瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法与流程

本发明涉及中药材指纹图谱技术领域，具体是瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法。

背景技术：

益母姜为姜科植物闭鞘姜Costus speciosus（Koen.）Smith的根茎，多年生宿根草本，是习用瑶药之一。瑶族民间常将其作为产妇的护理用药，对产妇的康复效果好，因此瑶民称之为“益母姜”、“观音姜”。生于海拔1700 m以下的山谷、林下或林缘路边、溪边灌木草丛等潮湿处。主要分布于广西、广东、云南、福建、台湾等省区，东南亚及南亚亚热带地区也有分布。广西益母姜主要分布于来宾、百色、桂林、凭祥、桂平、贵港、钦州、南宁、玉林、柳州、梧州等地，多生于海拔较低的林下或荒坡潮湿处。益母姜能够治疗多种疾病，不仅是我国少数民族的常用中药，在印度、不丹、柬埔寨等国也有很长的药用历史，因此该药的质量评价一度成为国内外研究的热点。

益母姜的性味、毒性、产地加工方面，各典籍记载不一，历版《中国药典》和瑶药标准中均未收载本品，缺乏统一的标准，这就容易造成本品性味、产地加工方法的混乱，药材的质量难以得到有效控制，从而影响其临床疗效。国内的乔春峰和苏新民等分别开展了闭鞘姜类药材的鉴别研究和傣药材闭鞘姜质量研究，Pratap Singh等也对印度当地的闭鞘姜进行了生药学研究。然而本发明人通过对比发现，瑶药材益母姜与闭鞘姜虽为同一基源药材，但因各地区的气候、土质不同等原因，益母姜的内含物存在较大差异，使得已有的鉴别方法不能对益母姜药材的质量进行有效控制，无法对广西地区益母姜药材的质量进行准确评价。瑶药益母姜应用广泛，但因缺乏规范可行的质量评价方法，使得其疗效差异较大，影响其进一步开发和利用。

中药的指纹图谱是具有高度专属性的一种特征图谱，能够比较全面地表征药材成分的相对关系，目前已经成为公认的质量控制的有效手段。同一基原药材的生长环境、采收季节以及贮藏条件不同，其指纹图谱也会有所差别。

目前国内外现有技术中尚无益母姜指纹图谱的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种瑶药材益母姜的质量评价方法，通过建立益母姜的指纹图谱，能够较全面地反映益母姜所含成分的相对关系，还可以有效地对不同产地的药材进行准确区分，更好地对其质量进行评价和控制，促进广西瑶药益母姜的开发和利用。

为了有效控制瑶药材益母姜的质量，本发明对广西11批不同产地益母姜药材的原植物形态、药材性状、显微特征、薄层鉴别、项目检查、含量测定等方面进行质量评价，建立其质量标准，为广西瑶药材益母姜的进一步开发利用提供科学的依据。

本发明通过以下技术方案实现：

瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

（1）制备供试品溶液：准确称取益母姜药材2.0000 g，精密加入体积分数为70%的乙醇溶液50ml，称定重量，超声60 min，放冷后称重，补足减失的重量，滤过，滤液精密加入3 mol/ml的盐酸溶液20 ml，水浴回流2 h，放冷后，用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调至中性，水浴蒸干，残渣用30 ml热水溶解并转移至分液漏斗中以三氯甲烷萃取，萃取2次，每次30 ml，合并三氯甲烷部分，挥干，残渣用甲醇定容至10 ml棕色容量瓶中，进样前以0.22 µm有机滤膜滤过，即得；

（2）制备对照品溶液：精密称定薯蓣皂苷元标准品适量，用甲醇溶解，制成1 ml含薯蓣皂苷元0.428 mg的对照品溶液，于棕色的容量瓶中储存，进样前以0.22 µm有机滤膜滤过，即得；

（3）HPLC检测：分别吸取上述对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，根据色谱条件进行高效液相色谱检测，记录95min 内的HPLC 图谱；

其中，所述的色谱条件为：色谱柱ODS-SP C18（250×4.6 nm，5m）；检测波长203 nm；流速0.8 ml/min；柱温30 ℃；进样量10 l； 流动相A：乙腈；流动相B：0.1%磷酸；梯度洗脱条件如下：0～10 min，5%A+95%B；10～40 min，20%A+80%B；40～65 min，70%A+30%B；65～95 min，95%A+5%B；百分数表示流动相A和B所占的体积百分比。

（4）对多个供试品进行检测，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，通过多点校正的方法对所有色谱峰进行匹配，将自动生成对照指纹图谱R作为对照指纹图谱。

一、对本发明指纹图谱的色谱条件考察如下：

1、流动相的选择

益母姜药材的化学成分较为复杂，本发明采用了梯度洗脱的方法分别对甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸四种流动相系统进行考察，以色谱峰的分离效果为考察指标，找到适合的流动相。结果如图1所示。

实验结果显示，以甲醇作为流动相时，色谱图基线严重漂移，且色谱峰的数目较少；以乙腈-水流动相系统洗脱得到的色谱图干扰峰较多，分离度较差。综合考虑。最后选定以乙腈-0.1%磷酸流动相系统进行梯度洗脱。

2、检测波长的选择

为了获得更多益母姜药材的化学信息，检测波长的选择尤为重要。本发明以色谱图峰的数量、丰度、基线漂移情况等为考察指标，分别对196 nm、203 nm、206 nm、208 nm、225 nm五种不同波长进行考察，选择适合的检测波长。结果如图2所示。

实验结果显示，检测波长越小，色谱峰的峰高越高，但基线也会漂移增加。当检测波长为196~208 nm时，各色谱图的峰数量一致，当以225 nm为检测波长时，色谱峰数目明显减少。结合各检测波长下的色谱图，最终选择以203 nm作为检测波长。

3、进样量、柱温、流速、分析时间的选择

本发明还对色谱条件的不同柱温（25、30、25 ℃）；不同样品进样量（5、10、15、20 l）；不同流速（0.5、0.8、1.0、1.2 ml/min）分别进行了考察，对比各条件下的色谱图，综合考虑峰型、保留时间、分离度、峰高等因素，确定以20 l为进样量，柱温30 ℃，流速为0.8 ml/min进行益母姜指纹图谱的测定。结果如图3、4、5所示。

按照相同的色谱条件对样品溶液进行120 min的色谱分析发现，95 min后色谱图再无滞后峰出现，故选择以95 min作为该指纹图谱的分析时间。

综上，最终确定的益母姜指纹图谱最佳色谱条件为：色谱柱ODS-SP C18（250×4.6 nm，5 m）；检测波长：203 nm；流速：0.8 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：10 l。

二、对本发明方法学的考察

1、精密度考察

取同一供试品溶液，重复进样6次，按本发明的色谱条件进行测定。计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积及其RSD值，结果见表1、表2。

表1 精密度试验-相对保留时间（n=6）

表2 精密度试验-相对峰面积（n=6）

由表1、表2可知，6次进样各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.00%，表明仪器精密度良好。

2、重复性试验

取同一批次（YMJ-6，20180920）益母姜药材6份，按本发明供试品溶液的制备方法制备供试液，依次进样，以本发明的色谱条件进行检测。计算6份指纹图谱各主要色谱峰的相对保留时间及其RSD值，结果见表3、表4。

表3 重复性试验-相对保留时间

表4 重复性试验-相对峰面积

结果显示，各色谱峰的相对保留时间的RSD值均小于3.00%，表明该样品制备方法重复性好。

稳定性试验

按照本发明供试品溶液的制备方法新鲜制备一份供试液，以本发明的色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进行HPLC检测，计算6个时间点指纹图谱各主要色谱峰的相对保留时间，并计算其RSD值，结果见表5、6。

表5 稳定性试验-相对保留时间

表6 稳定性试验-相对峰面积

实验表明，各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于1.00%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

本发明的有益效果：

1、本发明对益母姜的HPLC指纹图谱进行研究，为其质量标准的制定提供参考。通过建立益母姜的指纹图谱，能够较全面地反映益母姜所含成分的相对关系，还可以有效地对不同产地的药材进行准确区分，更好地对其质量进行评价和控制。

2、本发明瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法，重复性、精密度良好，稳定性较高，说明该测定方法操作可行。

3、本发明供试品制作简便，色谱条件容易实现，可用于对瑶药材益母姜真伪、产地和品质的鉴别和控制，有利于促进广西瑶药益母姜的开发和利用。

附图说明

图1是不同流动相的色谱图；其中，A、乙腈-水；B、乙腈-0.1%磷酸；C、甲醇-水；D、甲醇-0.1%磷酸。

图2是不同检测波长下的色谱图；其中，A、196 nm，B、203 nm，C、206 nm，D、208 nm，E、225 nm。

图3是不同柱温下的色谱图。

图4是不同进样量下的色谱图。

图5是不同流速下的色谱图。

图6是十一批益母姜药材的指纹图谱；其中，S1、博白、S2、恭城、S3、桂平、S4、横县、S5、金秀、S6、灵山、S7、平果、S8、平南、S9、凭祥、S10、三江、S11、西林；R为多点校正后生成的对照指纹图谱。

图7是益母姜二氯甲烷部位的特征图谱；其中，A、益母姜供试品溶液，B、对照品溶液 C、甲醇溶液，S、薯蓣皂苷元对照。

具体实施方式

为了使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

瑶药材益母姜二氯甲烷部位HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

（1）制备供试品溶液：准确称取益母姜药材2.0000 g，精密加入体积分数为70%的乙醇溶液50ml，称定重量，超声60 min，放冷后称重，补足减失的重量，滤过，滤液精密加入3 mol/ml的盐酸溶液20 ml，水浴回流2 h，放冷后，用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调至中性，水浴蒸干，残渣用30 ml热水溶解并转移至分液漏斗中以三氯甲烷萃取，萃取2次，每次30 ml，合并三氯甲烷部分，挥干，残渣用甲醇定容至10 ml棕色容量瓶中，进样前以0.22 µm有机滤膜滤过，即得；

（2）制备对照品溶液：精密称定薯蓣皂苷元标准品适量，用甲醇溶解，制成1 ml含薯蓣皂苷元0.428 mg的对照品溶液，于棕色的容量瓶中储存，进样前以0.22 µm有机滤膜滤过，即得；

（3）HPLC检测：分别吸取上述对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，根据色谱条件进行高效液相色谱检测，记录95min 内的HPLC 图谱；

其中，所述的色谱条件为：色谱柱ODS-SP C18（250×4.6 nm，5 m）；检测波长203 nm；流速0.8 ml/min；柱温30 ℃；进样量10 l； 流动相A：乙腈；流动相B：0.1%磷酸；梯度洗脱条件如下：0～10 min，5%A+95%B；10～40 min，20%A+80%B；40～65 min，70%A+30%B；65～95 min，95%A+5%B；百分数表示流动相A和B所占的体积百分比。

（4）对多个供试品进行检测，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，通过多点校正的方法对所有色谱峰进行匹配，将自动生成对照指纹图谱R作为对照指纹图谱。

按照上述建立的指纹图谱方法对11个产地的益母姜药材进行指纹图谱测定，结果见图6。

益母姜二氯甲烷部位的特征图谱如图7所示。由图7可知，益母姜二氯甲烷部位特征图谱可观察到10个特征峰，通过与对照品进行比对，指认了5号峰为薯蓣皂苷元色谱峰，故以薯蓣皂苷元峰作为益母姜二氯甲烷部位特征图谱的参照峰S。

益母姜二氯甲烷部位指纹图谱的质量评价如下：

利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2012 版》软件，通过多点校正的方法，对11批益母姜药材的色谱峰进行匹配并自动生成对照指纹图谱R（见图6）。以生成的对照指纹图谱R为对照，对11批益母姜二氯甲烷部位的指纹图谱进行相似度计算，结果如下表7所示。

表7 益母姜指纹图谱相似度计算结果

由相似度结果可知，除平果产地（YMJ-10）益母姜的相似度为0.89外，其余产地益母姜指纹图谱的相似度均在0.90以上，表明除平果产地益母姜成分异常外，广西不同产地益母姜的化学组成一致性较好。11批药材的采收日期相差不大，可能是产地（土壤、气候）差异等原因造成的这种异常。

以参照峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，见表8、表9。

表8 十一个产地益母姜指纹图谱各共有峰的相对保留时间

表9 十一个产地益母姜指纹图谱各共有峰的相对峰面积

由表8、表9可知，11批益母姜图谱各共有峰的相对保留时间的RSD值均小于3.0%，相对峰面积的RSD值为0.53～141.29%，表明益母姜共有成分的出峰时间相近，不同产地益母姜的化学成分一致性好。