专利名称：：卷烟烟气遗传毒性的体外细胞微核检测方法
技术领域：
：本发明涉及巻烟烟气的毒性检测分析，尤其是一种巻烟烟气遗传毒性的体外细胞微核检测方法，可应用于评价巻烟烟气的遗传毒性。
背景技术：
：微核试验作为推断化合物染色体损伤的遗传毒性检测方法，具有快速、简便、经济等特点，在环境化合物快速筛选和大量职业暴露人群检测方面得到广泛应用(曹佳，林真，余争平.微核试验——原理、方法及其在人群监测和毒性评价中的应用[M].军事医学出版社，北京，2000)。微核检测的敏感性、特异性和准确性优于其它染色体畸变分析，因此许多国家和国际组织将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理学安全性评价的必需实验(杨颖.体外微核技术及其进展.国外医学卫生学分册[J]2007，34(2):80-83)。自20世纪70年代，各国都在不断研究微核检测新方法，各种新技术、新手段层出不穷。目前，微核检测方法主要集中于镜检法(常规微核试验、胞质分裂阻滞法、荧光原位杂交试验与DNA探针、抗着丝粒抗体染色)和自动化法(图像分析系统检测和流式细胞仪检测)。但微核检测的每种方法都存在其不足之处镜检法费时费力，且存在主观误差；图像分析系统检测存在部分微核不能被识别，产生假阴性结果；以往流式细胞仪检测微核易受凋亡小体释放细胞核颗粒的影响，产生假阳性结果。同时，在大规模药物筛选和环境化合物遗传毒性检测方面，现有的微核检测方法较难满足当前需求。CORESTA(CooperationCentreforScientificResearchRelativetoTobacco)烟草烟气体外毒性测试工作组建议以L5178Y小鼠淋巴瘤细胞为染毒对象，通过荧光显微镜方法检测细胞微核率。该方法存在诸多不足染毒细胞凋亡，出现凋亡小体，干扰微核镜下观察，导致假阳性；微核镜下计数1000多个细胞，工作量大；人为因素可能影响微核镜计数结果。
发明内容本发明的目的正是针对现有技术的不足，而提供了一种可以快速、准确、高通量的微核检测新方法——一种巻烟烟气遗传毒性的体外细胞微核检测方法，该方法采用EMA和SYTOX对细胞核进行染色，进而区分微核、凋亡小体及细胞核。通过流式细胞仪，结合体外细胞培养试验，应用RNase酶和荧光探针排除干扰，可满足微核检测的高通量需求。同时本方法能够检测细胞内DNA分布。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明的巻烟烟气遗传毒性的体外细胞微核检测方法，以永生化人支气管上皮细胞为靶细胞，进行染毒处理，细胞经低渗、高渗等处理，并经两种荧光探针染色，流式细胞仪分析。具体步骤包括指数生长期细胞，烟气冷凝物染毒处理，收集细胞进行处理，经EMA探针染色，洗涤后，低渗溶液膨胀细胞，并对细胞膜打孔处理，RNaseA水解RNA，SYTOX与DNA结合，加入高渗溶液，破碎细胞膜，释放细胞核，SYTOX与DNA结合。梯度离心(2500Xg，15min)后，进行流式细胞仪分析。在本发明中，细胞处理过程如下取5乂105个细胞于15ml聚丙烯离心管中，离心，弃上清，轻打重悬细胞。加入300ii1EMA染液，浸入碎冰，可见光源照射细胞悬浮液，持续30min。光激活结束后，加入3ml2%胎牛血清液，以锡箔纸包裹管子避光。上述溶液离心，弃上清，轻打重悬细胞；于室温下，慢速加入500iil裂解液I，迅速涡旋，室温放置lh;用力打入500ii1裂解液II，涡旋，室温放置30min后，离心后，弃上清，沉淀颗粒经PBS重悬后，流式细胞仪检测。所用的裂解液I溶液包括以下组分每毫升溶液中含有氯化钠0.l-lmg，柠檬酸钠l-10mg，IGEPAL0.1-1ii1，RNaseA0.05-0.5mg，SYTOX0.25-1iimol，以去离子水配制。所用的裂解液II溶液包括以下组分每毫升溶液中含有蔗糖85.6-171.2mg，柠檬酸15-25mg，SYTOX0.25-1ymol，以去离子水配制。本发明的原理如下采用EMA对细胞进行染色。在细胞膜完整的情况下，EMA无法进入细胞，而凋亡中后期细胞及坏死细胞的细胞膜受损，EMA可进入细胞，在光激活条件下，嵌入凋亡中、后期细胞和坏死细胞的DNA，实现对死亡细胞核及凋亡小体的荧光标记。对细胞膜打孔，细胞膨胀，对核内物质(主核、微核)进行分离，进而破碎细胞膜，释放胞内核物质，并采用SYTOX对有核物质包括微核进行染色。经梯度离心，除去线粒体及其它非特异性(碎片)颗粒。预分析的主核和微核仅具有SYTOX—种探针，而凋亡小体及假阳性细胞核含SYTOX和EMA两种探针。通过流式细胞仪检测区分各种核酸物质。现将本发明所涉及的仪器、试剂、细胞前期培养、染毒以及仪器参数设置、结果处理等过程做进一步描述1.仪器准备与试剂配制。(1)主要仪器和设备流式细胞仪(BDCorporation,SanJose，CA，USA)、C02孵箱、离心机、洁净工作台。(2)试剂探针A(EMA，ethidiummonoazidebromide，InvitrogenCorporation)，探针B(SYT0X，InvitrogenCorporation),蔗糖(Sigma-AldrichCorporation)，拧樣酸納(Sigma—AldrichCorporation)，NaCl(Sigma—AldrichCorporation)，貯樣酸(Sigma-AldrichCorporation),RNaseA(Sigma-AldrichCorporation),Ig印alCA-630(Sigma-AldrichCorporation)，月台牛血清(SAFCBiosciences)，PBS(Phosphatebuffersalt,磷酸盐缓冲液)。(3)荧光探针溶液配制①EMA探针溶液EMA(l-20iig/ml)，于2%胎牛血清中配制。②裂解液I溶液每毫升溶液中含有NaCl0.l-lmg，柠檬酸钠l-10mg，IGEPAL0.1-1ii1，RNaseA0.05-0.5mg，SYTOX0.25-1iimol，以去离子水配制。③裂解液II溶液每毫升溶液中含有蔗糖85.6-171.2mg，柠檬酸15_25mg，SYTOX0.25-1iimol，以去离子水配制。2.细胞培养腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)。在37。C、5XC02培养箱中培养。细胞每周传代一次，传代后三天换液。3.细胞染毒接种6孔板，设对照组、染毒组，每组设3平行试验，处理组染毒剂量不能过高，保证细胞存活率^40%。4.细胞处理取5X1()S个细胞于15ml聚丙烯离心管中，离心(600Xg，5min)，弃上清，轻打重悬细胞。加入300ii1EMA染液，浸入碎冰(深度约2cm)，可见光源(荧光灯40-60W)照射细胞悬浮液(光源离液面约10-15cm)，持续30min。光激活结束后，加入3ml2%胎牛血清液(4t:预冷)，以锡箔纸包裹管子避光。上述溶液离心(600Xg，5min)，弃上清(约50yl上清液保留)，轻打重悬细胞(30min内进行下一步操作)。于室温下，慢速(2-3sec)加入500iU裂解液I，迅速涡旋(5sec，中速)，室温放置lh。用力打入500iil裂解液II，涡旋(5sec，中速)，室温放置30min后，离心(2500Xg，15min)后，弃上清，沉淀颗粒经PBS重悬后，流式细胞仪检测或于4t:冰箱保存(上述细胞收集、染色、裂解步骤须于l天内完成，上机前样品可于4t:放置2天不影响检测)。5.流失细胞仪激发光、发射光参数设置激发光488mm发射光SYTOX-荧光-FL1channel(530/30band-passfilter)EMA-associate荧光-FL3channel(670long~passfilter)6.流失细胞仪散点图门的设置采用流式细胞仪检测后设置不同的门，须满足六个门(见图3-8)，从而筛选健康细胞的细胞核及产生的微核。以前向角(FSC-H)和侧向角(SSC-H)为横、纵坐标作图(见图3)。FSC-H和细胞颗粒度大小密切相关，用来检测细胞的大小，通常将其设为阈值来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒物质对被测细胞的干扰。FSC-H反映颗粒大小及分布形态，SSC-H反映颗粒物内容物对激发光的折射，因此可用于反映细胞内的精细结构等。细胞核颗粒物的FSC-H与SSC-H成一定比例，低于该比例则为非核物质(即为Rl门设置)。以SYTOX荧光强度为横坐标，细胞计数为纵坐标作图(见图4)，用以观察细胞生长状态，双峰处代表有G1、S、G2/M期细胞，以观测染毒前后处于何种状态。双峰较易分开，且G2/M期细胞较少，细胞处于非分裂期，以指数生长期细胞进行染毒，保证结果的可靠性。颗粒宽度(FL1-W)为横坐标，颗粒表面积为纵坐标作图(见图5)。细胞核物质上述两种参数呈比例。设置R3门，剔除不符合该比例的颗粒(二聚体细胞核或非核物质)。经Rl及R2筛选后，剔除非核物质，R3、R4及R5研究对象均为Rl与R2共同设门后的交集。以SYTOX荧光值为横坐标均，分别以FSC-H及SSC-H为纵坐标作图(见图6，图7)。细胞核SYTOX荧光值与FSC-H及SSC-H均呈线性比例，由R3及R4的设置，可剔除细胞核和荧光强度非线性颗粒，如芽孢类细胞核颗粒，从而保证微核计数的均一性。以EMA荧光值(图中FL3-H)为横坐标，SYTOX荧光值(图中FL1-H)为纵坐标作图(见图8)。EMA在细胞裂解前加入，常用于凋亡中后期及坏死细胞核染色。EMA阳性粒子代表死亡细胞核或凋亡小体。设置R5门剔除上述两种细胞核颗粒的干扰。R3、R4及R5门筛选后的交集用于微核计数。图9中横坐标为SYTOX荧光值，纵坐标为前向角，由此分为两个集群，右上为细胞核质，左下为微核。7.检测结果处理R6和R7门内颗粒为计算对象<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>本发明与现有技术相比的优点如下1.克服了凋亡细胞对微核检测的影响，降低了假阳性结果。2.由于采用体外细胞培养，克服了体内微核检测(动物试验)的不确定性。3.采用6孔板细胞培养，流式细胞仪检测，可满足高通量微核检测要求。4.经2500Xg梯度离心，排除了线粒体、非特异性(碎片)颗粒等的干扰。因此本发明提高了检测方法的敏感性，实验结果的准确性，客观性以及可靠性c图1::染色质染色分类示意2::本发明的工艺步骤图。图3::前向角-侧向角散点图。图4::SYTOX染色细胞核柱形5::SYTOX染色细胞核的宽度_面积比例6::SYTOX荧光-前向角散点7::SYTOX荧光-侧向角散点8::EMA-SYTOX荧光散点9::SYTOX荧光-前向角散点图(对照样品)图10:SYTOX荧光-前向角散点图(染毒样品)具体实施例方式本发明结合以下实例做进一步描述。实施例1对某一国产烤烟型品牌巻烟A进行评价。巻烟烟气经过有机相(乙酸乙酯)和无机相(去离子水)收集。将两者合并，并以细胞培养液调整浓度为l支/ml。经0.22ym滤膜无菌过滤，-S(TC保存备用。接种6孔板细胞(选择腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)。在371\5%0)2培养箱中培养。细胞每周传代一次，传代后三天换液。}，经染毒处理后(0.002支/ml，2d)，消化并收集细胞。取约5X10s个细胞于15ml规格的聚丙烯离心管中，离心(600Xg，5min)，弃上清，轻打重悬细胞。加入300ii1EMA染液，浸入碎冰(深度约2cm)，可见光源(荧光灯40W)照射细胞悬浮液(光源离液面约10cm)，持续30min。光激活结束后，加入3ml2%胎牛血清液(4t:预冷)，然后以锡箔纸包裹管子避光。上述溶液离心(600Xg，5min)，弃上清(约50yl上清液保留)，轻打重悬细胞(30min以内进行下一步操作)。室温下，慢速(3sec)加入500ii1裂解液I，迅速涡旋(5sec，中速)，室温放置lh。用力打入500iU裂解液II，涡旋(5sec)，室温放置30min后，离心(2500Xg，15min)后，弃上清，沉淀颗粒经PBS重悬后，流式细胞仪检测。某一国产烤烟型品牌巻烟A诱导细胞微核形成率计算结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2对某一国产烤烟型巻烟B进行评价。巻烟烟气经过有机相(乙酸乙酯)和无机相(去离子水)收集。将两者合并，并以细胞培养液调整浓度为l支/ml。经0.22ym滤膜无菌过滤，-8(TC保存备用。接种6孔板细胞(选择腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)。在371\5%0)2培养箱中培养。细胞每周传代一次，传代后三天换液。}，经染毒处理后(0.002支/ml，2d)，消化并收集细胞。取约5X10s个细胞于15ml规格的聚丙烯离心管中，离心(600Xg，5min)，弃上清，轻打重悬细胞。加入300ii1EMA染液，浸入碎冰(深度约2cm)，可见光源(荧光灯60W)照射细胞悬浮液(光源离液面约15cm)，持续30min。光激活结束后，加入3ml2%胎牛血清液(4t:预冷)，然后以锡箔纸包裹管子避光。上述溶液离心(600Xg，5min)，弃上清(约50yl上清液保留)，轻打重悬细胞(30min以内进行下一步操作)。室温下，慢速(2sec)加入500ii1裂解液I，迅速涡旋(5sec，中速)，室温放置lh。用力打入500iU裂解液II，涡旋(5sec)，室温放置30min后，离心(2500Xg，15min)后，弃上清，沉淀颗粒经PBS重悬后，流式细胞仪检测。某一国外混合型品牌巻烟B诱导细胞微核形成率计算结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种卷烟烟气遗传毒性的体外细胞微核检测方法，其特征在于以永生化人支气管上皮细胞为靶细胞，烟气冷凝物染毒处理，细胞经低渗、高渗处理，并经两种荧光探针染色，流式细胞仪分析。2.根据权利要求l所述的体外细胞微核检测方法，其特征在于具体步骤包括指数生长期细胞，烟气冷凝物染毒处理，收集细胞进行处理，经EMA探针染色，洗涤后，低渗溶液膨胀细胞，并对细胞膜打孔处理，RNaseA水解RNA，SYT0X与DNA结合，加入高渗溶液，破碎细胞膜，释放细胞核，SYTOX与DNA结合，梯度离心(2500Xg，15min)后，进行流式细胞仪分析。3.根据权利要求l所述的体外细胞微核检测方法，其特征在于细胞处理过程如下取5X105个细胞于15ml聚丙烯离心管中，离心，弃上清，轻打重悬细胞，加入300ylEMA染液，浸入碎冰，可见光源照射细胞悬浮液，持续30min，光激活结束后，加入3ml2%胎牛血清液，以锡箔纸包裹管子避光，上述溶液离心，弃上清，轻打重悬细胞；于室温下，慢速加入500ii1裂解液I，迅速涡旋，室温放置lh;用力打入500ii1裂解液II，涡旋，室温放置30min后，离心后，弃上清，沉淀颗粒经PBS重悬后，流式细胞仪检测。4.根据权利要求1所述的体外细胞微核检测方法，其特征在于裂解液I溶液每毫升溶液中含有氯化钠0.l-lmg，柠檬酸钠l-10mg，IGEPAL0.1-1yl，RNaseA0.05-0.5mg，SYTOX0.25-liimol，以去离子水配制。5.根据权利要求1所述的体外细胞微核检测方法，其特征在于裂解液II溶液每毫升溶液中含有蔗糖85.6-171.2mg，柠檬酸15-25mg，SYTOX0.25—1ymol，以去离子水配制。全文摘要一种卷烟烟气遗传毒性的体外细胞微核检测方法，其特征在于以永生化人支气管上皮细胞为靶细胞，烟气冷凝物染毒处理，细胞经低渗、高渗处理，并经两种荧光探针染色，流式细胞仪分析。本发明与现有技术相比的优点如下1.克服了凋亡细胞对微核检测的影响，降低了假阳性结果。2.由于采用体外细胞培养，克服了体内微核检测(动物试验)的不确定性。3.采用6孔板细胞培养，流式细胞仪检测，可满足高通量微核检测要求。4.经2500×g梯度离心，排除了线粒体、非特异性(碎片)颗粒等的干扰。因此本发明提高了检测方法的敏感性，实验结果的准确性，客观性以及可靠性。文档编号C12Q1/68GK101709329SQ200910172698公开日2010年5月19日申请日期2009年11月25日优先权日2009年11月25日发明者刘兴余,朱茂祥,杨陟华,潘秀颉,谢剑平申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院