一种纳米卟啉催化剂及利用其催化TMB显色的方法与流程

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种纳米卟啉催化tmb显色的方法。

背景技术：

过氧化物酶由于多种底物的过氧化氢依赖性单电子氧化作用而催化许多化学反应，可用作临床诊断试剂盒的组分、用于免疫测定等。分析生物化学中最广泛的酶为辣根过氧化物酶(hrp)，被用于构建生物传感器和免疫分析。然而，天然酶固有不稳定性、高成本的纯化过程、来源等限制了它们的实际应用。基于天然酶的缺点，近来越来越多的人工酶的开发已经成为敏感酶模拟物的迫切需要。

随着fe3o4磁性纳米粒子的过氧化物酶特性被报道，一系列金属氧化物或金属纳米材料开始进入我们的视野，但是这些纳米材料合成过程复杂，原料昂贵。目前，卟啉化合物广泛应用于各种领域，如高分子材料、化学催化、电致发光材料、催化氧化和仿生酶等领域，而金属卟啉可以模拟许多生物类似酶(如细胞色素p450，肌红蛋白，血红蛋白)。因此，在相对温和的条件下可催化活化分子氧。金属卟啉已经受到相当大的关注并且可以用作替代物而不是使用还原性试剂来模拟酶催化剂。将金属氧化物与金属卟啉复合后的纳米材料已经显现出高过氧化物酶样活性，如：金属氧化物-卟啉(nio-h2tcpp)、cnps-卟啉、h2tcpp-ceo2nps、h2tcpp-mos2nps等已经被报道，但是这些卟啉-金属/金属氧化物纳米材料仍存在合成工艺条件严苛，原料成本昂贵，且多借助毒性的有机试剂合成等缺点，因此开发一种可操作性强且低成本的拟过氧化物酶至关重要。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种纳米卟啉催化剂，可催化tmb显色，具有原料成本低，显色快速且催化高效；且涉及的制备方法简单、可操作性强、成本低，适合推广应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种纳米卟啉催化剂，它以阳离子表面活性剂和zntpyp为主要原料，进行水浴自组装而成。

上述方案中，所述阳离子表面活性剂可选用十二烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基溴化铵等。

上述方案中，所述水浴自组装的具体步骤包括：将阳离子表面活性剂和zntpyp超声分散于水中得均匀的混合液，加热进行水浴反应引发自组装，得纳米卟啉。

上述方案中，所述水浴反应温度为70-100℃，时间为15-20min。

上述方案中，步骤1)中所述混合液中zntpyp的浓度为5×10^-7-2.5×10^-6m；阳离子表面活性剂的浓度为1.0×10^-3-1m。

上述方案中所述超声分散时间为10-15min。

一种利用上述纳米卟啉催化剂催化tmb显色的方法，包括如下步骤：将纳米卟啉催化剂加入含tmb、双氧水和醋酸盐缓冲溶液的混合液i中，进行恒温干燥箱中孵育反应，观察所得溶液体系ii的颜色变化。

上述方案中，所述溶液体系ii中，纳米卟啉催化剂的浓度为3×10^-8-9×10^-7m。

上述方案中，所述溶液体系ii中，tmb的浓度为1×10^-4-5×10^-4m。

上述方案中，所述溶液体系ii中，双氧水引入的h2o2的浓度为1-3％。

上述方案中，所述孵育时间为5-10min。

优选的，所述孵育温度为40℃。

本发明的原理为：

现有zntpyp等无拟过氧化物酶样活性，无法催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tmb)，产生由无色至蓝色的显色反应；本发明以阳离子表面活性剂和zntpyp为主要原料，采用简单自组装工艺实现纳米卟啉的制备，通过将阳离子表面活性剂自组装至zntpyp上，并结合自组装所得纳米卟啉的小尺寸和表面效应，可显著提升所得纳米卟啉的过氧化物酶样活性(十二烷基溴化胺具有弱的拟过氧化物酶活性)，有效催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tmb)，产生由无色至蓝色的显色反应。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)本发明采用简单的水浴自组装技术合成纳米卟啉，所得纳米卟啉可表现出优异的过氧化物酶样活性，可有效利用其催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tmb)，产生无色至蓝色的显色反应。

2)本发明所得纳米卟啉可有效克服天然酶的不稳定性，其催化速率显著高于单纯阳离子表面活性剂，且催化效果远远高于zntpyp。

3)本发明涉及的合成工艺简单、反应条件温和、成本低，适合推广应用。

附图说明

图1为实施例1所得纳米卟啉催化剂、十二烷基三甲基溴化铵催化tmb的显色对比图。

图2为实施例2所得纳米卟啉催化剂的透射电镜图。

图3为实施例3所得纳米卟啉催化剂在不同ph条件下对tmb体系的催化结果图。

图4为实施例4所得纳米卟啉催化剂在不同温度条件下对tmb体系的催化结果图。

图5为实施例2所得纳米卟啉催化剂与十二烷基三甲基溴化铵分别作为拟过氧化物酶对不同ph条件的稳定性测试结果。

图6为实施例2所得纳米卟啉催化剂与十二烷基三甲基溴化铵分别作为拟过氧化物酶对不同温度条件的稳定性测试结果。

图7为对比例所述zntpyp催化体系的紫外扫描结果图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

一种纳米卟啉催化剂，其制备方法包括如下步骤：

将9.5ml浓度为2.63×10^-3m的dtab水溶液与500μl的浓度为1×10^-5mzntpyp的n,n-二甲基甲酰胺溶液混合，超声(100w，25℃)10-15min，然后加热至70℃水浴15-20min引发自组装反应，即得纳米卟啉催化剂(dtab-zntpyp)。

将本实施例所得纳米卟啉催化剂用于催化tmb显色，具体步骤包括：

将100μl浓度为5×10^-7m的纳米卟啉，加至100μl浓度为3mmtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液、100μl浓度为30％的h2o2溶液、700μl醋酸盐缓冲溶液(0.2m，ph＝3.6)形成的混合显色体系i(tmb+h2o2+dtab-zntpyp)中，于40℃下孵育反应8min，溶液体系的颜色响应如图1所示。

将100μl浓度为5×10^-2m的dtab水溶液,加至含100μl浓度为3mmtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液、100μl浓度为30％的h2o2溶液、700μl醋酸盐缓冲溶液(0.2m，ph＝3.6)形成的混合显色体系ii(tmb+h2o2+dtab)中，于40℃下孵育反应8min，溶液体系的颜色响应如图1所示。

另外，向700μl醋酸盐缓冲溶液(0.2m，ph＝3.6)中加入100μl浓度3mmtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液和100μl浓度为30％的h2o2溶液形成显色体系iii(tmb+h2o2)，于40℃下孵育反应8min，溶液体系的颜色响应如图1所示。

由图1可以看出，本实施例所得纳米卟啉催化剂可快速催化tmb显色反应，所得溶液体系由无色变为深蓝色，且其催化速率高于阳离子表面活性剂十二烷基三甲基溴化铵。

实施例2

一种纳米卟啉催化剂，其制备方法包括如下步骤：

将9.5ml浓度为2.63×10^-2m的dtab水溶液与500μl浓度为1×10^-5mzntpyp的n,n-二甲基甲酰胺溶液混合，超声(100w，25℃)10-15min，然后加热至70℃水浴15-20min引发自组装反应，即得纳米卟啉催化剂(dtab-zntpyp)。

图2为本实施例所得纳米卟啉催化剂的电镜图，图中可以看出所得产物呈纳米棒状结构，粒径大小为70～80nm。

实施例3

一种利用纳米卟啉催化剂催化tmb显色的方法，包括如下步骤：

向含有100μl浓度为5×10^-7m的纳米卟啉水溶液(实施例2制备)、100μl3×10^-3mtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液和100μl浓度为30％h2o2水溶液的六份混合溶液中，分别加入700μl0.2m不同ph值的醋酸盐缓冲溶液(ph分别为2.0、3.6、4.0、4.5、6、7)，分别于40℃下孵育反应8min，进行紫外扫描(652nm处)结果如图3所示。

结果表明，当醋酸盐缓冲溶液的ph值在2.0-4.5的范围内，纳米卟啉均可对tmb表现出具有较好的催化效果,且在ph＝3.6显现出最佳的催化性能。

实施例4

一种利用纳米卟啉催化剂催化tmb显色的方法，包括如下步骤：

将含有100μl浓度为5×10^-7m的纳米卟啉水溶液(实施例2制备)、100μl3×10^-3mtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液、100μl浓度为30％h2o2水溶液及700μl醋酸盐缓冲溶液(0.2m，ph＝3.6)的五份混合溶液，分别置于不同温度的恒温干燥箱中孵育8min，温度分别为30℃，40℃，45℃，50℃，55℃，紫外扫描(652nm处)结果如图4所示。

图4表明催化温度为40℃时，纳米卟啉具有更优的催化效果。

实施例5

一种利用纳米卟啉催化剂催化tmb显色的方法(ph稳定性测试)，包括如下步骤：

将含有100μl浓度为5×10^-7m的纳米卟啉水溶液(实施例2制备)、100μl浓度为3×10^-3mtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液、100μl浓度为30％h2o2水溶液及700μl醋酸盐缓冲溶液(0.2m，ph＝3.6)，于40℃恒温干燥箱中孵育8min，紫外扫描(652nm处)，记录为原始吸光度值。

将实施例2中所得纳米卟啉dtab-zntpyp和十二烷基三甲基溴化铵dtab分别分散在0.2m的不同ph(ph＝2.0、2.8、3.6、4.0、4.5、5.0)醋酸盐缓冲溶液中存储2小时，然后取100μl上述不同ph存储下浓度为5×10^-7m的纳米卟啉、分别加至含100μl浓度为3×10^-3mtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液、100μl浓度为30％h2o2水溶液及700μl醋酸盐缓冲溶液(0.2m,ph3.6)的混合溶液中，于40℃恒温干燥箱中孵育8min，紫外扫描(652nm处)，记录为纳米卟啉ph稳定性考察的吸光度值；取100μl上述不同ph存储下浓度为0.2m的十二烷基三甲基溴化铵,分别加至100μl浓度为3×10^-3mtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液、100μl浓度为30％h2o2水溶液及700μl醋酸盐缓冲溶液(0.2m,ph3.6)的混合溶液中，于40℃恒温干燥箱中孵育8min，紫外扫描(652nm处)，记录为十二烷基三甲基溴化铵ph稳定性考察的吸光度值。随后作出纳米卟啉和十二烷基三甲基溴化铵的ph稳定性变化图(见图5)；其中横坐标为ph，纵坐标为相对强度(relativeactivity)＝(纳米卟啉或十二烷基三甲基溴化铵)ph稳定性考察的吸光度值/原始吸光度值。

图5表明纳米卟啉和十二烷基三甲基溴化铵在强酸性的醋酸盐缓冲溶液中催化活性稳定，但纳米卟啉的催化活性明显强于十二烷基三甲基溴化铵。

实施例6

一种利用纳米卟啉催化剂催化tmb显色的方法(温度稳定性测试)，包括如下步骤：

将含有100μl浓度为5×10^-7m的纳米卟啉水溶液(实施例2制备)、100μl浓度为3×10^-3mtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液、100μl浓度为30％h2o2水溶液及700μl醋酸盐缓冲溶液(0.2m,ph3.6)，于40℃恒温干燥箱中孵育8min，紫外扫描(652nm处)，记录为原始吸光度值。

将实施例2中所得纳米卟啉dtab-zntpyp和十二烷基三甲基溴化铵dtab水溶液置于不同温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)的恒温干燥箱中孵育2小时，然后取100μl上述不同温度存储下浓度为5×10^-7m的纳米卟啉、分别加至含100μl浓度为3×10^-3mtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液、100μl浓度为30％h2o2水溶液及700μl醋酸盐缓冲溶液(0.2m,ph3.6)的混合溶液中，于40℃恒温干燥箱中孵育8min，紫外扫描(652nm处)，记录为纳米卟啉温度稳定性考察的吸光度值；取100μl上述不同温度存储下浓度为0.2m的十二烷基三甲基溴化铵,分别加至含100μl浓度为3×10^-3mtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液、100μl浓度为30％h2o2水溶液及700μl醋酸盐缓冲溶液(0.2m,ph3.6)的混合溶液中，于40℃恒温干燥箱中孵育8min，紫外扫描(652nm处)，记录为十二烷基三甲基溴化铵温度稳定性考察的吸光度值。随后作出纳米卟啉和十二烷基三甲基溴化铵的温度稳定性变化图(见图6)；其中横坐标为温度，纵坐标为相对强度(relativeactivity)＝(纳米卟啉或十二烷基三甲基溴化铵)温度稳定性考察的吸光度值/原始吸光度值。

图6表明纳米卟啉和十二烷基三甲基溴化铵长时间存储在20-80℃条件下仍能保持其较稳定的拟过氧化物酶催化活性，但纳米卟啉的催化活性明显强于十二烷基三甲基溴化铵。

对比例1

将含有100μl浓度为5×10^-4m的卟啉zntpyp、100μl浓度为3×10^-4mtmb的n,n-二甲基甲酰胺溶液、100μl浓度为30％的h2o2水溶液和700μl醋酸盐缓冲液(0.2m,ph3.6)的混合溶液，于40℃恒温干燥箱中孵育8min。

将本对比例所得显色体系进行紫外扫描(652nm处)，结果见图7，图7表明未自组装的zntpyp在tmb和h2o2反应体系中不具有拟过氧化物酶样作用，不能催化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tmb)，无法产生652nmtmb氧化产物的特征吸收值。

本发明所列举的各原料都能实现本发明，以及各原料的上下限取值、区间值都能实现本发明；在此不一一列举实施例。本发明的工艺参数的上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。