本发明属于医学检测技术领域，涉及一种鳞状上皮细胞癌抗原检测试剂。
背景技术：
鳞状细胞癌抗原(squamouscellcareinomaantigen，scca)是一种特异性很好而且是最早用于诊断癌的肿瘤标志物。他是一种从子宫组织中提取的糖蛋白，属于丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制物家族的糖蛋白，由高度同源而生物学功能截然不同的scca1和scca2组成，均含有390个氨基酸，分子量约为45kda。scca广泛存在于不同器官的正常组织中(含量极微)和恶性病变的上皮细胞中；血清中的scca浓度和鳞状细胞癌分化程度有关，正常人血清中scca浓度小于1.5ng/ml。少数良性疾病也能见scc升高，如肺部感染、皮肤炎、肾衰和肝病。其对子宫颈癌有较高的诊断价值，敏感性及特异性较好，同时辅助诊断肺部、食道等鳞癌，其水平与肿瘤的发展程度有关，与cyfra21-1联合检测可以提高准确性及灵敏度。
目前已知的鳞状上皮细胞癌抗原测定方法有放射免疫法(ria)、酶联免疫吸附法(elisa)、胶乳增强比浊法等。然而，elisa方法局限性较大，特异性差，灵敏度低并且准确性不高。放射性免疫疗法虽然被认为是准确可靠的方法，但是放射性同位素的辐射影响，废物处理需要专门的实验室，成本高和半衰期短的弊端，已经使该方法逐渐淘汰。乳胶增强免疫比浊法操作简单、快速，但是灵敏度低且重复性差。
cn103454417a公开了一种鳞状上皮细胞癌抗原生物传感器的制备方法和应用，其基于氮掺杂石墨烯和pd-au/c负载型纳米催化剂，制备了一种夹心型电化学免疫传感器，其可实现对鳞状上皮细胞癌抗原的快速检测，但是检测精确度较低。cn104614526a公开了一种鳞状上皮细胞内癌scc-tct联合检测方法；该方法是将宫颈部位的脱落细胞取样，预处理后得到样品溶液；将皂素和样品溶液，离心后取沉淀，加入磷酸盐缓冲液混匀后，进行细胞数总数的计数；将计数后的细胞悬液离心后加入磷酸盐缓冲液进行至少一次冻融，得到scc抗原游离、释放后的样品溶液；然后对其进行细胞内scc抗原酶标检验分析；根据测定结果判断筛选，将高于临界值的标本筛选出来，该标本相对应的样品溶液在液基细胞仪上制成均匀涂片后固定，巴氏染色法染色，显微镜细胞形态学分析，判断肿瘤细胞的形态；该方法太过复杂。
因此，想要提供一种制备方法简单，检测灵敏度高的检测试剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种鳞状上皮细胞癌抗原检测试剂，本发明提供的鳞状上皮细胞癌抗原检测试剂成分简单，检测灵敏度高，并且可在较短的时间内实现快速精确的检测。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种鳞状上皮细胞癌抗原检测试剂，所述检测试剂包括包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球、碱性磷酸酶标记的鳞状上皮细胞癌抗原抗体和化学发光底物；
其中，所述磁性微球为二氧化硅磁性复合微粒。
本发明特异性的选择了二氧化硅磁性复合微球，相比于其他磁性微球，其具有更多的结合位点，可结合更多的抗体，进而可以使本发明提供的检测试剂在较低的检测浓度下具有较高的检测精度；并且包被性能较好，不易洗脱，可以减少在后续检测样品过程中由于包被较差而造成的误差增大现象。
在本发明中，所述二氧化硅磁性复合微粒包括二氧化硅壳层和磁性三氧化二铁纳米内核。
本发明的二氧化硅磁性复合微粒为现有技术中可获得的磁性微球。
优选地，所述磁性微球的粒径为5-10μm，例如5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm等，进一步优选8-10μm，例如8.2μm、8.5μm、8.8μm、9.0μm、9.2μm、9.5μm、9.8μm等。
本发明优选磁性微球的粒径在5-10μm范围内，若粒径过大，则可能会造成鳞状上皮细胞癌抗原抗体的包被量过多，容易使部分鳞状上皮细胞癌抗原抗体脱落，进而影响测量精确度；若粒径过小，则不利于鳞状上皮细胞癌抗原抗体的包被。
在本发明中，所述化学发光底物为4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物。
相较于其他发光底物，本发明的发光底物发光时间较长，反应灵敏且颜色鲜明。
优选地，所述碱性磷酸酶标记的鳞状上皮细胞癌抗原抗体的制备方法包括如下步骤：
活化的碱性磷酸酶溶液和活化的鳞状上皮细胞癌抗原抗体溶液混合，然后进行偶联反应，得到碱性磷酸酶标记的鳞状上皮细胞癌抗原抗体。
优选地，所述磁性微球偶联有链霉亲和素。
优选地，所述鳞状上皮细胞癌抗原抗体通过链霉亲和素包被于所述磁性微球上。
优选地，所述包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球的制备方法如下：
将鳞状上皮细胞癌抗原抗体溶液加入磁性微球中，孵育包被，得到所述包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球。
优选地，所述制备方法如下：
(1)将链霉亲和素溶液加入磁性微球中进行偶联反应，得到链霉亲和素偶联的磁性微球；
(2)将鳞状上皮细胞癌抗原抗体溶液加入链霉亲和素偶联的磁性微球中进行孵育包被，得到所述包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球。
优选地，在所述鳞状上皮细胞癌抗原检测试剂中，所述碱性磷酸酶标记的鳞状上皮细胞癌抗原抗体的浓度为0.1-0.5μg/ml，例如0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml等。
优选地，在所述鳞状上皮细胞癌抗原检测试剂中，所述包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球的浓度为0.1-0.5μg/ml，例如0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml等。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明特异性的选择了二氧化硅磁性复合微球，相比于其他磁性微球，其具有更多的结合位点，可结合更多的抗体，进而可以使本发明提供的检测试剂在较低的检测浓度下具有较高的检测精度；并且包被性能较好，不易洗脱，可以减少在后续检测样品过程中由于包被较差而造成的误差增大现象；
(2)本发明优选磁性微球的粒径在5-10μm范围内，若粒径过大，则可能会造成鳞状上皮细胞癌抗原抗体的包被量过多，容易使部分鳞状上皮细胞癌抗原抗体脱落，进而影响测量精确度；若粒径过小，则不利于鳞状上皮细胞癌抗原抗体的包被。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种鳞状上皮细胞癌抗原检测试剂，由包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球、碱性磷酸酶标记的鳞状上皮细胞癌抗原抗体和化学发光底物组成。
其中，碱性磷酸酶标记的鳞状上皮细胞癌抗原抗体的浓度为0.3μg/ml，包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球的浓度为0.3μg/ml，化学发光底物为4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物。
包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球的制备方法如下：
(1)取羧基化的纳米磁性微球(粒径为8μm)的mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)悬浮液加入edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)进行活化反应，然后加入链霉亲和素，30℃下混悬5h，加磁场进行分离，去除上层清液后，利用tris缓冲液进行重新悬浮，得到偶联有链霉亲和素的磁性微球的悬浮液，浓度为0.2μg/ml。
(2)将偶联有链霉亲和素的磁性微球的悬浮液与鳞状上皮细胞癌抗原抗体的悬浮液混合(tris缓冲液，浓度为4μg/ml)在室温下进行孵育1h，加磁场进行分离，去除上层清液，然后利用ph为7的磷酸盐缓冲液进行清洗，重新悬浮，得到浓度为0.3μg/ml的包被双链dna抗原的包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球悬浮液。
碱性磷酸酶标记的鳞状上皮细胞癌抗原抗体的制备方法如下：
(1)将鳞状上皮细胞癌抗原抗体加入偶联剂2-亚胺基硫烷盐酸盐中，在30℃下静置20min后加入甘氨酸溶液再次在30℃下静置5min，然后利用g-25凝胶柱除盐，得到活化的鳞状上皮细胞癌抗原抗体，浓度为1μg/ml。
(2)将碱性磷酸酶溶液加入4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在30℃下静置30min后利用g-25凝胶柱除盐，得到活化的碱性磷酸酶，浓度为1μg/ml。
(3)将活化后的抗体与活化后的碱性磷酸酶在5℃下混合并静置20h，然后利用葡聚糖凝胶g250柱纯化，流速为3ml/min，得到所述碱性磷酸酶标记抗体，浓度为0.3μg/ml。
实施例2-5
与实施例1的区别在于，本实施例所使用的二氧化硅磁性复合微粒的粒径为10μm(实施例2)、5μm(实施例3)、3μm(实施例4)、12μm(实施例5)。
实施例6
与实施例1的区别在于，在本实施例中，化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐。
实施例7
一种鳞状上皮细胞癌抗原检测试剂，由包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球、碱性磷酸酶标记的鳞状上皮细胞癌抗原抗体和化学发光底物组成。
其中，碱性磷酸酶标记的鳞状上皮细胞癌抗原抗体的浓度为0.1μg/ml，包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球的浓度为0.1μg/ml，化学发光底物为4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物。
包被鳞状上皮细胞癌抗原抗体的磁性微球、碱性磷酸酶标记的鳞状上皮细胞癌抗原抗体的制备参照实施例1。
对比例1
与实施例1的区别在于，将磁性微球替换为酶标板。
对比例2
cn109142753a实施例1提供的鳞状上皮细胞癌抗原化学发光免疫检测试剂盒
性能测试
对实施例1-7和对比例1-2提供的检测试剂进行性能测试，方法如下：
(1)灵敏度测试：用标准品缓冲液(0.066mol/l，ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液)将鳞状上皮细胞癌抗原配置成浓度为0.000ng/ml、0.001ng/ml、0.005ng/ml、0.01ng/ml、0.02ng/ml、0.04ng/ml、0.05ng/ml、0.08ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml的标品，利用检测试剂进行检测，记录其可检测的最低浓度(lod)，即为样品的灵敏度。
(2)检测误差：用标准品缓冲液(0.066mol/l，ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液)将鳞状上皮细胞癌抗原配置成浓度为5ng/ml的标品，然后利用实施例和对比例提供的检测试剂进行检测，记录其检测的值，以及计算检测误差百分比。
测试结果见表1：
表1
由实施例和性能测试可知，本发明提供的检测试剂具有灵敏度高、误差值小的检测优点，其中，检测试剂的lod在0.01ng/ml以下，最低可达0.005ng/ml以下；检测误差在2％以下，最低可达0.75％以下。
由实施例1-3和实施例4-5的对比可知，磁微球的粒径在8-10μm范围内时具有更好的检测灵敏度以及更低的检测误差。由实施例1和实施例6的对比可知，当本发明选用的化学发光底物为4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物时，最后得到的检测试剂的灵敏度较好，检测误差低。由实施例1和对比例1的对比可知，本发明采用磁性微球作为固相载体，更有利于减少测量误差。由实施例1和对比例2的对比可知，本发明提供的检测试剂相较于现有的检测试剂而言，可以达到检测目的。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的鳞状上皮细胞癌抗原检测试剂，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。