一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，涉及一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒，尤其涉及一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒的制备方法。

背景技术：

醛固酮(英文：aldosterone)是一种类固醇类激素(盐皮质激素家族)，主要作用于肾脏，进行钠离子及水分子的再吸收。整体来说，醛固酮为一种增进肾脏对于离子及水分子再吸收作用的一种激素，为肾素-血管紧张素系统的一部分，其作用是促进na+在体内贮留，同时排出k+，是由肾上腺皮质球状带生成，并受肾脏分泌的血管紧张肽原酶，即血管紧张肽的调节，醛固酮进入远曲小管和集合管上皮细胞后，与胞浆内受体结合，形成激素-受体复合体，后者通过核膜，与核中dna特异性结合位点相互作用，调节特异性mrna转录，最终合成多种醛固酮诱导蛋白，进而使管腔膜对na+的通透性增大，线粒体内atp合成和管周膜上钠泵的活动性增加。从而导致对na+的重吸收增强，对水的重吸收增加，k+的排出量增加。

目前在国内，醛固酮检测灵敏度较低，线性范围较窄，检测过程耗时长，并且通常只适用手工操作，不利于全自动检测仪器的检测，从而限制了该方法的推广应用。

技术实现要素：

本发明的目的是：针对上述不足，提供稳定性好、灵敏度高、线性范围宽、特异性高、精密度好、检测时间短的一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒及其制备方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1的各组分及浓度包括：

所述试剂r2由第二缓冲液、保存液以及胶乳微球抗体偶联物组成，其保存液由甘氨酸、第二稳定剂、第二防腐剂构成，胶乳微球抗体偶联物由胶乳微球、抗醛固酮单克隆抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐构成，各组分的浓度为：

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.01-0.3g/l。

所述试剂r1以及试剂r2中的第一缓冲液和第二缓冲液包括pbs缓冲液、hepes缓冲液、甘氨酸缓冲体系、mes缓冲液、tris缓冲液中的一种或几种。

所述试剂r1的第一稳定剂以及r2中的第二稳定剂均为酪蛋白、甘露醇、牛血清白蛋白中的一种或几种以上混合物。

所述试剂r1中的表面活性剂为吐温20、曲拉通、聚乙烯吡咯烷酮、辛基苯基聚氧乙烯醚中的一种或几种以上混合物。

所述试剂r1中的第一防腐剂以及r2中的第二防腐剂均为叠氮钠、proclin-950、proclin-300、硫柳汞中的一种。

所述试剂r1的ph在6.00-8.50之间，所述试剂r2的ph在6.00-8.50之间。

一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：a)、试剂r1制备：

在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入第一缓冲液、第一稳定剂、d-海藻糖、表面活性剂、聚乙二醇6000和第一防腐剂，搅拌20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节ph值到6.00-8.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；

b)、试剂r2制备：

b1缓冲液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入第二缓冲液，搅拌20-30分钟至物料完全溶解，调节ph值到6.00-8.50之间，继续搅拌5-10分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；

b2保存液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入甘氨酸、第二稳定剂和第二防腐剂，搅拌20-30分钟至物料完全溶解，调节ph值到6.00-8.50之间，继续搅拌5-10分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；

b3胶乳微球抗体偶联物的制备：将胶乳微球以缓冲液稀释到0.1-2.0％的浓度，将抗醛固酮单克隆抗体以缓冲液稀释到0.05-1.5g/l的浓度，二者进行混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以缓冲液溶解到0.01-0.3g/l的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应180分钟，加入牛血清白蛋白封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14800rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗2次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声重悬，将制备好的r2装入成品罐中，进行标识。

与现有技术相比，本发明所达到的技术效果是：该发明首次实现在生化分析仪上检测醛固酮的含量，其检测范围可达到5-1000pg/ml；

该方法与其他检测方法相比具有操作简单、准确、快速的特点，并可在全自动生化分析仪上批量分析实现高通量检测；

该试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、线性范围宽、特异性高、精密度好、检测时间短特点，可广泛应用到基础和临床医学的各个领域。

附图说明

图1是本发明实施例4中胶乳微球间接偶联醛固酮定标曲线图。其中x轴表示标准品浓度，y轴表示吸光度。

图2是本发明实施例4中线性范围测定图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

本发明的一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的三羟甲基氨基甲烷，其含量为6.0g/l、作为第一稳定剂的牛血清白蛋白，其含量为0.5g/l、d-海藻糖，其含量为5g/l、作为表面活性剂的曲拉通，其含量为1ml/l、聚乙二醇6000，其含量为60g/l、作为第一防腐剂的proclin-950，其含量为0.8ml/l；

所述试剂r2由作为第二缓冲液的2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物、保存液以及胶乳微球抗体偶联物组成，其保存液由甘氨酸、作为第二稳定剂的牛血清白蛋白、作为第二防腐剂的proclin-950构成，胶乳微球抗体偶联物由胶乳微球、抗醛固酮单克隆抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐构成，各组分的浓度为：2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，其含量为10.00g/l、甘氨酸，其含量为1.26g/l、牛血清白蛋白，其含量为0.5g/l、proclin-950，其含量为0.8ml/l、胶乳微球，其含量为0.1％、抗醛固酮单克隆抗体，其含量为0.05g/l、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其含量为0.01g/l。

所述试剂r1的ph在6.00，所述试剂r2的ph在6.00。

一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：a)、试剂r1制备：

在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、d-海藻糖、曲拉通、聚乙二醇6000和proclin-950，搅拌20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节ph值到6.00-8.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；

b)、试剂r2制备：

b1缓冲液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌20分钟至物料完全溶解，调节ph值到6.00，继续搅拌5分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；

b2保存液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入甘氨酸、牛血清白蛋白和proclin-950，搅拌20分钟至物料完全溶解，调节ph值到6.00，继续搅拌5分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；

b3胶乳微球抗体偶联物的制备：将胶乳微球以缓冲液稀释到0.1％的浓度，将抗醛固酮单克隆抗体以缓冲液稀释到0.05g/l的浓度，二者进行混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以缓冲液溶解到0.01g/l的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应180分钟，加入牛血清白蛋白封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14800rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗2次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声重悬，将制备好的r2装入成品罐中，进行标识。

实施例二：

本发明的一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的三羟甲基氨基甲烷，其含量为9g/l、作为第一稳定剂的甘露醇，其含量为1.2g/l、d-海藻糖，其含量为12g/l、作为表面活性剂的吐温20，其含量为3ml/l、聚乙二醇6000，其含量为90g/l、作为第一防腐剂的proclin-300，其含量为1.4ml/l；

所述试剂r2由作为第二缓冲液的2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物、保存液以及胶乳微球抗体偶联物组成，其保存液由甘氨酸、作为第二稳定剂的甘露醇、作为第二防腐剂的proclin-300构成，胶乳微球抗体偶联物由胶乳微球、抗醛固酮单克隆抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐构成，各组分的浓度为：2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，其含量为18g/l、甘氨酸，其含量为5.5g/l、甘露醇，其含量为1.2g/l、proclin-300，其含量为1.4ml/l、胶乳微球，其含量为1.0％、抗醛固酮单克隆抗体，其含量为0.8g/l、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其含量为0.1g/l。

所述试剂r1的ph在7.50，所述试剂r2的ph在7.50。

一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：a)、试剂r1制备：

在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入三羟甲基氨基甲烷、甘露醇、d-海藻糖、吐温20、聚乙二醇6000和proclin-300，搅拌25分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节ph值到7.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；

b)、试剂r2制备：

b1缓冲液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌25分钟至物料完全溶解，调节ph值到7.50之间，继续搅拌7分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；

b2保存液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入甘氨酸、甘露醇和proclin-300，搅拌25分钟至物料完全溶解，调节ph值到7.50之间，继续搅拌7分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；

b3胶乳微球抗体偶联物的制备：将胶乳微球以缓冲液稀释到1.0％的浓度，将抗醛固酮单克隆抗体以缓冲液稀释到0.8g/l的浓度，二者进行混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以缓冲液溶解到0.1g/l的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应180分钟，加入牛血清白蛋白封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14800rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗2次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声重悬，将制备好的r2装入成品罐中，进行标识。

实施例三：

本发明的一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的三羟甲基氨基甲烷，其含量为12.2g/l、作为第一稳定剂的酪蛋白，其含量为2g/l、d-海藻糖，其含量为20g/l、作为表面活性剂的聚乙烯吡咯烷酮，其含量为5ml/l、聚乙二醇6000，其含量为120g/l、作为第一防腐剂的叠氮钠，其含量为2.0ml/l；

所述试剂r2由作为第二缓冲液的2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物、保存液以及胶乳微球抗体偶联物组成，其保存液由甘氨酸、作为第二稳定剂的酪蛋白、作为第二防腐剂的叠氮钠构成，胶乳微球抗体偶联物由胶乳微球、抗醛固酮单克隆抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐构成，各组分的浓度为：2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，其含量为25.30g/l、甘氨酸，其含量为9.83g/l、酪蛋白，其含量为2.0g/l、叠氮钠，其含量为2.0ml/l、胶乳微球，其含量为2.0％、抗醛固酮单克隆抗体，其含量为1.5g/l、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其含量为0.3g/l。

所述试剂r1的ph在8.50，所述试剂r2的ph在8.50。

一种醛固酮胶乳增强检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：a)、试剂r1制备：

在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入三羟甲基氨基甲烷、酪蛋白、d-海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇6000和叠氮钠，搅拌30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节ph值到8.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；

b)、试剂r2制备：

b1缓冲液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌30分钟至物料完全溶解，调节ph值到8.50之间，继续搅拌10分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；

b2保存液的制备：在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入甘氨酸、酪蛋白和叠氮钠，搅拌30分钟至物料完全溶解，调节ph值到8.50之间，继续搅拌10分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积，溶液存放备用，进行标识；

b3胶乳微球抗体偶联物的制备：将胶乳微球以缓冲液稀释到2.0％的浓度，将抗醛固酮单克隆抗体以缓冲液稀释到1.5g/l的浓度，二者进行混匀，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以缓冲液溶解到0.3g/l的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应180分钟，加入牛血清白蛋白封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14800rpm的转速离心30分钟，吸去上清，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗2次，最后一次离心去上清后，加入保存液，超声重悬，将制备好的r2装入成品罐中，进行标识。

实施例四：

胶乳微球间接偶联醛固酮，使用标准品进行定标，结果如表1和图1所示

表1：胶乳微球间接偶联醛固酮定标结果：

选取待测样本用生理盐水进行稀释，产生接近于方法线性范围低限浓度水平的样本，一般为4个浓度水平，分别为：4.0pg/ml、4.5pg/ml、5.0pg/ml和5.5pg/ml。每个浓度水平样本重复测定10次，以cv≤8％为可接受界值，由数据中选取cv值等于或小于可接受界值的最低浓度水平做为检测范围低限，结果如表2所示。

选取待测样本用生理盐水进行稀释，产生接近于方法线性范围高限浓度水平的样本，一般为4个浓度水平，分别为：800pg/ml、1000pg/ml、1200pg/ml和1500pg/ml。每个浓度水平样本重复测定10次，以cv≤8％为可接受界值，由数据中选取cv值等于或小于可接受界值的最高浓度水平做为检测范围高限，结果如表3所示。

表2：

当样本浓度低于5.0pg/ml时，cv＞8％；当样本浓度高于5.0pg/ml时，cv＜8％；故线性范围低限定为5.0pg/ml。

表3：

当样本浓度高于1000pg/ml时，cv＞8％；当样本浓度低于1000pg/ml时，cv＜8％；故线性范围高限定为1000pg/ml。

综上所述，该发明的线性范围可做到5-1000pg/ml。

实施例五：

精密度cv检测：

胶乳微球间接偶联醛固酮，对四个样本重复检测10次，检测结果如表4所示：

精密度cv较小，8％以内。

现有的醛固酮试剂与本发明的相关性测试：

对照现有试剂与本发明试剂盒按照各自的参数同时检测20例临床血清，对测定结果进行相关性分析，结果如图所示，r2＞0.95，符合临床要求。

综上所述：与现有技术相比，本发明所达到的技术效果是：该发明首次实现在生化分析仪上检测醛固酮的含量，其检测范围可达到5-1000pg/ml；

该方法与其他检测方法相比具有操作简单、准确、快速的特点，并可在全自动生化分析仪上批量分析实现高通量检测；

该试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、线性范围宽、特异性高、精密度好、检测时间短特点，可广泛应用到基础和临床医学的各个领域。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。