本发明属于新型纳米材料领域与生物传感技术领域。
背景技术：
铁蛋白是动植物、微生物体内广泛存在的一类贮存铁的可溶性蛋白，是在进化上高度保守的生物分子，在哺乳类动物的肝和脾中含量较多，铁蛋白分子结构包括两部分：蛋白外壳和铁核，铁蛋白的蛋白质外壳表面暴露了很多氨基、羟基等官能团，而铁核部分则被证明可以催化过氧化氢分解成超氧自由基，因此铁蛋白不仅易于进行表面化学修饰且具有较好的类过氧化物酶作用；n-(4-氨丁基)-n-乙基异鲁米诺，简称异鲁米诺，具有优秀的电致化学发光性能，作为鲁米诺的衍生物，由于其分子结构中含有氨基且远离苯环，使该氨基要比鲁米诺的更活泼，异鲁米诺不仅易于化学修饰，还体现出了比鲁米诺更强的还原性，可以在一定条件下还原氯金酸根离子制备纳米金，而其电致化学发光性能几乎不受影响。
降钙素原作为诊断脓毒症和鉴别严重细菌感染的生物标志物，它的灵敏检测可显着提高脓毒症诊断的敏感性和特异性。目前，用于检测降钙素原的主要是电化学生物传感器，但这种方法存在重新性差、灵敏度低的缺点。由于电致化学发光技术结合了化学发光与电化学两种技术的优势，除了具有易于操作、可控性强、响应速度快等特点，其灵敏度也要比电化学更高，检测限也更低，可见，基于电致化学发光技术制备的生物传感器具备了比电化学技术更强的优势，这为免疫新方法的提出提供了一种更为强有力的技术支持，本发明正是基于电致化学发光技术而提出的一种生物传感器的制备方法，旨在为弥补现有检测方法的不足，为降钙素原的早期临床检测提供一种全新的分析方法。
技术实现要素：
本发明的技术任务之一是为了弥补现有检测技术的不足，提供一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用，该方法制备过程简单、绿色环保、成本低、信号响应迅速，大大缩短了检测的时间，省时省力。
本发明的技术任务之二是提供所述免疫传感器的用途，该传感器能够快速检测降钙素原，具有灵敏度高、特异性强、重现性好的优点，检出限为3.4fg/ml，线性范围10fg/ml-50ng/ml。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1.一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6μl、浓度为2~4mg/ml的抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液作为传感器基底材料，将其置于37°c晾干；
（3）滴加3μl、质量分数为1~3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4°c晾干；
（4）滴加6μl降钙素原的标准溶液或未知浓度的降钙素原溶液，37°c下孵化0.5~2h，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4°c晾干，传感器构建完毕。
2.一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用，所述抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液，通过以下步骤制备：
将3~5ml、浓度为5μg/ml的铁蛋白溶液与0.5~2.5ml、浓度为10mmol/l的n-(4-氨丁基)-n-乙基异鲁米诺溶液混合，随后加入3.5~5.5ml去离子水进行稀释，然后，向上述混合溶液中加入50~150ul、质量分数50%的戊二醛溶液，持续搅拌2h后得到浅黄色的异鲁米诺-铁蛋白溶液，向混合溶液中加入100~300μl、浓度为10mmol/l的氯金酸溶液并继续搅拌15min，然后将该混合溶液置于40~60oc水浴中5min，直至溶液颜色由浅黄色变为淡紫色，得到异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液；
在上述溶液中，加入100~300μl、浓度为10mg/ml的降钙素原抗体溶液，在4°c下振荡孵化6~18h，离心后分散到1mlph7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液，置于4°c下储存备用。
3.利用上述制备方法制备的免疫传感器用于降钙素原浓度的检测。
4.利用上述方法制备的传感器用于降钙素原浓度的检测，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800v，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0~0.6v，扫描速率设置为0.1v/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10ml含35~65mmol/过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度降钙素原时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为3.4fg/ml，线性范围10fg/ml-50ng/ml；
（3）将孵化未知浓度的降钙素原实际样品的电致化学发光传感器进行测试得到相应的信号强度，据此根据工作曲线计算即可得到该试剂样品中的降钙素原浓度。
本发明的有益成果
（1）首次基于铁蛋白制备了一种新颖的三维纳米结构—异鲁米诺-铁蛋白-纳米金,在此结构内，鲁米诺、铁蛋白、纳米金三者之间体现出令人满意的协同促进作用：通过结合铁蛋白、纳米金优秀的催化性，实现了异鲁米诺的电致化学发光响应的双重放大；
（2）本发明基于电致化学发光技术，提出了一种基于异鲁米诺-铁蛋白-纳米金作为传感基底的免疫传感器的制备方法，该方法弥补了现有检测技术操作复杂、灵敏度低、重现差的问题，将制备的传感器用于降钙素原的样品检测，检出限为3.4fg/ml，线性范围10fg/ml-50ng/ml，具有响应速度快、灵敏度高、重现好、制备简单、成本低、绿色环保的优点，有望投入降钙素原试剂盒的研发中。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6μl、浓度为2mg/ml的抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液作为传感器基底材料，将其置于37°c晾干；
（3）滴加3μl、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4°c晾干；
（4）滴加6μl降钙素原的标准溶液或未知浓度的降钙素原溶液，37°c下孵化0.5h，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4°c晾干，传感器构建完毕。
实施例2.一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6μl、浓度为3mg/ml的抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液作为传感器基底材料，将其置于37°c晾干；
（3）滴加3μl、质量分数为2%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4°c晾干；
（4）滴加6μl降钙素原的标准溶液或未知浓度的降钙素原溶液，37°c下孵化1h，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4°c晾干，传感器构建完毕。
实施例3.一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6μl、浓度为4mg/ml的抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液作为传感器基底材料，将其置于37°c晾干；
（3）滴加3μl、质量分数为3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4°c晾干；
（4）滴加6μl降钙素原的标准溶液或未知浓度的降钙素原溶液，37°c下孵化2h，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4°c晾干，传感器构建完毕。
实施例4.抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液，通过以下步骤制备：
将3ml、浓度为5μg/ml的铁蛋白溶液与0.5ml、浓度为10mmol/l的n-(4-氨丁基)-n-乙基异鲁米诺溶液混合，随后加入3.5ml去离子水进行稀释，然后，向上述混合溶液中加入50ul、质量分数50%的戊二醛溶液，持续搅拌2h后得到浅黄色的异鲁米诺-铁蛋白溶液，向混合溶液中加入100μl、浓度为10mmol/l的氯金酸溶液并继续搅拌15min，然后将该混合溶液置于40oc水浴中5min，直至溶液颜色由浅黄色变为淡紫色，得到异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液；
在上述溶液中，加入100μl、浓度为10mg/ml的降钙素原抗体溶液，在4°c下振荡孵化6h，离心后分散到1mlph7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液，置于4°c下储存备用。
实施例5.抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液，通过以下步骤制备：
将4ml、浓度为5μg/ml的铁蛋白溶液与1.5ml、浓度为10mmol/l的n-(4-氨丁基)-n-乙基异鲁米诺溶液混合，随后加入4.5ml去离子水进行稀释，然后，向上述混合溶液中加入100ul、质量分数50%的戊二醛溶液，持续搅拌2h后得到浅黄色的异鲁米诺-铁蛋白溶液，向混合溶液中加入200μl、浓度为10mmol/l的氯金酸溶液并继续搅拌15min，然后将该混合溶液置于50oc水浴中5min，直至溶液颜色由浅黄色变为淡紫色，得到异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液；
在上述溶液中，加入200μl、浓度为10mg/ml的降钙素原抗体溶液，在4°c下振荡孵化12h，离心后分散到1mlph7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液，置于4°c下储存备用。
实施例6.抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液，通过以下步骤制备：
将5ml、浓度为5μg/ml的铁蛋白溶液与2.5ml、浓度为10mmol/l的n-(4-氨丁基)-n-乙基异鲁米诺溶液混合，随后加入5.5ml去离子水进行稀释，然后，向上述混合溶液中加入150ul、质量分数50%的戊二醛溶液，持续搅拌2h后得到浅黄色的异鲁米诺-铁蛋白溶液，向混合溶液中加入300μl、浓度为10mmol/l的氯金酸溶液并继续搅拌15min，然后将该混合溶液置于60oc水浴中5min，直至溶液颜色由浅黄色变为淡紫色，得到异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液；
在上述溶液中，加入300μl、浓度为10mg/ml的降钙素原抗体溶液，在4°c下振荡孵化18h，离心后分散到1mlph7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液，置于4°c下储存备用。
实施例7.将传感器用于降钙素原浓度的检测，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800v，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0~0.6v，扫描速率设置为0.1v/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10ml含35mmol/过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度降钙素原时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为3.4fg/ml，线性范围10fg/ml-50ng/ml;
（3）将孵化未知浓度的降钙素原实际样品的电致化学发光传感器进行测试得到相应的信号强度，据此根据工作曲线计算即可得到该试剂样品中的降钙素原浓度。
实施例8.将传感器用于降钙素原浓度的检测，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800v，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0~0.6v，扫描速率设置为0.1v/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10ml含55mmol/过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度降钙素原时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线;
（3）将孵化未知浓度的降钙素原实际样品的电致化学发光传感器进行测试得到相应的信号强度，据此根据工作曲线计算即可得到该试剂样品中的降钙素原浓度。
实施例9.将传感器用于降钙素原浓度的检测，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800v，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0~0.6v，扫描速率设置为0.1v/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10ml含65mmol/过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度降钙素原时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为3.4fg/ml，线性范围10fg/ml-50ng/ml;
（3）将孵化未知浓度的降钙素原实际样品的电致化学发光传感器进行测试得到相应的信号强度，据此根据工作曲线计算即可得到该试剂样品中的降钙素原浓度。