由1份汞、3.0份浓硝酸、1.5份五水硫酸铜硫酸铜和14份蒸馏水制得，所述副瓶试剂由1份亚硝酸钠和8份蒸馏水组成；所述主瓶试剂与副瓶试剂的体积比为1：0.7。

本实施例上述所述抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒采用如下方法制得，步骤如下：

(1)在150ml烧杯中加入1份汞和3.0份浓硝酸，搅拌均匀后升温至40℃反应100min，此时体系为透明均匀溶液，停止加热；待温度降至室温后，加入14份蒸馏水和1.5份五水硫酸铜充分搅拌溶解，即制备成a溶液(淡蓝色)。

(2)在另一50ml烧杯中加入称取1份亚硝酸钠溶解于8份蒸馏水中，即配制成b溶液。

试剂盒使用方法：于安瓿瓶中加入步骤(1)所得1mla溶液，然后加入2ml待检新鲜晨尿尿样，摇动混合；再加入0.7mlb溶液，摇动混合，此时有许多气泡产生，于室温(～20℃)静置20min，观察沉淀和上清液颜色，如果是样品含有单羟酚类物质，即呈现深棕红色上清液和沉淀，其色度与单羟酚类物质含量呈正比关系，对照色标卡判定结果。

实施例3

本实施例的一种抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒，所述试剂盒由主瓶(安瓿瓶)试剂和副瓶(塑料瓶)试剂构成；

其中：按质量份数计，所述主瓶试剂由1份汞、3.2份浓硝酸、1.5份五水硫酸铜硫酸铜和15份蒸馏水制得，所述副瓶试剂由1份亚硝酸钠和7份蒸馏水组成；所述主瓶试剂与副瓶试剂的体积比为1：0.6。

本实施例上述所述抗尿液成分干扰的单羟酚类物质尿检试剂盒采用如下方法制得，步骤如下：

(1)在150ml烧杯中加入1份汞和3.2份浓硝酸，搅拌均匀后升温至35℃反应110min，此时体系为透明均匀溶液，停止加热；待温度降至室温后，加入15份蒸馏水和1.5份五水硫酸铜充分搅拌溶解，即制备成a溶液(淡蓝色)。

(2)在另一50ml烧杯中加入称取1份亚硝酸钠溶解于7份蒸馏水中，即配制成b溶液。

试剂盒使用方法：于安瓿瓶中加入1mla溶液，加入2ml待检新鲜晨尿尿样，摇动混合；再加入0.6mlb溶液，摇动混合，此时有许多气泡产生，于室温(～20℃)静置20min，观察沉淀和上清液颜色。如果是样品含有单羟酚类物质，即呈现深棕红色上清液和沉淀，其色度与单羟酚类物质含量呈正比关系，对照色标卡判定结果。

本发明显色结果判断标准如下：浅黄色或无色为阴性；浅棕红色为弱阳性；棕红色为阳性；深棕红色为强阳性。

模拟尿液添加酪氨酸回收实验表明，本试剂阳性检出正确率为100％。临床检测癌症患者尿液检测结果表明，本发明试剂弱阳性、阳性和强阳性的总检出率为71.4％(有些癌症患者的单羟酚类物质含量不一定高)，其中强阳性(检测显色结果为深棕红)显示率为44.9％；对比试剂(某品牌产品)的弱阳性、阳性和强阳性的总检测率为51.8％，其中强阳性显示率仅为8.1％。分析上述结果，对比试剂阳性总检测率低于本试剂～20％，应该与对比试剂不能抵抗抗尿液成分物质干扰相关，出现了漏检情况；同时对比试剂强阳性显示率非常低，也说明对比试剂的显色反应很不充分(显然其显色反应受到了干扰)。图1显示了其中4例尿检试剂检测结果对比照片。a组为健康样本，即阴性。在b组中，本试剂显示为深棕色，判断为强阳性；而对比试剂显色变化与空白差别不大。在c组中，本试剂为棕色，判断为阳性；而对比试剂也变化不大。在d组中，本试剂显色为浅棕色，为弱阳性，而对比试剂为浅黄色，显示为阴性，出现了漏检情况。

根据本发明上述实验结果可知，本发明的尿检试剂显色变化明显(易于判断)、抗干扰性能效果好，可显著降低尿样阳性漏检率，进一步验证了本发明的尿检试剂临床应用的可行性。

本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。