一种用于烟草中游离、结合态甾醇同时测定的前处理方法与流程

本发明涉及一种用于烟草中游离态和结合态甾醇同时测定的高效前处理方法，属于烟草化学成分测定技术领域。

背景技术：

烟草中的甾醇类化合物主要有豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和胆甾醇，霉变的烟叶中还含有麦角甾醇。其中豆甾醇含量最高，胆甾醇含量最低。甾醇类在烟草中以游离态和结合态存在，结合态包括与脂肪酸形成甾醇酯，以及与糖类形成的甾醇糖苷和酰基甾醇糖苷。

烟草中甾醇能调控烟草生长发育，响应逆境胁迫，也是烟叶油份的主要成分之一，但是，甾醇经燃烧后对烟草的安全性和品质有较大的影响，因此，准确测定烟叶中甾醇的含量对于烟草品质评估具有重要意义。stedman等利用重量法测定烟草中游离态和结合态的甾醇，该方法对仪器要求低，但是对操作安全性要求高，分析时间长，干扰因素多，只能给出总甾醇含量，不能分别给出各种甾醇的含量。采用液相色谱法测定植物中甾醇，如不经衍生化处理，只能测定游离态的甾醇；采用气相色谱法测定植物中的甾醇，需要进行衍生化，前处理复杂。因此，均不能满足同时高效测定烟草中游离态和结合态甾醇含量的目的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于烟草中游离态和结合态甾醇同时测定的高效前处理方法，可快速完成烟草样品的前处理，以供液相色谱串联质谱进行烟草中甾醇的检测。

本发明技术方案为：

一种用于烟草中游离态和结合态甾醇同时测定的高效前处理方法，按以下步骤进行：步骤一：将待检测烟草样品粉碎，过40目筛，称取样品0.25g于外管样品瓶中，加入5.0ml2.0mol/l的盐酸-乙醇溶液和200μl浓度为0.5mg/ml的6-酮胆甾烷醇内标液；步骤二：60℃恒温超声水浴中超声水解1h；

步骤三：水解完后冷却5min，打开外管密封盖，往酸水解后的萃取液中再加入10ml4mol/l的氢氧化钾-乙醇溶液，再次旋紧密封盖，于60℃恒温超声水浴中超声皂化40min；

步骤四：冷却5min后在皂化液中加入10ml异辛烷、10ml饱和的氯化钾溶液；

步骤五：把内管柱卡置入样品瓶，室温下充分振荡5min后静置10min，让有机相分离；

步骤六：将内管柱向下压，萃取溶液异辛烷相就通过过滤筛板进入到两层筛板之间装填的无水硫酸钠，经干燥，从内管柱的样品导出管流出，完成样品过滤和干燥；

步骤七：在样品导出管口收集萃取液，弃去最初的2-3ml，然后用色谱瓶直接收集1-1.5ml的样品萃取液，供液相色谱串联质谱分析。

本发明的用于烟草中游离态和结合态甾醇同时测定的高效前处理方法，在整个样品前处理过程中不需要样品转移就能得到待分析的样品，大大简化了实验操作；该方法采用的水解、皂化、萃取、干燥试剂和相应的萃取方法提高了前处理效率；将烟草中甾醇前处理的水解、皂化、萃取、干燥、过滤操作在一个前处理装置中完成，由于前处理过程不需要转移，减少了实验误差，提高检测的准确性。经此装置前处理烟草后，可直接采用液相色谱串联质谱上机检测，完成烟草中游离和结合态甾醇的测定，并能给出各种甾醇的含量。萃取液经液相色谱串联质谱进行检测（本发明检测数据采用api4000液相色谱-串联质谱仪(美国absciex公司)，但不限于此），证实本发明的前处理可以满足烟叶中游离态和结合态甾醇同时检测的样品前处理需求，为烟叶中甾醇测定的前处理提供技术支持。

实际应用表明，本方法和萃取试剂及使用相应装置完全达到设计要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这个附图获得其他的附图。

图1为本发明的前处理装置外管结构示意图。

图2为本发明的前处理装置内管结构示意图。

图3为本发明的前处理装置外管、内管结合的结构示意图。图中：1－密封盖，2－样品瓶，3-筛板，4-样品导出管，5-内管柱，6-无水硫酸钠，7-色谱瓶，8-可上机样品。

具体实施方式

下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

一种用于烟草中游离态和结合态甾醇同时测定的高效前处理方法，按以下步骤进行：步骤一：将待检测烟草样品粉碎，过40目筛，称取样品0.25g于外管样品瓶中，加入5.0ml2.0mol/l的盐酸-乙醇溶液和200μl浓度为0.5mg/ml的6-酮胆甾烷醇内标液；步骤二：60℃恒温超声水浴中超声水解1h；

步骤三：水解完后冷却5min，打开外管密封盖，往酸水解后的萃取液中再加入10ml4mol/l的氢氧化钾-乙醇溶液，再次旋紧密封盖，于60℃恒温超声水浴中超声皂化40min；

步骤四：冷却5min后在皂化液中加入10ml异辛烷、10ml饱和的氯化钾溶液；

步骤五：把内管柱置入样品瓶，室温下充分振荡5min后静置10min，让有机相分离；

步骤六：将内管柱向下压，萃取溶液异辛烷相就通过过滤筛板进入到内管柱两层筛板之间装填的无水硫酸钠，经干燥，从内管柱的样品导出管流出，完成样品过滤和干燥；

步骤七：在样品导出管口收集萃取液，弃去最初的2-3ml，然后用色谱瓶7直接收集1-1.5ml的样品萃取液（可上机样品8），供液相色谱串联质谱分析。

所用高效前处理装置结构如图1-3所示，外管和内管两部分，外管由样品瓶2、密封盖1组成，内管由内管柱5、内管柱内的筛板3、插入内管柱内的样品导出管4组成，内管柱内的两筛板间为无水硫酸钠6，内管柱置于样品瓶2内。所述的样品瓶内径为10cm，内管柱内径为9.6cm，壁厚0.2cm。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：

技术总结
本发明涉及用于烟草中游离态和结合态甾醇同时测定的高效前处理方法，利用2.0 mol/L的盐酸‑乙醇溶液在60℃恒温超声水浴中1h完成水解；4 moL/L氢氧化钾‑乙醇溶液在60℃恒温水浴中超声40 min完成皂化；异辛烷、饱和的氯化钾溶液振荡5 min，静置10 min完成总甾醇的萃取；筛板间的无水硫酸钠完成干燥，筛板完成样品的过滤，之后总甾醇在异辛烷中从样品导出管导出，可直接采用液相色谱串联质谱上机检测，完成烟草中甾醇的测定。将烟草中甾前处理的水解、皂化、萃取、干燥、过滤操作在一个前处理装置中完成，在整个样品前处理过程中不需要样品转移就能得到待分析的样品，大大简化了实验操作，提高了前处理效率。

技术研发人员：曾婉俐;陈章玉;李雪梅;向海英;李晶;高茜;杨光宇
受保护的技术使用者：云南中烟工业有限责任公司
技术研发日：2019.03.08
技术公布日：2019.05.10