专利名称：猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重实时荧光pcr检测引物及方法
技术领域：
本发明涉及一种实时荧光PCR检测方法，具体涉及猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与 猪圆环病毒2型多重STOR Green I实时荧光PCR检测引物及方法。
背景技术：
猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCW)都能够不同程 度的导致妊娠母猪的繁殖障碍，引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕 等，在猪群中具传播快、胚胎致死率高、流行范围广、传播途径多、病原体顽固等特点，每年 给养猪业造成了巨大损失。而且经常混合感染，靠中和试验和分离病毒来确诊容易造成假 阴性，而且操作繁琐，所需时间长，寻求一种操作简单、快速的检测、鉴别诊断方法是防制这 类疾病的基础。目前，针对以上三种病毒病的诊断方法有很多，这些方法具有操作复杂、费时费 力、敏感度差及阴性率高等缺点；临床已经使用的PCR诊断技术，虽然有灵敏度高、特异性 强、快速、简便等优点，但不能准确定量；基于TaqMan技术荧光定量PCR方法能定量，但是 成本较高，且需要合成特异性探针。亟需研究和开发简便、快速、特异、成本低、定量的检测 方法。STOR Green I是非特异性结合于双链DNA的荧光染料，可以和多种扩增序列结合。 SYBRGreen I实时荧光PCR检测方法可以不用设计和合成特异的荧光标记的探针直接扩增 检测任何基因的技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题设计与合成出猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒 2型引物后，利用引物用STOR Green I实时荧光PCR检测方法同时检测出猪伪狂犬病毒、猪 细小病毒与猪圆环病毒2型三种病毒。本发明的技术方案是猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重STOR Green I实时荧光PCR检测引物的序列如下猪圆环病毒2型引物的序列如下上游引物Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3‘；下游引物P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘；猪细小病毒引物的序列如下上游引物P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘；下游引物P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'；猪伪狂犬病毒引物的序列如下上游引物Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'；下游引物P6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。利用上述引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重SYBRGreen I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光 PCR反应体系和STOR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份SYBR Green I PreMix 17 μ 1所述SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序为95°C预变性5min ；进入循环，95°C 变性15s，55°C退火20s，72°C延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95°C，然后再降至 65°C，开始以0. 5°C /s递增至95°C检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。本发明的有益效果是能够同时有效诊断和检测出PPV、PRV和PCV2三种病毒。能 最少检测出189拷贝猪伪狂犬病毒质粒、203拷贝猪细小病毒质粒和173拷贝猪圆环病毒 2型质粒，不能检测出非特异的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒，有利于 妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别与诊断，并且具有的较好敏感性、重复性和稳定性，为PRV、 PPV.PCV2的检测提供了一种新的方法，可作为规模化猪场PRV、PPV、PCV2的净化检测方法， 建立无PRV、PPV、PCV2的猪群，同时也为PRV、PPV、PCV2感染的分子流行病学调查，研究PRV、 PPV、PCV2分子发病机制，早期诊断，诊断试剂盒的研制与开发，药物或疫苗的免疫机制提供 了试验依据和技术手段。
图1为PRV gH基因质粒的PCR鉴定结果；图2为PPV VP2部分基因质粒的PCR鉴定结果；图3为PCV20RF2部分基因质粒的PCR鉴定结果；其中，图1，图2，图3中1.目的片段M. DL 2000Marker图4为多重STOR Green I荧光定量PCR反应溶解曲线；图5为多重STOR Green I实时荧光PCR反应特异性试验溶解曲线；图6为多重STORGreen I实时荧光PCR反应同一浓度重复性试验溶解曲线；图7为多重STOR Green I实时荧光PCR反应不同浓度重复性试验溶解曲线。
具体实施例方式实施例猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重STOR Green I实时荧光PCR检 测引物的序列如下猪圆环病毒2型引物的序列如下上游引物Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3'；下游引物P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘；PlP5P2 P6DNAddH20_
0. 5+0. 5+0. 5 μ 1 0. 5+0. 5+0. 5 μ 1 1 + 1 + 1 μ 1 2μ 1
猪细小病毒引物的序列如下上游引物P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘；下游引物P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'；猪伪狂犬病毒引物的序列如下上游引物Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'；下游引物P6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。利用上述引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重STOR GreenI实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光 PCR反应体系和STOR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。
所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份
SYBR Green I PreMix 17 μ 1
Ρ1/Ρ3/Ρ50. 5+0. 5+0. 5 μ 1
Ρ2/Ρ4/Ρ60. 5+0. 5+0. 5 μ 1
DNA1+1+1 μ 1
(MH2O2 μ 1_25 μ 1所述SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序为95°C预变性5min ；进入循环，95°C 变性15s，55°C退火20s，72°C延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95°C，然后再降至 65°C，开始以0. 5°C /s递增至95°C检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。上述实施例中，关于材料和方法如下1材料与方法1. 1 材料1. 1. 1毒株、细胞株和菌株PK-15细胞，猪伪狂犬病毒标准毒株均购自中国兽药监察所；猪细小病毒，猪圆环 病毒2型，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪瘟病毒和猪流感病毒标准毒株均购自河南省动物 性食品安全重点实验室；工程菌DH5ci感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司。1. 1. 2常用溶液及培养基LB液体培养基；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)贮存液，100mg/ml ；IPTG浓度为 100mg/ml ；X-gal浓度为20mg/ml，保存于棕色瓶内或用铝箔包裹的瓶内，以上溶液均贮存 于-20°C备用。1. 1. 3主要仪器及试剂紫外凝胶成像系统购自美国ALPHA INNOTECH公司；Rotor-Gene 3000型实时定量 PCR扩增仪购自澳大利亚基因公司、PTC-200型PCR仪购自美国MJ公司、3K30型高速冷冻 离心机购自德国SIGMA公司等。SYBR Green I PreMix ；EX TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000购自大连宝生物工 程有限公司；Protein K购自华美生物工程公司；DMEM培养基购自GIBC0BRL公司；胎牛血 清购自Hyclone公司；胰蛋白酶购自LTI公司；T4DNA连接酶、PGEM-T Easy质粒载体均购 自!Iomega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物公司。1. 2 方法1. 2. 1PCV2的培养增殖将PCV2同步接种于未贴壁的冊-15细胞，接毒量为培养液的1/10，将细胞置于 37V,5% CO2的培养箱中培养7 后，终止培养并收毒。反复冻融2 3次，收集病毒液， 直接进行病毒RNA的提取或-80°C贮存备用。1. 2. 2PPV的培养增殖将处于对数生长期的PK-15细胞用0. 25%的胰酶消化后，放入37°C,5% CO2的培 养箱中培养。待细胞贴壁长至生长表面的60% 70%时，取出培养瓶用PBS液洗2 3次 后，按培养液1/10体积的接种量接种PPV病毒，然后将细胞置于37°C，5% CO2的培养箱中 培养。每天在倒置显微镜下观察细胞病变，培养7 后收毒。将收集的病毒液反复冻融3 次，直接进行病毒DNA的提取或_70°C贮存备用。1. 2. 3PRV的培养增殖当H(-15细胞达90%以上时，接种100TCID5(1PRV，37°C吸附lh，洗去未吸附病毒，加 入适量的细胞维持液，待细胞病变达到70%时，终止培养，反复冻融2 3次，收集病毒液， 直接进行病毒DNA的提取或_80°C贮存备用。1.2. 4引物设计与合成以GenBank公布猪圆环病毒2型0RF2基因为参照序列(AF027217)，猪细小病毒 NADL-2株(NC001718)VP2基因序列，Klupp等报道的猪伪狂犬病毒gH基因序列，用I^rimer Premier5. 0生物软件分别设计出1对特异性引物，预计扩增片段分别为171bp、313bp和 35^p，引物的序列如下猪圆环病毒2型引物的序列如下上游引物Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3‘；下游引物P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘；猪细小病毒引物的序列如下上游引物P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3'；下游引物P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'；猪伪狂犬病毒引物的序列如下上游引物Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'；下游引物P6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。1. 2. 5PCV2、PPV、PRV 病毒 DNA 的提取传统的蛋白酶K提取方法取增殖的病毒液各450μ 1，加入等体积样品裂解缓冲 液
，混勻，再加入蛋白酶 K (终 浓度为200 μ g/m L)，56°C水浴lh，然后加入等体积的平衡酚，混勻，IOOOOrpm离心5min。 取上清，经酚氯仿异戊醇05 24 1)再次抽提后用2倍体积的异丙醇沉淀，-200C 放置30min，12000rpm离心lOmin，70 %乙醇洗涤2次，干燥，加入25 μ 1超纯水溶解，贮存 于-20°C备用。1. 2. 6猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒cDNA的制备
分别取400 u l的病毒液，加入400 u l Trizol，剧烈振荡；加入100 u l氯仿异戊醇(241)剧烈振荡30s，混匀；放入台式离心机12000rpm，室温离心5min；取上层水相，小心转移至经DEPC水处理过的1．5ml无菌离心管中，加入150 u l无水乙醇，混匀；将上步中的溶液全部转移到UnLQ一10柱子中，室温放置2min，使溶液中的RNA尽可能的与柱子的滤膜相结合，8000rpm，离心lmin；取出柱子弃去收集管中的废液，将柱子放入收集管中并加入450 u 1RPE Solution，室温静置2min，10000rpm，离心30s，并重复一次；取出柱子，弃去废液，12000rpm，空离3min；取出柱子，放入经DEPC水处理过的1．5ml无菌离心管中，于柱内膜中央加入16 u l DEPC水，55—80℃放置2min；10000rpm，离心lmin，收集管内溶液，其中含有所抽提的三种病毒的RNA，可立即使用或一70℃贮存备用。
在提取的三种病毒的RNA中分别加入反转录随机引物(10pmol／u 1)，4 u ldNTP(2．5mmol／L)，70℃放置5min，冰浴2min；加入4 u l反转录Buffer，2 u l 0．1M DTT，l u l Rnaseinfnibitor(40u／IX 1)，42℃放置2min；加入l u 1M—MLV反转录酶(200u／u 1)，42℃作用lh，70℃放置15min，灭活反转录酶。将反转录后的cDNA于一20℃贮存备用。
1．2．7质粒模板标准品的制备
以提取的PCV2DNA、PRV DNA和PPV DNA为模板，用优化的条件扩增ORF2基因片段、州基因片段和NSl基因片段。在50 u l反应体系中分别依次加入lo×PCR缓沖液5 u l，MgCl，3mmol／L，dNTPs浓度为200 u m／L，Taq酶1U，引物浓度P1／Pa／P5、P2／P4／P6为0．5 u l，模板5 u l，最后用双蒸水补至50 u l，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增95℃预变性5min后，进入循环95℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环后，72℃延伸10min，4℃结束反应。2．5％琼脂糖凝胶电泳。
将扩增出目的片段按胶回收试剂盒回收，按照载体连接试剂盒将目的片段与pGEM—TEasy载体相连接，转化DH5a感受态细胞，挑选阳性菌落，进行菌液PCR鉴定后，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，送大连宝生物工程有限公司进行测序。经测序验证的阳性质粒作为模板标准品，并分别命名为pGEM—VP2、pGEM—gH和pGEM—PCV2。
1．2．8PPV、PRV、PCV2多重SYBR Green工实时荧光PCR反应体系条件的优化
SYBR Green工实时荧光PCR反应体系如下
在25 u l体系中加入以下成份
SYBR Green工PreMix15 u l
P1／Pa／P50．5+0．5+0．5 ix l
P2／P4／P60．5+0．5+0．5 ix l
DNA1+1+1 IX l
ddH。04 IX l[Oloo]
0]]25 u l
瞬时离心后，将EP管置于荧光定量PCR仪上95℃预变性5min；进入循环，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0．5℃／s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。同时设立无模板的阴性对照。本发明反应条件的优化是在3种病毒质粒模板等量的条件下进行的。
1．2．8．1引物浓度的优化
分别以50pmol/y 1 的引物浓度 0. 2 μ 1、0· 3μ 1、0· 4μ 1、0· 5μ 1、0· 6μ 1、0· 7μ 1、 0.8μ 1、0.9μ 1进行STOR Green I实时荧光PCR反应，以选取扩增该病毒的最佳引物浓度。 添加时取相等体积的引物量。1.2.8. 2退火温度的优化多重SYBR Green I 实时荧光 PCR 分别以 52°C、53°C、54°C、55°C、56°C、57°C、58°C 的退火温度进行反应，以确定最佳的退火温度。1. 2. 8. 3SYBR PreMix 浓度的优化本发明中荧光染料预混酶STOR Green I PreMix的浓度是5υ/μ 1，固定STOR Green I实时荧光PCR反应体系的总体积，通过改变荧光染料预混酶STOR PreMix的添加量 来筛选STOR Green I荧光定量PCR反应体系中STOR PreMix的最佳浓度。分别以10 μ 1、 12μ 1、15μ 1、17μ 1、20μ 1、22μ 1 的浓度进行筛选。1.2. 9特异性检验按照STOR Green I荧光定量反应体系，分别加入PCV2、PPV、PRV细胞毒DNA 1 μ 1 (约20ng)，猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞毒cDNA 1 μ 1 (约20ng)，猪流感病毒细胞毒 cDNA 1 μ 1 (约20ng)，猪瘟病毒细胞毒cDNA 1 μ 1 (约20ng)，同时设阴性对照，验证其特异性。1.2. 10重复性检验选取PCV2、PPV、PRV同一浓度的质粒标准品进行多重SYBR Green I实时荧光PCR 反应重复性试验，反应重复3次；将不同浓度的质粒标准品进行多重STOR Green I实时 荧光PCR反应重复性试验，反应重复3次；通过每种病毒的Tm值和溶解曲线的分析，验证 PCV2、PPV、PRV多重STOR Green I实时荧光PCR方法的稳定性。1.2. 11实时荧光PCR敏感性测定分别将PCV2、PPV、PRV的重组质粒测OD26tl值，计算出每微升的拷贝数，然后进行 10倍梯度稀释，以此作为模板进行多重STOR Green I实时荧光PCR反应，进而确定多重 SYBRGreen I实时荧光PCR反应检测每种病毒的敏感性。1. 2. 12疑似PCV2、PPV、PRV病料样品检测及与常规PCR检测方法的比较取采自河南省郑州、洛阳、南阳地市猪场的疑似PCV2、PPV、PRV感染的病料进行多 重STOR Green I实时荧光PCR和检测，以证实该方法的实用性。2 结果2.1质粒PCR扩增如图1，图2，图3的PRV gH基因、PPV VP2、PCV20RF2部分基因质粒PCR鉴定结果所 示，分别扩增出了与预计大小相一致的171bp、355bp和31!3bp的片段。pGEM-PCV、pGEM_PRV 和pGEM-PPV经EcoR I酶切鉴定，得到产物与预期的条带一致。测序与国内流行的毒株相 比，核苷酸同源性在99. 6%,99. 8%,99. 7%以上。测得提取的PPV、PCV2、PRV质粒DNA浓度分别为pGEM_VP2质量浓度=141 μ g/ ml, pGEM-PCV2 质量浓度=77. 5 μ g/ml, pGEM-gH 质量浓度=145 μ g/ml。经计算， PPVpGEM-VP2 质粒浓度为 7. 86X IO13 拷贝 /ml，pGEM-PCV 质粒浓度为 4. 53X IO13 拷贝 /ml， pGEM-gH质粒浓度为8. 00X IO13拷贝/ml。2. 2PPV、PRV、PCV2多重STOR Green I实时荧光PCR反应条件的优化结果[O122] SYBR Green工虽然是一种无特异性的荧光染料，但在进行多重PCR试验时，它并非均一的和所有的目的片段结合，而是会和某些片段优先结合，这就需要对反应体系进行条件优化，保证体系中有足够的染料和各种引物的比例适中。[O123] 2．2．1引物浓度优化结果
PCV21PPV1PRY引物均采用50pmoL／u 10．5 u l的量在25 u l体系中进行反应，能够产生特异性的单一峰值，阴性对照无特异性峰值产生。PCV21PPV1PRY多重SYBR Green工实时荧光PCR反应的最佳引物浓度均为0．5 u l。[O125] 2．2．2退火温度优化结果
PPV1PRY1PCV2在退火温度55℃时，均产生了特异性的峰值。PCV2／m值分别为81．5℃，81．5℃，81．3℃；PRY／m值分别为87．7℃，87．7℃，87．2℃；PPV／m值分别为74．2℃，74．6℃，74．9℃。阴性对照均无特异性峰值产生。PPV1PRY1PCV2多重SYBR Green工实时荧光PCR反应的最佳退火温度为55℃。[O127] 2．2．3SYBR Green工PreMix浓度的优化结果[O128] PPV1PRY1PCV2多重SYBR Green工实时荧光PCR反应中SYBR Green工PreMix添加量在17 u l时，三者均可产生特异性的峰值，阴性对照无特异性峰值产生。
2．3多重SYBR Green工实时荧光PCR反应体系的确定[O130] 通过各个反应条件的优化，最终确定了PPV1PRY1PCV2多重SYBR Green工实时荧光PCR反应体系，在25 u l体系中加入以下成份
3]] SYBR Green工PreMix17 u l
P1／P3／P50．5+0．5+0．5 u l
P2／P4／P60．5+0．5+0．5 u l[O134] DNA1+1+1 u l[O135] ddH。02 u l[O136]．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一一[O137]25 u l
该反应的循环参数最终确定为95℃预变性5min；进入循环，95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95℃，然后再降至65℃，开始以0．5℃／s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。[O139] 2．4PCV21PPV1PRY多重SYBR Green工实时荧光PCR扩增产物的溶解曲线及PCV21PPV1PRY Tm值的确定
本发明利用Tm值的不同进行核酸片段的区分，核酸片段的Tm值主要与GC含量1序列长度和序列结构有关。PRY的扩增片段基因序列长355bp，GC含量比一般病毒高，其Tm值最高，达到了87℃以上，很容易与其他病毒区分；PCV2扩增片段长17lbp，Tm值比PRY的低，在82℃左右；PPV的扩增片段为313bp，GC含量相对最低，Tm值比PRY1PCV2的Tm值都低，况且PRY1PPV和PCV2三者扩增产物的长度也不同，所以PRY1PPV1PCV2的Tm值可以很好的区分。
按照PCV21PPV1PRY多重SYBR Green工实时荧光PCR反应条件，以PCV21PPV1PRY的重组质粒为模板，进行PCR反应，经软件Rotor—gen6．0分析后得到溶解曲线如图4所示，从图中可以看出三个特异性的峰值所对应的温度即为PRY扩增片段的Tm值1PPV扩增片段的Tm值和PCV2扩增片段的Tm值，但是它们并不是固定不变的，它们的Tm值会在一定的温 度范围内变动，通过多个批次试验数据的收集整理后，最终确定了 PCV2、PPV、PRV 3种病毒 的 Tm 值，分别为:PCV280 81. 2°C，PRV 86 87. 5°C，PPV 73. 5 75. 2°C。阴性对照则 无峰值产生。三种病毒的Tm值相差较大，因此，可以利用三者扩增产物片段Tm值的不同及 溶解曲线的3个特异性的峰进行诊断与鉴别区分。2. 5多重STOR Green I实时荧光PCR特异性检验结果从PCV2、PPV、PRV多重STOR Green I实时荧光PCR特异性试验结果如图5所示， 从图中可以看出，对照组中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒及阴性对照均 无特异性峰值产生。只有试验组中的PCV2、PPV、PRV多重实时荧光PCR产生了特异性的三 个峰值。PCV2 Tm 值为 80. 5 °C，PPV Tm 值为 74. 5 °C，PRV Tm 值为 87. 5 °C。2. 6多重STOR Green I实时荧光PCR重复性试验结果2. 6. 1同一浓度的PCV2、PPV、PRV多重SYBR Green I实时荧光PCR重复性试验结
果3次重复性试验中，各个病毒的Tm值都较为稳定。如表1，图6所示，对照组中猪 繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒及阴性对照均无特异性峰值产生。同浓度 的PCV2、PPV、PRV多重STOR Green I实时荧光PCR反应具有很好的稳定性。表1多重STOR Green I实时荧光PCR的同一浓度重复性试验分析
权利要求
1.猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重STORGreen I实时荧光PCR检测 引物，其特征在于猪圆环病毒2型引物的序列如下 上游引物 Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3‘； 下游引物 P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘； 猪细小病毒引物的序列如下 上游引物 P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘； 下游引物 P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'； 猪伪狂犬病毒引物的序列如下 上游引物 Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'； 下游引物 Ρ6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。
2.利用权利要求1所述引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重 SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下STOR Green I实时 荧光PCR反应体系和STOR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测，其特征在于所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份SYBR Green I PreMix 17 μ 1Ρ1/Ρ3/Ρ50. 5+0. 5+0. 5 μ 1Ρ2/Ρ4/Ρ60. 5+0. 5+0. 5 μ 1DNA1+1+1 μ 1ddH2O2 μ 1 .25 μ 1所述STOR Green I实时荧光PCR扩增程序为95°C预变性5min ；进入循环，95°C变性 15s, 55°C退火20s，72°C延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95°C，然后再降至65°C， 开始以0. 5°C /s递增至95°C检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。
全文摘要
本发明公开了一种猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法，设计合成出引物，利用引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，利用SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。本发明的有益效果是能够同时有效诊断和检测出猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型三种病毒，不能检测出非特异的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别与诊断，并且具有的较好敏感性、重复性和稳定性。
文档编号C12R1/93GK102071259SQ200910172719
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者党玉丽, 崔保安, 李明凤, 胡慧, 郭显坡, 陈红英, 魏战勇 申请人:河南农业大学