一种生物膜适用的三维曲面重构方法与流程

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种生物膜适用的三维曲面重构方法。

背景技术：

生物膜是微生物聚集的主要形式之一。生物膜是附着于固体表面的微生物和胞外多聚物所形成的层状聚集体，具有一定的厚度和复杂的三维形态。生物膜在自然界无处不在，但人类对于生物膜的研究始于生物膜法污水处理工艺中反应器和载体上附着的生物膜。生物膜系统通常由主体溶液(bulkliquid)、边界层(boundarylayer)、生物膜(biofilm)和载体(substratum)四个部分构成，如图1所示。生物膜的形成包括微生物在载体表面的附着和固定两个过程，受流体流动、基质类型和温度等因素影响。生物膜不仅具有复杂的三维结构，而且其三维结构始终在不断变化中，因此对于生物膜物理结构的表征是展示研究成果的重要依据。在废水处理领域，人们希望生物膜具有较大的厚度，可以形成外层好氧菌聚集，内层厌氧菌聚集的复合生物膜，实现在单一反应器内的好氧-厌氧组合工艺节省空间设备的投入。但对于具有复杂三维结构并较厚的生物膜，其物理形态的表征问题一直是困扰广大研究人员的难题之一。常见方法中扫描电子显微镜(sem)观察只能获得二维平面图像；荧光原位杂交(fish)等生物学检测可以通过基因检测确定生物膜内各细菌群落的组成和丰度。国内外学者采用激光共聚焦显微镜(clsm)测得生物膜的三维结构，但被测样品厚度有限，通常为纳米级的生物膜，而对于较厚(厚度大于0.1mm)的生物膜，由于显微镜透光量的限制无法穿透致密的生物膜组织，因此无法获得理想表征结果。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的问题，本发明提出了一种针对厚度大于0.1mm的生物膜获得三维结构的方法。根据本方法操作可以实现对厚度大于0.1mm的生物膜三维形态的有效表征，为生物膜形态变化及影响因素研究提供切实可行的手段。

本发明的技术方案如下：一种生物膜适用的三维曲面重构方法，包括如下步骤：

(一)制作生物膜切片

(1)清洗与取样

(2)固定

(3)漂洗

(4)脱水

(5)透化

(6)浸蜡与包埋

(7)切片

(8)粘片与烤片

(9)脱蜡

(10)染色

(11)封存

(二)生成光学切片

(1)调整发射光波长

(2)调整放大倍数

(3)拍照与图像存储

(三)建立三维模型。

进一步的，包括如下步骤：

(一)制作生物膜切片

(1)清洗与取样

对生物膜载体采用pbs进行清洗，去除其表面和内部所含营养液，并采用工具刮取生物膜至培养皿内；

(2)固定

将生物膜样品固定在2.5v/v％戊二醛溶液中，并置于4℃条件下24h；

(3)漂洗

取出样品，用吸水纸吸去表面多余的固定液，用0.2mol/l、ph7.2的pbs磷酸盐缓冲溶液漂洗3遍；

(4)脱水

分别用体积浓度为用50％、75％、85％、90％和95％的乙醇溶液对样品进行脱水处理15min；再用100％乙醇处理2次，每次20min；

(5)透化

用0.5v/v％的trixonx-100/pbs溶液4℃下静置10min增加细胞膜的通透性，用0.2mol/l的pbs磷酸盐缓冲溶液清洗3遍；

(6)浸蜡与包埋

浸蜡：

1)36℃低温浸蜡：将透化处理后的生物膜样品放入装有二甲苯的烧杯中，再逐步向烧杯中加碎蜡至过饱和，直到有石蜡析出，过夜12-24h，得到二甲苯与石蜡的混合液；

2)55-60℃高温浸蜡：将二甲苯与石蜡的混合液倒出，在烧杯中加入石蜡液，浸润5-24h后倒出石蜡液更换新的石腊液，重复此高温浸蜡步骤3遍；

包埋：采用低熔点石蜡液封埋；

(7)切片

将石蜡包裹的生物膜样品置入包埋框中冷却，再将包埋好的蜡块进行切片，得到蜡片，蜡片的厚度在8-20μm范围内；

(8)粘片与烤片

(9)脱蜡

(10)染色

先加入pi碘化丙啶染液200μl后置于37℃下恒温震荡培养箱避光培养30min，后用pbs缓冲液清洗，吸干表面液体；再加入fitc-cona(异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白)染液200μl染色，重复恒温震荡培养和清洗；

(11)封存

染色后的切片经pbs缓冲液漂洗并吸干水分后，滴入抗荧光猝灭封片液放入42℃恒温箱中干燥过夜，将切片贴标签；

(二)生成光学切片

(1)调整发射光波长

(2)调整放大倍数

(3)拍照与图像存储

(三)三维模型的建立

将光学切片文件输入电脑，使用计算机图像处理软件对光学切片图像进行数据处理，将数据处理结果进行z向叠加，实现基于二维图像堆叠技术的曲面重构，最后将重构的三维曲面输出，完成生物膜的曲面重构；

所述的数据处理过程如下：

(1)输入切片图像；

(2)对图像进行灰度处理、二值处理；

(3)求出图像中灰度值最小的坐标值，并记录坐标值；

(4)将得到的坐标值进行筛选和处理，求出坐标值，作为绘图x、y坐标值；

(5)测量蜡片的厚度，作为z坐标值；

(6)根据x、y、z坐标值绘图；

(7)输出三维网格图。

进一步的，所述的pi碘化丙啶染液的配置方法如下：将1mg碘化丙啶粉末溶于1ml去离子水中形成1mg/ml的水溶液冷冻保存，使用时用pbs缓冲液将上述水溶液稀释40倍，形成浓度为25μmol/l的溶液；所述的fitc-cona染液的配置方法如下：2mg粉末溶于0.1mol/l的nahco3溶液并定容至200ml，得到浓度10mg/l的溶液。

进一步的，步骤(4)所述的筛选和处理过程如下：

1)开始；

2)x、y分别为所求的坐标值，m、n分别为x、y坐标值的个数；

3)x的初始值为0，m的初始值为1；

4)若m＝n＝1，那么直接输出x、y坐标，同时x值加1；

5)若m<n，则不输出x、y坐标值，而是进入循环，x值加1；

6)若m>n，则将y的最大值与最小值相加之后除以二，求出中间值，将中间值赋予y，然后输出x、y坐标值；

7)结束。

本发明的有益效果如下：本发明是针对厚度大于0.1mm的生物膜，为了避免由于生物膜过厚导致染料和激光光束无法有效进入生物膜内部而造成的表征困难提出的。首先在生物膜切片的制作中借鉴了生物学领域中组织切片制作技术的基本原理，为保证染料穿透细菌的细胞膜和细胞壁进入细菌内部而加入了细胞透化步骤；又将一系列生物膜切片经过激光共聚焦显微镜后所成的图像进行纵向堆叠从而形成的三维曲面重建新技术。使用该技术不仅能有效重构生物膜复杂的物理形态，同时保证较高的还原度，为生物膜形态变化及影响因素研究提供了切实可行的手段。

附图说明

图1为生物膜系统的基本组成；

图2为图像处理流程图；

图3为数据处理流程图；

图4为生物膜曲面重建实例。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，若无特殊说明，本发明所用原料及设备均为本领域的常规技术。

实施例1

(一)制作生物膜切片

(1)清洗与取样

对生物膜载体采用pbs进行清洗，去除其表面和内部所含营养液，并采用工具刮取生物膜至培养皿内；

(2)固定

将生物膜样品固定在2.5v/v％戊二醛溶液中，并置于4℃条件下24h；

(3)漂洗

取出样品，用吸水纸吸去表面多余的固定液，用0.2mol/l、ph7.2的pbs磷酸盐缓冲溶液漂洗3遍；

(4)脱水

分别用体积浓度为用50％、75％、85％、90％和95％的乙醇溶液对样品进行脱水处理15min；再用100％乙醇处理2次，每次20min；

(5)透化

用0.5v/v％的trixonx-100/pbs溶液4℃下静置10min增加细胞膜的通透性，用0.2mol/l的pbs磷酸盐缓冲溶液清洗3遍；

(6)浸蜡与包埋

浸蜡：

1)36℃低温浸蜡：将透化处理后的生物膜样品放入装有二甲苯的烧杯中，再逐步向烧杯中加碎蜡至过饱和，直到有石蜡析出，过夜12-24h，得到二甲苯与石蜡的混合液；

2)55-60℃高温浸蜡：将二甲苯与石蜡的混合液倒出，在烧杯中加入石蜡液，浸润5-24h后倒出石蜡液更换新的石腊液，重复此高温浸蜡步骤3遍；

包埋：采用低熔点石蜡液(熔点为52-54℃)封埋；

(7)切片

将石蜡包裹的生物膜样品置入包埋框中冷却，再将包埋好的蜡块进行切片，得到蜡片，蜡片的厚度在8-20μm范围内，此厚度为续光学切片以及三维重构过程的z坐标值；

(8)粘片与烤片

将切好的样品蜡片投入浓度95％的无水乙醇溶液中，使用带有静电吸附作用的载玻片将漂浮在液体表面的样品片展平吸附上载玻片。将完成粘片后的载玻片适当位置手写编号顺序，便于后续曲面重构；

(9)脱蜡

依次采用二甲苯→1/2二甲苯+1/2纯酒精→100％酒精→95％酒精→85％酒精→95％酒精→95％酒精(快速)→100％酒精→1/2二甲苯+1/2纯酒精→二甲苯→二甲苯，以上各级约需5～10分钟，已注明时间的除外；

(10)染色

为了形象的表征生物膜的三维几何形态以及生物膜内有效细菌的占比，选择可与细胞内dna蛋白发生反应显色的碘化丙啶，以及可与胞外聚合物多糖成分反应显色的异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白fitc-cona染液。选若为了实现其它观察目的，可更换合适的染液。

pi碘化丙啶染液的配置方法如下：将1mg碘化丙啶粉末溶于1ml去离子水中形成1mg/ml的水溶液冷冻保存，使用时用pbs缓冲液将上述水溶液稀释40倍，形成浓度为25μmol/l的溶液；

fitc-cona染液的配置方法如下：2mg粉末溶于0.1mol/l的nahco3溶液并定容至200ml，得到浓度10mg/l的溶液。

先加入pi碘化丙啶染液200μl后置于37℃下恒温震荡培养箱避光培养30min，后用pbs缓冲液清洗，吸干表面液体；再加入fitc-cona染液200μl染色，重复恒温震荡培养和清洗；

(11)封存

染色后的切片经pbs缓冲液漂洗并吸干水分后，滴入抗荧光猝灭封片液放入42℃恒温箱中干燥过夜，将切片贴标签；

(二)生成光学切片

(1)调整发射光波长

根据染料特性选择波长，pi碘化丙啶在535nm发射波长条件下被激发，在615nm波长条件下观察；异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白(fitc-cona)在波长428nm下被激发，在波长540nm下观察。若选用其它染料，激发和观察波长需做相应调整。

(2)调整放大倍数

调整激光共聚焦显微镜目镜和物镜的放大倍数和视野亮度保证获得的完整清晰的切片图像照片。

(3)拍照与图像存储

将制得的生物膜切片经过上述两个步骤的调整后逐一拍照，对获得的图片以切片编号为文件名保存，输出。可将图片文件转化成可移植性较强的tiff格式存储，以被更多图像处理软件识别。

(三)三维模型的建立

将光学切片文件输入电脑，使用计算机图像处理软件对光学切片图像进行数据处理，将数据处理结果进行z向叠加，实现基于二维图像堆叠技术的曲面重构，最后将重构的三维曲面输出，完成生物膜的曲面重构，见图4；

数据处理过程如下：

(1)输入切片图像；

(2)对图像进行灰度处理、二值处理；

(3)求出图像中灰度值最小的坐标值，并记录坐标值；

(4)将得到的坐标值进行筛选和处理，求出坐标值，作为绘图x、y坐标值；

(5)测量蜡片的厚度，作为z坐标值；

(6)根据x、y、z坐标值绘图；

(7)输出三维网格图。

由光学切片生成三维曲面模型的过程应包括：离散数据点的提取、图像插值运算和曲面重构等。可选用多种具有图像处理功能的软件完成上述具体操作，如matlab等。虽适用软件和具体方法众多，但基本过程都和上述流程图类似，最终获得的重构结果会受到计算方法、软件精度以及操作者技能的影响。

上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。