专利名称：卷烟主流烟气基因毒性测定方法
技术领域：
本发明涉及巻烟主流烟气基因毒性评价领域，具体说是一种巻烟主流烟气基 因毒性测定方法，是通过将细胞暴露于巻烟主流烟气下，测定主流烟气引起的细 胞微核增加的比例来进行基因毒性测定。
背景技术：
巻烟烟气是由几千种化学物质组成的气溶胶，其中许多组分对于细胞或人体 都具有一定的毒性作用。科学家们开展了很多关于巻烟烟气或烟气中的化学成分
的基因毒性研究，C0RESTA体外毒理学特别工作组推荐选用合适的哺乳动物细胞 用微核实验方法评价巻烟烟气的基因毒性。基因毒性测试的目的主要是测试外源 性物质对于DNA的结构或功能潜在的负面作用。目前，基因毒性己经被公认与动 物和人类的癌症紧密相关。微核实验是化学物质或混合物的基因毒性测试中应用 最为广泛的一种。文献报道暴露于烟气冷凝物的V79细胞中均可以明显观察到微 核的增加[参考文献l- Channarayapp3, J" Nsth， T Ong. Clsstogenic and ane叩loidogenic
effects of cigarette smoke condensate, Mitomycin C and vincristine sulfate [J]. Mutagenesis, 1992， 7(6) :457-260. 参考文献2: Veltel D, A Hoheneder. Characterization of cigarette sraoke-induced micronuclei in vitro [J]. Exp. Toxic Pathol, 1996, 48: 548-550. ] o此外在暴露于 烟气冷凝物的BALB/C-3T3细胞中也可以明显地发现微核的增加[参考文献3:M。。re M M， Ho腿a M, Clements J. Mouse lymphoma thymidine kinase locus gene mutation assay: International Workshop on Genotoxicity Test Procedures Workgroup Report[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2000， 35: 185-190.]但以上研究测试的对象为主流烟气粒相物，将主流烟气用剑桥滤片进行捕集， 然后将捕集到剑桥滤片的主流烟气粒相物进行萃取，再进行微核测试。这样的测 试方法要花费大量的时间，操作繁琐，且由于测试的只是巻烟主流烟气粒相物， 没有测试主流烟气中的气相组分，不能反映真实地主流烟气基因毒性。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术仅仅测试捕集到剑桥滤片上的主流烟气 粒相物对细胞的基因毒性的不足，而专门开发的一种用于巻烟主流烟气基因毒性 测定方法，本方法还可省略烟气收集后进行繁琐的溶剂萃取过程，可以直接并全 面的反映巻烟主流烟气的基因毒性，该方法操作简单，灵敏度高，结果可靠。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的先将培养好的细胞直接置入经 过洁净空气稀释的巻烟主流烟气中进行暴露，暴露过的细胞经培养、离心和冷甲 醇固定，然后用吖啶橙溶液荧光染色，先在低倍镜(IO倍)下进行观察，选择分 布均匀，染色较好的区域，再在荧光显微镜下计数，每个样品计数500个细胞中含 微核(包括单核、双核和多核)的细胞数量，与洁净空气暴露的对照样品比较， 判断巻烟主流烟气引起细胞微核增加的数量，进而判断巻烟主流烟气的基因毒性 的大小。
本发明的具体测定方法包括以下步骤
a. 细胞培养将测试细胞接种于细胞培养液中，在C02细胞培养箱中37'C下 培养，当细胞繁殖到一定浓度时计数，并将细胞转移至T-75mL培养瓶中，浓度为 5 . 0X105-10. 0X105细胞/瓶，添加培养液至总体积20mL，于C02细胞培养箱中37。C 下培养24h;
b. +59组细胞培养每个培养瓶吸出IO ml培养液，用这些培养液配制S9混 合物(53 1111培养液+ 45 ml NADPH(辅酶II)+2 ml S9肝组织匀桨液)，每个培 养瓶加入10ml S9混合物；C.细胞主流烟气暴露在ISO标准条件下抽吸巻烟，产生的主流烟气用洁净 空气稀释，烟气暴露浓度以稀释后的烟气中总粒相物(TPM)浓度为指标进行控制， 稀释后的烟气直接导入长有细胞的培养瓶(包括-S9组和+S9组两组样品，+59表示 加有肝组织匀浆混合物，-S9表示不加肝组织匀桨混合物)中进行主流烟气暴露。 暴露时间为60min，整个暴露过程根据监测的TPM/L值进行控制，正常对照组(包 括-S9组和+S9组两组样品)通入洁净空气暴露。
d. 微核测试暴露过的细胞培养2h后，吸出培养液并分别用20ml预热的D-PBS (含Ca2+、 Mg2+磷酸盐缓冲液)漂洗2遍，加入3ml胰酶消化液，待细胞消化后加
入2ml培养液。将细胞悬液转入离心管内，2000 rpm离心5min，弃去上清液，加入 lml含6ug/ml细胞松弛素B的细胞培养液，混合均匀，进行细胞计数并计算出总细 胞数量。加入含6ug/ml细胞松弛素B的细胞培养液调节细胞浓度约0. 1X106细胞 /ml，混合均匀后移取3.5ml至腔式载玻片，培养20h。除去培养液和腔体，用90% 冷甲醇固定玻片10min，移去密封垫，自然晾干或风干。将风干的玻片在10mg/ml 的吖啶橙溶液(用D-PBS溶液配制)中浸泡3min，然后用蒸馏水冲洗玻片30s ，黑暗 处自然晾干或风干。先在低倍镜(IO倍)下进行观察，选择分布均匀，染色较好 的区域，再在荧光显微镜下计数，每个样品计数500个细胞中含微核(包括单核、 双核和多核)的细胞数量。
e. 数据处理和分析，评价巻烟主流烟气基因毒性。
在本发明中，S9混合物是由细胞培养液和NADPH(辅酶II)和S9肝组织匀桨液 配制而成(53%培养液+ 45%NADra + 2%S9 ) 。 6 u g/ml细胞松弛素B的细胞培养 液是由细胞松弛素B和细胞培养液按比例混合配制而成。90%冷甲醇是由蒸馏水和 甲醇按体积比配制并在冰箱(-20° C)保存。10 mg/ml的吖啶橙溶液是由吖啶橙 和D-PBS按比例配制而成。
本发明依据的测试原理在于将培养好的细胞直接置入巻烟主流烟气中进行 暴露，暴露过的细胞经培养、离心和冷甲醇固定，然后用吖啶橙溶液荧光染色，再在荧光显微镜下计数细胞中含微核的细胞数量，与洁净空气暴露的对照样品比较，判断巻烟主流烟气引起细胞微核增加的数量，进而判断巻烟主流烟气的基因毒性的大小。
这一实验设计比较客观地反映了巻烟主流烟气的毒性作用，且能定量评价主流烟气的基因毒性，与现有技术相比具有操作简单，灵敏度高，结果可靠的特点，开创了 一种新的用于巻烟主流烟气基因毒性测定的方法。
图l为试验过程所用仪器的示意图。
图中l为吸烟机，2为流量计，3为泵，4为细胞培养瓶。图2为实施例l巻烟烟气引起3T3细胞的微核增加率的柱状图。图3为实施例2巻烟烟气引起3T3细胞的微核增加率的柱状图。图4为实施例3巻烟烟气引起3T3细胞的微核增加率的柱状图。
具体实施例方式
本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。实施例l
对国产某巻烟(盒标焦油15mg)进行评价。样品巻烟在ISO标准条件下抽吸，抽吸容量为每口35ml，持续时间2s,每分钟抽吸一口。巻烟燃烧产生的主流烟气用洁净的空气进行稀释，并调节烟气总粒相物浓度至41.5 ng/L、 53.8"g/L 、和67.3Pg/L,将稀释后的烟气直接导入长有细胞的培养瓶(包括-S9组和+S9组两组样品)进行暴露，每个浓度暴露时间为60min。试验中所用吸烟机与细胞培养瓶连接及烟气控制方式参见图l。
此外，将长有细胞的培养瓶(包括-S9组和+S9组两组样品)通入洁净空气作为对照样品。暴露结束后，将培养瓶中的培养液换成新鲜的培养液并置于C02培养箱中培养2h。吸出培养液并分别用20 ml预热的D-PBS漂洗2遍，加入3 ml胰酶消化液，待细胞消化后加入2ml培养液。将细胞悬液转入离心管内，2000rpm离心5min，弃去上清液，加入lml含6ug/ml细胞松弛素B的细胞培养液，混合均匀，进行细胞计数并计算出总细胞数量。加入含6 y g/ml细胞松弛素B的细胞培养液调节细胞浓度约0.lX10e细胞/ml，混合均匀后移取3.5ml至腔式载玻片，培养20h。除去培养液和腔体，用9(B冷甲醇固定玻片10min，移去密封垫，自然晾干或风干。将风干的玻片在IO mg/ml的吖啶橙溶液(用D-PBS溶液配制)中浸泡3rain，然后用蒸馏水冲洗玻片30s，黑暗处自然晾干或风干。先在低倍镜(IO倍)下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在荧光显微镜下计数，每个样品计数500个细胞中含微核(包括单核、双核和多核)的细胞数量。结果见图2。从图2可以看出随着烟气暴露浓度的增大，巻烟烟气引起细胞微核的机率显著增大，呈明显的剂量-响应关系。
实施例2
本实施例基本同于实施例l，仅是巻烟样品和烟气暴露浓度不同。巻烟样品为盒标焦油8mg国产某巻烟，烟气暴露浓度为24. 2 " g/L、 50. 6 u g/L和98. 7Pg/L，结果见图3。
实施例3
本实施例基本同于实施例l，仅是巻烟样品和烟气暴露浓度不同。巻烟样品为盒标焦油9mg进口某巻烟，烟气暴露浓度为57.5"g/L和90.5ug/L，结果见图4。
权利要求
1、一种卷烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于该测定方法包括以下步骤将培养好的细胞直接置入经过洁净空气稀释的卷烟主流烟气中进行暴露，暴露过的细胞经培养、离心和冷甲醇固定，然后用吖啶橙溶液荧光染色，先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在荧光显微镜下计数，每个样品计数500个细胞中含微核的细胞数量，与洁净空气暴露的对照样品比较，判断卷烟主流烟气引起细胞微核增加的数量，进而判断卷烟主流烟气的基因毒性的大小。
2、 根据权利要求l所述的巻烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于该 测定方法的具体步骤如下a. 细胞培养将测试细胞接种于细胞培养液中，在C02细胞培养箱中37X:下 培养，当细胞繁殖到一定浓度时计数，并将细胞转移至T-75mL培养瓶中，浓度为 5 . 0X 105-10. 0X 105细胞/瓶，添加培养液至总体积20mL，于0)2细胞培养箱中37°〇 下培养24h;b. +59组细胞培养每个培养瓶吸出IO ml培养液，用这些培养液配制S9混 合物，每个培养瓶加入10ml S9混合物；c. 细胞主流烟气暴露在ISO标准条件下抽吸巻烟，产生的主流烟气用洁净 空气稀释，烟气暴露浓度以稀释后的烟气中总粒相物(TPM)浓度为指标进行控制， 稀释后的烟气直接导入长有细胞的培养瓶(包括-S9组和+S9组两组样品)中进行 主流烟气暴露，暴露时间为60min，整个暴露过程根据监测的TPM/L值进行控制，正 常对照组(包括-S9组和+S9组两组样品)通入洁净空气暴露；d. 微核测试暴露过的细胞培养2h后，吸出培养液并分别用20ml预热的D-PBS 漂洗2遍，加入3 ml胰酶消化液，待细胞消化后加入2ml培养液，将细胞悬液转入 离心管内，2000rpm离心5min，弃去上清液，加入lml含6 u g/ml细胞松弛素B的细胞培养液，混合均匀，进行细胞计数并计算出总细胞数量，加入含6ug/ml细胞松 弛素B的细胞培养液调节细胞浓度约0.1X106细胞/ml，混合均匀后移取3. 5ml至 腔式载玻片，培养20h，除去培养液和腔体，用9(m冷甲醇固定玻片10min,移去密 封垫，自然晾干或风干，将风干的玻片在IO mg/ml的吖啶橙溶液(用D-PBS溶液配 制)中浸泡3min，然后用蒸馏水冲洗玻片30s ，黑暗处自然晾干或风干，先在低倍 镜(IO倍)下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在荧光显微镜下计 数，每个样品计数500个细胞中含微核的细胞数量；e.数据处理和分析，评价巻烟主流烟气基因毒性。
3、 根据权利要求2所述的巻烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于S9 混合物是由细胞培养液+ NADPH (辅酶II) +59肝组织匀浆液共同组成。
4、 根据权利要求3所述的巻烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于S9 混合物是由53%培养液+ 45。/。NADPH(辅酶n) + 2呢S9肝组织匀浆液混合而成。
5、 根据权利要求2所述的巻烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于6 ug/ml细胞松弛素B的细胞培养液是由细胞松弛素B和细胞培养液按比例混合配制 而成。
6、 根据权利要求2所述的巻烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于90% 冷甲醇是由蒸馏水和甲醇按体积比配制并在冰箱(-20° C)保存。
7、 根据权利要求2所述的巻烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于10 mg/ml的吖啶橙溶液是由吖啶橙和D-PBS按比例配制而成。
全文摘要
一种卷烟主流烟气基因毒性测定方法，其特征在于先将培养好的细胞直接置入经过洁净空气稀释的卷烟主流烟气中进行暴露，暴露过的细胞经培养、离心和冷甲醇固定，然后用吖啶橙溶液荧光染色，先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在荧光显微镜下计数，每个样品计数500个细胞中含微核(包括单核、双核和多核)的细胞数量，与洁净空气暴露的对照样品比较，判断卷烟主流烟气引起细胞微核增加的数量，进而判断卷烟主流烟气的基因毒性的大小。本发明能定量评价卷烟主流烟气的基因毒性，具有操作简单，灵敏度高，结果可靠的特点，开创了一种新的用于卷烟主流烟气基因毒性测定的方法。
文档编号C12Q1/06GK101580869SQ20091006533
公开日2009年11月18日 申请日期2009年7月1日 优先权日2009年7月1日
发明者卢斌斌, 孙世豪, 宗永立, 鹏 李 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院