一种比伐芦定原料及其制剂的质量控制方法与流程

本发明涉及药物分析领域，尤其涉及一种比伐芦定原料及其制剂的质量控制方法。
背景技术：
：比伐芦定(bivalirudin，casno.：128270-60-0，分子式：c98h138n24o33，分子量：2180.29)是一种由20个氨基酸残基组成的人工合成的水蛭素类似物，可直接抑制凝血酶活性，识别凝血酶与纤维蛋白原的结合位点，从而抑制凝血酶的活性。目前，尚没有优质的针对比伐芦定原料及其制剂的质量控制方法报道，建立稳定可靠的该原料及其制剂的质量控制方法意义重大。多肽链构成的不同直接影响着检测方法的建立，目前，多肽检测方法包括高效液相色谱法(hplc)、质谱法(ms)、液相色谱质谱联用法(lc-ms)、毛细管电泳质谱联用法(ce-ms)、光谱分析法等。使用高效液相色谱法(hplc)对多肽进行检测时，存在以下问题：(1)多肽的检测对流动相的组成以及ph值具有较高要求；(2)分离度达不到要求；(3)多肽易吸附于填充剂上。如目前公开的药品标准号为ybh01662016的注射用比伐芦定质量标准中有关物质和含量测定方法，以0.1mol/l醋酸钠缓冲液(取无水醋酸钠8.2g，加水约900ml溶解，用醋酸调节ph值至6.5，加水稀释至1000ml)-水(50∶50)为流动相a，0.1mol/l醋酸钠缓冲液-乙腈(50∶50)为流动相b，按下表进行梯度洗脱，流速1.2ml/min，柱温40℃，检测波长215nm。试验证明，该企业的流动相具有以下不足：(1)多次使用该流动相后会对色谱柱造成损害，导致柱效低，缩短色谱柱使用寿命，增加科研成本(2)含量测定与有关物质的液相测定方法不一致，且有关物质杂质i与杂质ii、杂质iii检查时使用了不同的流动相，操作繁琐、计算复杂(3)该标准中只检查了三个杂质，未见本发明中其他两个杂质的测定方法，即有关物质检查不全面。通过文献检索，还有报道采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱ymc-packods-am(250mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃，波长210nm，进样量20μl，以5mmol/l磷酸盐溶液(磷酸调节ph至3.5)为流动相a，乙腈为流动相b，梯度洗脱测定注射用比伐芦定中6种有关物质，从色谱图中看出。亦有报道以diamonsilc18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，5mmol/l磷酸二氢钾(磷酸溶液调ph值至2.5)-乙腈(80∶20)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为210nm测定比伐芦定的含量及有关物质。这些方法经复核后仍然存在多次使用该流动相后会对色谱柱造成损害的问题，导致柱效低，缩短色谱柱使用寿命，增加科研成本。因此，提供一种能够比伐芦定原料及其制剂的质量进行准确的评价且能延长色谱柱寿命的方法具有重要意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种比伐芦定原料及其制剂的质量控制方法，本发明提供的方法能够有效的分离各个杂质与原料的主峰，且色谱柱使用寿命长。与现有技术相比，本发明提供了一种比伐芦定原料及其制剂的质量控制方法，通过将含有比伐芦定原料的供试溶液或含有比伐芦定制剂的供试品溶液通过高效液相色谱进行检测，得到待测物质中各原料以及杂质的含量；其中，通过选择高效液相色谱检测的流动相为三氟醋酸、水、四氢呋喃和乙腈的混合液，通过实验发现，该检测方法不仅能够有效实现比伐芦定以及各个的杂质的良好分离，而且检测方法稳定，结果准确，对色谱柱的损耗较小，能够延长色谱柱的使用寿命。附图说明图1为注射用比伐芦定含量测定用供试品溶液的hplc图；图2为比伐芦定对照品溶液的hplc图；图3为混合对照品溶液的hplc图；图4为注射用比伐芦定有关物质检查用对照溶液的hplc结果；图5为注射用比伐芦定有关物质检查用供试品溶液hplc结果。具体实施方式本发明提供了一种比伐芦定原料及其制剂的质量控制方法，通过将含有比伐芦定原料的供试溶液或含有比伐芦定制剂的供试品溶液通过高效液相色谱进行检测，得到待测物质中比伐芦定以及杂质的含量；其中，高效液相色谱检测的流动相为三氟醋酸、水、四氢呋喃和乙腈的混合液。本发明中，所述含有比伐芦定原料的供试溶液或含有比伐芦定制剂的供试品溶液中的溶剂为水，其中，比伐芦定含量测定方法中，所述供试品溶液中含有比伐芦定原料或含有比伐芦定的制剂的浓度优选为0.05mg/ml-0.2mg/ml，更优选为0.1mg/ml；比伐芦定有关物质测定方法中，所述供试品溶液中含有比伐芦定原料或含有比伐芦定的制剂的浓度优选为1.5mg/ml-2.5mg/ml，更优选为2mg/ml，对照溶液由供试品溶液稀释500倍制得。本发明中，本发明提供的高效液相色谱检测的流动相中，所述三氟醋酸、水、四氢呋喃、乙腈的体积比优选为(1-2)∶(700-900)∶(80-200)∶(80-200)，更优选为(1-2)∶(800-850)∶(100-150)∶(100-150)，最优选为2∶800∶100∶100。本发明中，所述高效液相色谱检测的色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，所述填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱优选为kinetexxb-c18色谱柱、welchultimatexb-c18色谱柱、waterssymmetryc18色谱柱、agilentzorbaxxb-c18色谱柱、phenomenexlunac18色谱柱或alltimac18色谱柱。本发明中，所述高效液相色谱检测的波长优选为203～215nm，更优选为210nm；高效液相色谱的检测器优选为紫外检测器；比伐芦定含量测定方法所述高效液相色谱检测的理论板数按比伐芦定峰计算应不低于5000。本发明中，所述高效液相色谱检测的流动相的流速优选为0.4-1.0ml/min，更优选为0.6-0.8ml/min。本发明中，所述高效液相色谱检测的柱温优选为25～70℃，更优选为40～60℃，最优选为50℃。本发明中，所述高效液相色谱检测中含量的测定方法外标法，具体为：取比伐芦定及已知杂质的混合对照品溶液(后称混合对照品溶液)、比伐芦定的对照品溶液(后称对照品溶液)和比伐芦定原料的供试溶液或含有比伐芦定制剂的供试品溶液(后统称供试品溶液)通过高效液相色谱仪分析，按外标法以峰面积计算，得到比伐芦定的含量。有关物质测定方法具体为：取比伐芦定及已知杂质的混合对照品溶液、比伐芦定原料的供试溶液或含有比伐芦定制剂的供试品溶液和对照溶液通过高效液相色谱仪分析，供试品溶液色谱图中已知杂质按外标法以峰面积计算，未知杂质按主成分自身对照法计算，得到有关物质的含量。其中，在检测有关物质含量的步骤中，所述混合对照品溶液中比伐芦定的浓度优选为0.05mg/ml～3mg/ml，更优选为1.0mg/ml～3.0mg/ml，更优选为2.0mg/ml。所述混合对照品溶液中各已知杂质的浓度优选为1μg/ml～10μg/ml，更优选为2μg/ml～15μg/ml，更优选为10μg/ml。所述对照溶液的浓度优选为0.1μg/ml～6μg/ml，更优选为2μg/ml～6μg/ml，更优选为4μg/ml。本发明中，在检测比伐芦定原料及其制剂有关物质含量的步骤中，所述混合对照品溶液、对照溶液和供试品溶液在液相色谱中分析时的时间为比伐芦定主成分峰保留时间的2倍以上。所述液相色谱仪的其它条件与所述检测比伐芦定原料及其制剂含量测定中的液相色谱仪的条件相同。本发明提供了一种比伐芦定原料及其制剂的质量控制方法，通过将含有比伐芦定原料的供试溶液或含有比伐芦定制剂的供试品溶液通过高效液相色谱进行检测，得到待测物质中各原料以及杂质的含量；其中，通过选择高效液相色谱检测的流动相为三氟醋酸、水、四氢呋喃和乙腈的混合液，结果发现，该检测方法不仅能够有效实现比伐芦定以及各个的杂质的良好分离，而且检测方法稳定，结果准确，对色谱柱的损耗较小，能够延长色谱柱的使用寿命。下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1使用仪器为：agilent1260高效液相色谱仪，包括g1311c四元梯度泵、真空脱气机，g1329b自动进样器，g1314f紫外检测器，g1316a柱温箱，色谱柱为kinetexxb-c18，4.6mm×150mm。用十八硅烷键合硅胶为填充剂，以三氟醋酸-水-四氢呋喃-乙腈混合溶液为流动相，其中，混合液中，按体积比三氟醋酸-水-四氢呋喃-乙腈为2∶800∶100∶100，检测波长为210nm，柱温50℃，流速0.6ml/min，理论板数按比伐芦定峰计算不低于5000。取测试样品，加入水溶解并稀释得到浓度为0.1mg/ml的溶液作为供试品溶液，量取所述供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，图1为注射用比伐芦定含量测定用供试品溶液的hplc图；取成都圣诺生物科技有限公司购买的比伐芦定对照品(含量88.0％)，加入水溶解并稀释得到浓度为0.1mg/ml的溶液，作为对照品溶液，量取所述对照品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2，图2为比伐芦定对照品溶液的hplc图。使用外标法计算含量：通过计算所述供试品溶液和对照品溶液的峰面积的比值即得所述供试品的含量，含量测定结果见下表。表1实施例1中比伐芦定原料及其制剂供试品溶液的色谱分析结果名称保留时间(min)峰面积含量％比伐芦定原料34.6191687.87634109.15注射用比伐芦定36.8741743.2396599.07实施例2所用色谱仪、填充剂、流动相与实施例1相同。取biva(12-20)-biva、plus-gly-biva、des-gly-biva、beta-asp9-biva、alpha-asp9-biva杂质对照品和比伐芦定适量，用水溶解并稀释制成含各杂质10μg/ml和比伐芦定2mg/ml的混合对照品溶液；取比伐芦定原料及其制剂样品，用水溶解制成2.0mg/ml的供试品溶液；取部分所述供试品溶液用水稀释制成4.0μg/ml的对照溶液。取所述混合对照品溶液、对照溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪检测，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍以上，检测结果见图3～图5，图3为混合对照品溶液的hplc图，图4为注射用比伐芦定有关物质检查用对照溶液的hplc结果，图5为注射用比伐芦定有关物质检查用供试品溶液hplc结果；具体数据结果见下表2～表4。表2实施例2中系统适用性溶液峰信号成分保留时间(min)峰面积分离度biva(12-20)-biva20.378199.18544-plus-gly-biva34.445190.6619319.22比伐芦定35.356313940.54des-gly-biva40.284123.667332.51beta-asp9-biva41.609129.907330.95alpha-asp9-biva46.397134.096593.77表3实施例2中注射用比伐芦定有关物质检查结果表4注射用比伐芦定有关物质检查用供试品溶液计算得到，比伐芦定原料中杂质biva(12-20)-biva的含量小于0.2％，未检出其他杂质；注射用比伐芦定(批号：20190226)中杂质biva(12-20)-biva的含量小于0.2％，其他单个杂质含量小于0.2％。从上述结果可以看出，本发明提供的检测方法能够很好的分离比伐芦定原料中的各个杂质。且通过对使用记录进行分析可知，本发明提供的检测方法色谱柱使用超过3个月仍可正常使用。而
背景技术：
提到的检测方案其色谱柱在与本申请每天的使用频率相同的情况下，其使用寿命不超过1个月。实施例3使用仪器为：agilent1200高效液相色谱仪，包括g1322a四元梯度泵，g1311a真空脱气机，g1329a自动进样器，g1316a紫外检测器，g1314b柱温箱，色谱柱为agilentzorbaxxb-c18。用十八硅烷键合硅胶为填充剂，以三氟醋酸-水-四氢呋喃-乙腈混合溶液为流动相，所述混合液中，按体积比三氟醋酸-水-四氢呋喃-乙腈为1.5∶700∶150∶150，检测波长为208nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，理论板数按比伐芦定峰计算不低于5000。取测试样品，加入水溶解并稀释得到浓度为0.1mg/ml的溶液作为供试品溶液，量取所述供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。取成都圣诺生物科技有限公司购买的比伐芦定对照品(含量88.0％)，加入水溶解并稀释得到浓度为0.1mg/ml的溶液，作为对照品溶液，量取所述对照品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。使用外标法计算含量：通过计算所述供试品溶液和对照品溶液的峰面积的比值即得所述供试品的含量，含量测定结果见下表。表4实施例3中注射用比伐芦定供试品溶液色谱分析结果名称保留时间(min)峰面积含量％注射用比伐芦定30.5471784.98735104.50实施例4使用仪器为：agilent1100高效液相色谱仪，包括g1379a四元梯度泵，g1311a真空脱气机，g1313a自动进样器，g1316a紫外检测器，g1315b柱温箱，色谱柱为phenomenexlunac18。用十八硅烷键合硅胶为填充剂，以三氟醋酸-水-四氢呋喃-乙腈混合溶液为流动相，所述混合液中，按体积比三氟醋酸-水-四氢呋喃-乙腈为1∶750∶125∶125，检测波长为213nm，柱温40℃，流速1.0ml/min，理论板数按比伐芦定峰计算不低于5000。取测试样品，加入水溶解并稀释得到浓度为0.1mg/ml的溶液作为供试品溶液，量取所述供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。取成都圣诺生物科技有限公司购买的比伐芦定对照品(含量88.0％)，加入水溶解并稀释得到浓度为0.1mg/m1的溶液，作为对照品溶液，量取所述对照品溶液10μ1注入液相色谱仪，记录色谱图。使用外标法计算含量：通过计算所述供试品溶液和对照品溶液的峰面积的比值即得所述供试品的含量，含量结果见下表。表5实施例4中注射用比伐芦定供试品溶液色谱分析结果名称保留时间(min)峰面积含量％注射用比伐芦定23.8791809.12748103.98以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页12