一种伏立康唑中微量基因毒性杂质检测方法与流程

本发明涉及药物检测
技术领域：
，具体涉及一种伏立康唑中微量基因毒性杂质检测方法，特别涉及伏立康唑中含有溴代烷基官能团的基因毒性杂质的检测方法。
背景技术：
：伏立康唑(voriconazole)，商品名vfend，是第二代三唑类抗真菌药物，由美国pfizer公司研制，2002年获fda批准正式上市。它是目前在氟康唑基础上结构改造最为成功的化合物，具有高效、低毒的特点，用于致死性深部真菌感染治疗。伏立康唑具有抗菌谱广、抗菌效力强的特点，对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉具有杀菌作用，对白念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌等均有效。伏立康唑对念珠菌的活性比氟康唑高8-13倍，对新型隐球菌的活性比氟康唑高16倍，比伊曲康唑高2倍，并且对临床上难于治疗的烟曲霉菌感染具有较好疗效。基因毒性杂质是指化合物本身直接或者间接损伤细胞dna，导致生物体产生基因突变或者发生体内诱变，具有致癌性或者潜在倾向。基因毒性杂质作为工艺杂质的一类，近年来受到国内外的高度重视。欧盟医药管理局(ema)发布了《基因毒性杂质限度指引》，并颁布了36种具有潜在基因毒性的化学结构，旨在对潜在基因毒性杂质的充分研究和有效控制，保障用药安全性。具有基因毒性作用的基团一般具有亲电试剂的性质，这些基团在生理条件下同体内核酸、蛋白质或者其他重要成分中的亲核中心发生取代反应，使这些成分发生不可逆的损伤，表现为毒性、致突变或致癌等作用。表现为上述作用的基团主要有：芳香硝基、芳香偶氮、芳香氮氧化合物、芳香伯胺或者仲胺、烷基肼、酯醛基、n-甲醇基、卤代烯烃、氮芥基、氯胺、β-内酯、乙烯亚胺、卤代烷、乌拉坦、n-亚硝基胺、芳胺或酚、环氧基等。药品杂质的研究是药物研发的一项重要内容，基因毒性杂质的研究由于其不良影响较大的特性在药品质量研究中显得尤为关键。生产过程中，可能产生基因毒性杂质的环节包括新药合成、原料药纯化、储存运输等，合成过程中用到的试剂、中间体、副产物等可能具有基因毒性结构的物质都应该予以考虑。(r/s)-4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶结构如下式in-001，是合成伏立康唑化合物的重要中间体，目前有多篇文献公开其合成以及通过其制备伏立康唑的方法。国际公开号为wo9706160a1的pct专利申请公开了经化合物4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶制备伏立康唑中间体，进而制备伏立康唑的方法。中国专利文献cn102190628a公开了以2-氟代丙酰乙酸乙酯和丙酰氯为原料，经化合物4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶，制备伏立康唑中间体的方法，具体工艺路线如下：中国专利文献cn105503834a、公开号为wo2017108010a1的pct专利申请均公开了以化合物4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶作为原料，制备伏立康唑的方法，具体合成路线如下：虽然，尚未有报道公开化合物(r/s)-4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶的基因毒性和致癌性研究数据，但在伏立康唑的合成过程中，该化合物可能带入后续反应中，成为终产物伏立康唑的杂质之一，且其含有溴代烷基的结构警示基团，是潜在的基因毒性杂质。目前，有多篇文献涉及伏立康唑杂质的检测，例如，中国专利文献cn109212048a公开了一种伏立康唑中杂质含量的检测方法，采用高效液相色谱-电喷雾检测器联用技术，对多个杂质进行检测，解决了普通的紫外检测器无法检测杂质e(r)-10-樟脑磺酸的问题；但其并未涉及原料药中含有溴代烷基官能团的基因毒性杂质的检测，也没有涉及上述基因毒性杂质in-001的检测，且需要电喷雾检测器，检测成本高。文献《伏立康唑合成的起始原料质量控制研究》(《大家健康》2015年12月第9卷第23期，147页)中对伏立康唑合成起始原料(2r,3s/2s,3r)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(4-氯-5-氟嘧啶)-1-(1h-1,2,4-三唑-1-基)丁-2-醇盐酸盐(化合物y1)的质量控制进行研究分析，以期进一步提高伏立康唑成品的质量，文中主要对起始原料中1-(2,4)-二氟苯基-2-(1h-1,2,4-三唑-1-基)乙酮(杂质a)和4-乙基-5-氟-嘧啶(杂质b)的含量控制进行研究，并提出控制其百分比不得超过1.4％，虽然涉及化合物6-(1-溴乙基)-4-氯-5-氟嘧啶(化合物y2)的检测数据，但其作为起始原料杂质控制方法，其杂质含量远远大于作为原料药中基因毒杂质的含量标准，并没有意识到该杂质可能会成为泊沙康唑原料药中的杂质，更没有公开低含量杂质in-001特别是微量杂质的检测方法。因此，迫切需要对伏立康唑中含有溴代烷基官能团的基因毒性杂质特别是上述基因毒性杂质(r/s)-4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶建立检测方法、分析杂质含量、并确定合理的杂质限度，从而有效地保障伏立康唑原料药和制剂的质量安全。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供了一种对伏立康唑中含有溴代烷基官能团的基因毒性杂质进行微量检测的方法，特别提供一种对伏立康唑中基因毒性杂质(r/s)-4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶进行微量检测的方法，该方法能够实现伏立康唑与相关基因毒性杂质的有效分离，并定量检测杂质含量，从而有效控制原料药中基因毒性杂质的含量，保障用药安全。本申请发明点主要有以下两点：(1)现有技术中可能忽略了杂质(r/s)-4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶带有溴代烷基警示结构，没有意识到其可能存在于伏立康唑原料药中，成为一种基因毒性杂质(现有技术虽然有提及该杂质，但仅是对上述起始原料y1的质量控制进行研究，而非对伏立康唑原料药的质量控制)，因此现有技术中并未公开对伏立康唑原料药中该类杂质的检测方法；(2)通常，基因毒性杂质的检测限度很低，在伏立康唑原料药中质量控制要求低于2.5ppm即(0.00025％)，控制难度大，而普通液相色谱一般仅能对0.02％以上含量的杂质进行检测，申请人经研究发现，基因毒性杂质in-001采用普通高效液相色谱直接进样的方式，虽然有紫外吸收，但是产生的峰面积较小，响应值低，达不到对微含量进行定量检测的要求。本发明的研发过程中，尝试过采用苯硫酚等多种增强紫外吸收的常用衍生化试剂进行衍生化处理，但是最终紫外吸收强度没有明显改善，无法解决低含量定量检测的问题。最后发明人通过创造性劳动发现，以联苯-4-硫酚作为衍生化试剂，对含有溴代烷基官能团的基因毒性杂质(例如基因毒性杂质(r/s)-4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶)进行衍生化处理，衍生化对反应条件要求不苛刻，可定量快速反应，生成符合分析要求的衍生化物(具有较强紫外吸收、又不会产生过多干扰的产物)，增加其对检测器的响应，从而实现了对该杂质的微量检测、定量检测以及原料药质量控制。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题。本发明提供了一种伏立康唑中基因毒性杂质检测方法，用联苯-4-硫酚对待测样品进行衍生化处理后，采用高效液相色谱法检测所述待测样品中基因毒性杂质；所述待测样品为伏立康唑原料药；所述基因毒性杂质为含有溴代烷基官能团的基因毒性杂质。在一些实施例中，所述含有溴代烷基官能团的基因毒性杂质为(r/s)-4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶。本发明中，所述联苯-4-硫酚作为衍生化试剂，对所述基因毒性杂质的衍生效果较佳，其cas号为19813-90-2。本发明中，所述伏立康唑原料药可通过市售获得，或者可通过本领域常规方法制得。本发明中，所述衍生化处理可为本领域常规操作，一般按下述步骤进行：将所述联苯-4-硫酚和所述伏立康唑原料药溶解于溶剂即可。优选，按下述步骤进行：将所述伏立康唑原料药、碱和所述联苯-4-硫酚溶解于溶剂中，即可获得供试品溶液。按照本领域常识可知，溶解于所述溶剂后，还进行定容的操作。一般定容后，为了使得混合均匀，可进行超声或者摇床处理，优选进行超声。所述超声的操作和条件可为本领域常规，例如超声15min-30min，优选15min。其中，所述碱可为本领域常规的可与发生亲核取代生成的氢溴酸反应、以促进取代正向反应的有机碱和/或无机碱，由于采用无机碱后反应溶液浑浊，需过滤后进样，故优选为有机碱。例如所述无机碱可为碳酸钾和/或碳酸钠。所述有机碱可为三乙胺、二乙胺、甲胺和乙胺中的一种或多种，优选为三乙胺。根据本领域常识可知，所述碱的用量一般相对于所述联苯-4-硫酚过量即可，例如所述碱的摩尔数大于所述联苯-4-硫酚摩尔数的10倍以上、50倍以上或100倍以上。所述供试品溶液中，所述伏立康唑原料药的浓度可为本领域常规，优选为25～35mg/ml，例如30mg/ml。所述供试品溶液中，所述联苯-4-硫酚与所述伏立康唑原料药的质量比可为本领域常规，一般为1：(300～2000)，优选1：(600～1500)，进一步优选1：(1000～1500)，最优选1：1200。所述供试品溶液中，所述联苯-4-硫酚的浓度可为本领域常规，一般为20～30μg/ml，例如25μg/ml。所述供试品溶液中，为了便于定量，所述联苯-4-硫酚一般以溶液的形式加入，例如，在具体实施例中先配制联苯-4-硫酚溶液，在所述供试品溶液中通过加入所述联苯-4-硫酚溶液实现联苯-4-硫酚的准确加入。所述联苯-4-硫酚溶液中的溶剂一般为本领域常规，优选与所述供试品溶液中的溶剂相同，例如乙腈。所述联苯-4-硫酚溶液中联苯-4-硫酚的浓度可为本领域常规，例如1.0mg/ml。所述供试品溶液中的溶剂可为本领域常规的能够溶解原料药、且不影响检测的溶剂，例如乙腈。本发明中，所述高效液相色谱法进行检测的过程中，采用的参数和操作均为本领域常规。采用的检测仪器为本领域常规的高效液相色谱仪，例如岛津，lc20at。本发明中，所述高效液相色谱法中，采用的色谱柱为本领域常规的色谱柱，优选为十八烷基硅烷键合硅胶柱，例如agilentc18硅胶柱。本发明中，所述高效液相色谱法中，采用的检测波长优选为250～310nm，更优选为265～269nm，最优选267nm。本发明中，所述高效液相色谱法中，进样量优选为10-25μl，更优选20μl。本发明中，所述高效液相色谱法中，柱温优选为35～45℃，更优选38～42℃，最优选40℃。本发明中，所述高效液相色谱法中，进样流速优选为0.8～1.21ml/min，更优选为0.9～1.1ml/min，最优选1ml/min。本发明中，所述高效液相色谱法中，优选使用梯度洗脱的方法，流动相a为含酸的水溶液，流动相b为乙腈。所述流动相a优选为含甲酸或乙酸的水溶液，更优选甲酸；进一步优选含0.09-0.11％的酸的水溶液，更进一步优选为含0.1％的甲酸水溶液，上述百分比为酸与水溶液的体积百分比。其中，所述梯度洗脱的方法为本领域常规。所述梯度洗脱的过程中，采用的初始混合液中，所述流动相a与所述流动相b的体积比优选为(75：25)～(85：15)，更优选为80：20。优选采用如下洗脱梯度：上述百分比为体积比。本发明中，所述检测的方法优选包括下述步骤：(1)配制含有所述基因毒性杂质的对照溶液；(2)将所述衍生化处理后的供试品溶液和对照溶液经所述的高效液相色谱法检测，记录所述供试品溶液中对应的所述基因毒性杂质的衍生化产物峰面积，记为a样，所述对照溶液中所述基因毒性杂质的衍生化产物峰面积a对；(3)按下述公式计算所述基因毒性杂质在伏立康唑中的含量w/w；所述含量＝(a样*c对)/(a对*c样)*100％式中：a样——为所述供试品溶液中所述基因毒性杂质的衍生化产物峰面积；a对——为所述对照溶液中所述基因毒性杂质的衍生化产物峰面积；c对——为所述对照溶液中所述基因毒性杂质的浓度；c样——为所述供试品溶液中伏立康唑原料药的浓度。步骤(1)中，所述对照溶液中杂质的浓度与供试品溶液中伏立康唑的浓度之比为原料药质量控制中该杂质含量限度，例如3.60ppm以下，优选2.50ppm以下。作为实例，可以优选0.60～3.60ppm，进一步优选2.00-2.50ppm，更优选2.50ppm。步骤(1)中，所述对照溶液可根据本领域常规方法制备，一般包括下述步骤：将所述基因毒性杂质、碱和联苯-4-硫酚溶解于溶剂中，即可。按照本领域常识可知，溶解于所述溶剂后，还进行定容的操作。一般定容后，为了使得混合均匀，可进行超声或者摇床处理，优选进行超声。所述超声的操作和条件可为本领域常规，例如超声15min～30min，优选15min。所述对照溶液中，所述碱可为本领域常规的可与发生亲核取代生成的氢溴酸反应、以促进取代正向反应的有机碱和/或无机碱。具体的可如所述供试品溶液中的所述碱。所述对照溶液中，所述基因毒性杂质可参考现有技术制备得到，例如中国专利文献cn102190628a中公开的该杂质(作为中间体)的制备过程。所述对照溶液中，所述基因毒性杂质的浓度可为本领域常规，优选60～80ng/ml，例如75ng/ml。所述对照溶液中，所述基因毒性杂质一般以溶液的形式加入，例如，在具体实施例中先配制含有所述基因毒性杂质的对照储备液，在所述对照溶液中通过加入所述对照储备液实现基因毒性杂质的准确加入。所述对照溶液、对照储备液中的溶剂一般为本领域常规，优选与所述供试品溶液中的溶剂相同，例如乙腈。所述对照储备液中基因毒性杂质的浓度可为本领域常规，例如10μg/ml。所述对照溶液中，所述联苯-4-硫酚的浓度可为本领域常规，一般与供试品溶液中联苯-4-硫酚的浓度相同，例如为20～30μg/ml，优选25μg/ml。所述对照溶液中，所述联苯-4-硫酚一般以溶液的形式加入，具体加入情况可如前所述。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种对伏立康唑中含有溴代烷基官能团的基因毒性杂质，特别是基因毒性杂质(r/s)-4-(1-溴代乙基)-5-氟-6-氯-嘧啶进行微量检测的方法，该方法不仅能够实现伏立康唑及相关基因毒性杂质的有效分离，还能实现微含量的定量检测，从而有效控制原料药中基因毒性杂质的含量，保障用药安全。本发明的检测方法也适用于含其他卤代烷基官能团的基因毒性杂质的检测。本发明的检测方法采用常用试剂，操作简便、分离度好、灵敏度高。采用普通高效液相色谱即可实现检测，不需购买和联用其他仪器，操作方便，检测成本低。附图说明图1是实施例1中空白溶液的高效液相色谱图。图2是实施例1中对照溶液的高效液相色谱图。图3是实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图。图4是实施例1中加标供试品溶液的高效液相色谱图。具体实施方式下面将结合具体实施例对本发明做更进一步的详细说明。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当更改工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本技术。除非特别说明，本发明所用试剂为根据现有方法制得或者为市售品。下述实施例和对比例中，采用的in-001对照品和伏立康唑原料药均可购买或按照下述制备方法制得：基因毒性杂质in-001对照品：可参考现有技术制备得到，例如中国专利文献cn102190628a中公开的该杂质(作为中间体)的制备过程。伏立康唑原料药：可参考现有技术制备得到，例如中国专利文献cn105503834a公开的制备方法。实施例1：伏立康唑原料药中基因毒性杂质in-001的检测(1)采用的仪器及色谱条件：仪器：高效液相色谱，岛津，lc20at色谱柱：agilentc18，粒径5μm，内径4.6*250mm检测波长：267nm进样量：20μl柱温：40℃流动相a：0.1％甲酸溶液；流动相b：乙腈流速：1ml/min洗脱梯度如表1所示：表1时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0802010～25208025～33109033～35109035～408020408020(2)溶液配制甲酸溶液：取甲酸1ml至1000ml水中，混匀即可。联苯-4-硫酚溶液配制：精密称定联苯-4-硫酚10mg至10ml量瓶中，用纯乙腈溶解并稀释至刻度，联苯-4-硫酚的浓度为1.0mg/ml。空白溶液：取联苯-4-硫酚溶液250μl，三乙胺50μl，用乙腈溶解并定容至10ml，超声15min后进样。对照储备液：精密称定in-001对照品适量，用乙腈溶解后，再用乙腈稀释制成每1ml含in-00110μg的溶液。对照溶液：精密吸取对照储备液75μl，精密加入三乙胺50μl，联苯-4-硫酚溶液250μl，用乙腈溶解并定容至10ml，超声15min后进样。供试品溶液：精密称定伏立康唑原料药300mg，精密加入三乙胺50μl，联苯-4-硫酚溶液250μl，乙腈溶解并定容至10ml，超声15min后进样。加标供试品溶液：精密称定伏立康唑原料药300mg，精密加入三乙胺50μl，对照储备溶液75μl，联苯-4-硫酚溶液250μl，乙腈溶解并定容至10ml，超声15min后进样。(3)操作步骤分别取上述空白溶液、对照溶液、供试品溶液、加标供试品溶液进样，具体进样如下表2所示：表2溶液名称进样针数空白溶液至少2针对照溶液5针供试品溶液2针加标供试品溶液2针对照溶液1针注：上述针数表示的是进样次数，以“5针为例”表示，一个样品重复进样5次。最后计算的峰面积、杂质in-001衍生化产物保留时间为重复进样5次的平均值。(4)实验结果将空白溶液、对照溶液、供试品溶液和加标供试品溶液按照步骤(1)中公开的仪器及色谱条件进行检测，检测结果如附图所示。其中，图1是实施例1中空白溶液的高效液相色谱图。图2是实施例1中对照溶液的高效液相色谱图。图3是实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图。图4是实施例1中加标供试品溶液的高效液相色谱图。其中，空白溶液、对照溶液、供试品溶液和加标供试品溶液中杂质in-001衍生化产物保留时间、峰面积取多次检测的平均值，数据如下表3所示：表3：溶液中杂质in-001保留时间和峰面积空白溶液对照溶液供试品溶液加标供试品溶液保留时间/min/29.268/29.278峰面积/12925/12283(/表示该溶液未检测到杂质对应峰)根据如下公式计算杂质in-001在伏立康唑中的含量(w/w)：im-h(ppm)＝(a样*c对)/(a对*c样)式中：a样——为供试品溶液中对应的杂质in-001衍生化产物峰面积；a对——为对照溶液中杂质in-001衍生化产物峰面积；c对——为对照溶液中杂质in-001的浓度(ng/ml)；c样——为供试品溶液中伏立康唑原料药的浓度(mg/ml)。由于本实施例供试品溶液在杂质in-001的保留时间位置未检测到出峰，即未检测到杂质峰(即a样为0)，推测为本次待测伏立康唑原料药样品中不含有该杂质。故采用在供试品中加入微量对照品的方式(即加标供试品溶液)检测，以验证本方法不仅可以将原料和该杂质分离，还能实现微量检测。计算加标供试品溶液中的杂质in-001的含量：a样＝a’样——为加标供试品溶液中对应的杂质in-001衍生化产物峰面积；c样＝c’样——为加标供试品溶液中伏立康唑原料药的浓度(mg/ml)＝300mg/10ml＝30mg/ml；对照溶液中杂质in-001的浓度：c对＝(10μg/ml*75μl)/10ml＝10μg/ml/10000*75＝75ng/ml；加标供试品溶液中，in-001对照品相对于伏立康唑原料药的理论含量(10μg/ml*75μl)/(300mg+10μg/ml*75μl)＝2.50ppm根据上述公式结合附图4中峰面积，计算所得的加标供试品溶液中杂质in-001含量：im-h(ppm)＝(12283*75ng/ml)/(12925*30mg/ml)＝2.3758ppm。对于加标供试品溶液而言，实际检测数据为2.3758ppm，理论含量为2.5ppm，由此可见，本发明的衍生化方法和检测方法的准确度良好。根据实验结果可以看出，本发明的检测方法不仅能有效分离检测伏立康唑原料药中杂质in-001，还能实现该基因毒性杂质的微量检测，对含量低至ppm级的杂质进行检测，远优于现有检测方法，而且检测精度高，可以用于原料药检测分析和质量控制，从而保证用药安全。实施例2-实施例9不同检测条件下伏立康唑原料药中基因毒性杂质in-001的检测实施例2-实施例9中，除下述条件外，其它参数和操作均与实施例1相同，具体测试条件和测试结果如表4所示。表4上述实验结果与实施例1的结果比较可以看出，本发明的检测方法稳定性好，检测精度高，可以用于伏立康唑原料药质量控制。实施例10～实施例14衍生化试剂不同加入量条件下伏立康唑原料药中基因毒性杂质in-001的检测申请人还针对衍生化试剂的不同加入量条件下杂质检测方法进行了研究。参考实施例1的操作方法，其中空白溶液、对照溶液、供试品溶液及加标供试品溶液中联苯-4-硫酚溶液取用量分别为150μl、200μl、300μl、500μl和1ml，其它参数和操作步骤均与实施例1相同，进行测试。实验结果与实施例1的结果比较发现，当衍生化试剂的加入量较大时，例如500μl和1ml，相邻峰对衍生化产物峰有干扰，虽然能检测到衍生化产物峰，但其定量准确性有所下降；当衍生化试剂的加入量较低时，如150μl，衍生化产物峰响应值较低，定量准确性也有所下降；当衍生化试剂加入量为200μl～300μl时，衍生化产物峰与相邻峰能达到基线分离，检测精度良好，当衍生化试剂加入量为250μl时，检测精度最高。具体的测试数据如下表5所示。表5实施例15～实施例17加标供试品溶液中in-001不同加入量条件下伏立康唑原料药中基因毒性杂质in-001的检测申请人还针对加标供试品溶液中in-001不同加入量条件下杂质检测方法进行了研究，以确定本检测方法的适用范围。参考实施例1的操作方法，其中加标供试品溶液中对照储备溶液取用量分别为18μl、35.5μl、和108μl，其它参数和操作步骤均与实施例1相同，进行测试。实验结果与实施例1的结果比较发现，本申请的检测方法对含量低至0.6ppm的该杂质的检测也具有较好的灵敏度和检测精度，可适用于伏立康唑原料药中该类杂质的微量检测和质量控制。具体的测试数据如下表6所示。表6当前第1页12