专利名称：一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系ctsc-2及其建立方法
技术领域：
本发明涉及人舌部鳞状上皮细胞癌细胞技术领域，具体地，涉及一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2及其建立方法。
背景技术：
I. I舌部鳞状上皮细胞癌的发病与预后舌癌是最常见的口腔鳞状上皮细胞癌，常发生在舌前2/3处。舌癌高发于东南亚，以印度为最高，年发生率达到9. 4/100万。近年来研究显示，世界范围内舌癌总发生率逐步提高，而且有年轻化的趋势。由于其发生部位的组织学特点以及舌癌的生物学特性，舌癌使患者舌部运动受限，导致吞咽、说话、进食困难。另外，舌癌易转移，预后较差。I. 2肿瘤干细胞研究的进展I. 2. I肿瘤干细胞理论的提出与发展传统观念认为，肿瘤是一群由体细胞突变，获得无限增殖能力的细胞组成，但是小鼠致瘤实验和体外克隆形成实验结果表明，并非所有的肿瘤细胞都可以增殖。说明肿瘤不是一个均质的个体，它具有异质性，在组织中存在不同的细胞亚群。肿瘤组织中可能有一部分具有干细胞特性的细胞，这类型细胞被称为肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)。肿瘤干细胞理论最早在白血病中被证实，1994年Lapidot等通过FACS利用细胞表面标志⑶34+⑶38-和小鼠致瘤模型中分离出人急性粒细胞白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)干细胞，随后，Bonnet等发现只有⑶34+/⑶38-白血病细胞能在非糖尿病重度联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeflcient, N0D/SCID)小鼠体内致瘤。2003年，Clarke等第一次将肿瘤干细胞理论运用到实体瘤中，他们在乳腺癌 中证实了这个观点，⑶44+⑶24-/low细胞只需要100个便可以致瘤。之后，研究发现胶质母细胞瘤等脑肿瘤、肝癌、肺癌等癌症中也能分离出肿瘤干细胞，支持了这个学说。2006年，AACR(American As sociation for Cancer Research)对肿瘤干细胞做出了定义肿瘤中具有自我更新能力，并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。它具有三大特性1、分化能力肿瘤干细胞在肿瘤中担任形成和分化各类型肿瘤细胞的角色，在肿瘤生长过程中，不断补充所需的各类肿瘤细胞。2、自我更新能力生成一部分与自己相同的，具有增殖、扩张和分化潜能的细胞，从而维持干细胞的衡定。3、稳态控制能力调节和平衡肿瘤的分化，根据环境的刺激对肿瘤做出调控。I. 2. 2肿瘤干细胞在口腔癌中的研究及其应用口腔癌同一癌灶组织内包含有不同分化程度、不同阶段的癌细胞。有研究证实，头颈部鳞状上皮细胞癌中存在一群具有自我更新、多向分化潜能和有致瘤能力的癌细胞。肿瘤干细胞大多处于休眠状态，对放、化疗不敏感，是导致手术后肿瘤易复发、耐药强、难治愈的根源，肿瘤干细胞理论的提出可以使治疗的目标从肿瘤整体转移至肿瘤干细胞，提出针对癌细胞和肿瘤干细胞相结合的综合性治疗策略。肿瘤干细胞的研究也为肿瘤的研究带来了一个新的思路。I. 3细胞系的建立建立肿瘤细胞系是研究肿瘤致关重要的环节。细胞系广泛应用于生物学各个研究领域。它是指直接从生物体的组织中分离培养出细胞，为后续研究提供稳定细胞系的一种方法。细胞系是研究特定细胞的生长、代谢、调控特性，细胞与细胞间相互作用，细胞与基质的相互作用等有效的研究材料。人类的第一株连续细胞系是1951年由George Otto Gey实验室建立的子宫颈癌细胞系(Hela)，这株细胞系的建立是人体细胞体外培养的里程碑，Hela细胞推进了细胞、基因、病毒、疫苗等许多研究领域的进程，也加深了人们对肿瘤的认识发现肿瘤的各种特性、研究肿瘤发生发展的原因和过程、筛选抗癌药物等。除了研究细胞本身的特性和癌症的发生发展外，还应用于遗传、免疫、分化、发育的研究领域。此外，国内外不少企业还可以利用细胞进行生产各种因子、蛋白等。细胞的广泛应用推动了细胞生物学的蓬勃发展。·
原代培养主要有机械法和酶消化法。机械法主要是利用物理剪切，直接将组织剪碎，然后将这些组织小块贴壁培养的方法。酶消化法是应用适当的酶裂解组织从而分离出单细胞，直接悬浮或贴壁培养的方法。用于消化的酶主要有胰蛋白酶、胶原酶、链酶蛋白酶、透明质酸酶等。鳞状上皮细胞癌细胞系的鉴定有以下几个方面1、病理切片鉴定世界卫生组织(WH0，2005)根据细胞和细胞核的多形性、细胞分裂状态、角化程度等将其分为高、中、低三级。高分化鳞癌与正常鳞状上皮类似、角化明显、核分裂相少、细胞和细胞核多形性不明显；中分化鳞癌角化较少见，核分裂相多、细胞多形性明显；低分化鳞癌有大量的核分裂相、细胞多形性明显、角化非常少见；2、细胞形态一般为多角形上皮样，核质比高，核仁清晰个数较多，细胞排列紧密后呈铺路石样；3、细胞间桥粒连接相邻细胞之间的膜上有一块圆形区域，负责细胞间的连接、通讯、抵抗外力拉扯，桥粒多见于上皮，皮肤、口腔、食管等处的复层扁平上皮细胞间较多，能被胰蛋白酶、胶原酶及透明质酸酶所破坏，电镜下可见致密斑和中间纤丝，上皮细胞中多是角蛋白丝；4、分子标志主要是细胞角蛋白(cytokeratin,CK)，特异地表达于上皮细胞，是构成上皮细胞内细胞骨架的中间纤丝类蛋白质，共有20种，CKI-9是偏碱性或中性的II型角蛋白，CK10-20是偏酸性的I型角蛋白，这些角蛋白一般表达于特定的器官或组织，CK8、CK18、CK19常表达于单层上皮。鳞状上皮细胞癌的上述特征为分析新建立的舌部鳞状上皮细胞癌细胞系的生物学特性提供了理论依据。第一株舌部鳞状上皮细胞癌细胞系建立于1981年，是由日本报道的，这一株细胞系未能使小鼠致瘤。而后1983年在我国上海报道建立了一株舌癌Tca8113,1995在我国香港报道建立了一株舌癌细胞系PWH-S1。现存在American type culture colIection(ATCC)中的舌癌细胞系共有5株，分别为SCC-15、SCC-4、SCC-25、SCC-9、CAL27，均是20世纪80年代的，之后鲜有报道。不同舌癌细胞的生物学特性会存在差异，这种差异源于患者本身和接受治疗的方法。有些舌癌的分化度低，恶性程度高；有些舌癌的分化度高，恶性程度低。有些患者在术前接受化疗，因此术后所得到的细胞有较高的耐药性。正是这种差异的存在，使我们对舌癌的多样性和复杂性有了更多的认识，而存在差异的舌癌细胞系便成为研究舌癌发生发展的有效体外模型。
发明内容
为此，本发明提供了一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2及其建立方法。本发明的技术方案如 下中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2的建立方法，包括如下具体步骤A)采用组织块贴壁法进行舌部鳞状上皮细胞癌细胞的原代培养；B)当细胞密度达到约80%的时候进行传代培养；C)将传代稳定的细胞经RT-PCR检测表明细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18、19 ；D)经免疫印迹实验检测贴壁细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8U8蛋白，由此从分子水平上证明成功建立中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2。所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2的建立方法，步骤A的具体方法为I) I型胶原包被培养皿，室温静止I小时以上，IXPBS洗皿一次，待用；2)准备培养液，放于37°C恒温水浴锅中温育10分钟；3)在超净台中取出舌部鳞状上皮细胞癌组织，在酒精中消毒不超过10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培养液中；4)将组织剪成小碎块，均匀分种入培养皿中，加入适量培养液，使组织一半浸于培养液中；5)置于37°C，5%C02的培养箱中培养；6)第二天补充适量培养液至稍稍浸没组织块；7)视细胞生长情况进行适当换液。所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2的建立方法，步骤B的具体方法为I)弃培养液，用I XPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化；2)加入血清终止消化；3)吹打细胞，置于离心管中，加入适量的培养液吹打；4)离心 lOOOrpm，5 分钟；5)弃上清，加入适量培养液吹打散；6)将细胞悬液加入新的培养皿中，得到所述中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2。所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2在研究治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2在治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。所述中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2已经在中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)进行保藏。本发明的有益效果为本发明建立了中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2，为研究人舌部鳞状上皮细胞癌的特性及其治疗药物提供了物质基础。
图I、细胞来源患者组织切片H&E染色，光镜下观察原代细胞和CTSC-2第16代传代细胞系的细胞形态。图2、透射电镜下观察CTSC-2细胞的超微结构图。图3、琼脂糖凝胶检测正常颊粘膜细胞、CAL27舌癌细胞系、CTSC-2细胞的CK8、18、19的mRNA的表达情况；图4、Western免疫印迹方法检测CAL27舌癌细胞系、CTSC-2细胞的CK8、18和 E-cadherin的蛋白表达情况。图5、CTSC-2细胞染色体显示；图6、随机选择计算了 100个分散均匀的CTSC-2细胞染色体后用SSCP统计所得结
果O图7、CTSC-2细胞的细胞生长曲线；图8、CTSC-2细胞的克隆形成；图9、CTSC-2CTSC-2细胞小鼠移植瘤组织切片H&E染色；图10、免疫荧光检测 CTSC-2 细胞系对 CD133，Sox2, Nanog, 0ct4, SSEA-1, SSEA-4,TRA-1-60, TRA-1-81 的表达；图11、无血清悬浮培养富集CTSC-2细胞系肿瘤干细胞及其形态学观察；图12、H&E染色CTSC-2球囊细胞；图13、CTSC-2球囊细胞和贴壁细胞对CK8、CK18、CK19的表达；图14、CTSC_2贴壁细胞和球囊细胞在BME中的克隆形成统计结果；图15、流式细胞仪检测CTSC-2球囊细胞和贴壁细胞的干细胞分子标志物表达的对比；图16、用脂肪诱导培养的方法检测CTSC-2球囊细胞的分化能力结果。
具体实施例方式以下将结合具体实施例对本发明所述中国人舌癌细胞系CTSC-2的建立方法进一步说明。一、舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2的建立以及特性鉴定材料说明I临床标本本实验所用的口腔组织均取自中山大学附属光华口腔医院手术切除标本。2细胞系本实验所用的舌部鳞状上皮细胞癌CAL27细胞株购自ATCC。3主要仪器仪器名称仪器厂家仪器名称仪器厂家
PCR扩增仪Eppendorf垂直转头低速离心机 Thermo
高速冷冻离心机Thermo蟠动泵Millpore
电动移液枪Drummond负压栗Millpore
可调微量移液器Thermo红外南方牛.化
电子分析天平Sartorius流式细胞仪Bi!
凝胶成像系统GE 动脱水机Thermo 水平电泳系统TOYOBO组织包趣机Thermo
乘直电泳系统Bio-rad组织切片机Thermo
T-式恒温器海门其林W尔4Γ冰箱海尔
烘箱Thermo蠕动泵Millpore
PH计Sartorious负压象Millpore
纯水系统ELGA红外南方牛:化
电动玻璃匀浆机宁波新芝牛:物科技流式细胞仪BD
紫外分光光度计Nanodrop ThermoA动脱水机Thermo
超净工作台Esco组织包埋机Thermo
倒置荧光显微镜Nikon组织切片机Thermo
细胞计数仪Beckman4°C冰箱海尔
CO培养箱SHELLAB
24、主要试剂试剂名称厂家试剂名称厂家
琼脂糖SipanReal Envision〔抗检测系统 Gene Tech
低熔点琼脂糖AuiiFBS胎牛血淸GIBCO
RT-PCR KitToYoBo胰酶GIBCO
DL2000 DNA Ladder MarkerTakaraDMSOSigma
PCR 上样 bufferTakaraG418GIBCO
30%丙烯酰胺胶溶液(37. 5:1，29:1) Bio-rad预染酿rkerPromega
TEMEDWakoRAPI上海闪晶
过硫酸铵fcko脱脂奶粉威佳
SDSSigma石蜡Leica
EDTAAmrescoDNA 提取试剂盒QIGEN
TrizolInvitrogen SSCP 试剂盒GE
RNAlaterAmbionPISigma
Nuclease-Free WaterAmbionI 型鼠尾胶原Sigma
甲酰胺Woko牛脑提取物BPEInvitroge
E
各种墙养基粉剂SigmaReal Envision二抗检测系统Gene Tech
发光Hiar kerCST其他试剂为国产分析纯5主要溶液以及配方5. I细胞培养I) IOXPBS Buffer:NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4 11. 55g, KH2PO4 2g，加入约 800ml
的超纯水，磁力搅拌器充分搅拌溶解，调节PH值至7. 4，定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。2)胎牛血清(FBS):购自Hyclone公司，4°C保存，和培养基配成适当比例。3) IOXTrypsin-EDTA(TE):称取 I. 25g trypsin, I. OOg EDTA 溶解于 250ml 的IXPBS中，过滤除菌，-20°C保存。使用前用IXPBS buffer稀释成适当浓度消化细胞。4)DMEM/F12 (DF)培养基溶解于IL的超纯水中，调节pH值到7. 2，利用蠕动泵和0.22 μ m滤膜过滤除菌。4°C保存。2XDF分量加倍，水量不变。DF (-)表示不加入Ampicillin 和 Kanamycin。5)鼠尾I型胶原原代培养时，用IXPBS稀释成1%的浓度，每个六厘米的皿上加入I. 5mL覆盖皿底，室温包被I小时以上。6)软琼脂soft agar加超纯水,高温高压灭菌配成O. 66%和I. 33%。7)秋水仙素40 μ g/mL母液,最终使用浓度为O. 2 μ g/mL。8)舌癌原代培养液DF+10%FBS。
5. 2核酸电泳I) 50XTAE 电泳 Buffer (ρΗ8· 5):在 IL 的玻璃瓶中加入 242g Tris,18. 6gNa2EDTA ·2Η20，然后加入约800ml的二级水，充分搅拌溶解，再加入57. Iml的醋酸，充分搅拌，加二级水定容至1L，室温保存。使用时以1:50稀释。2)溴化乙锭(EB):储存液浓度为10mg/ml，工作浓度为O. 5μ g/ml。3) 1%琼脂糖电泳凝胶称取Ig琼脂糖(agarose),加入100ml I XTAEbuffer,力口热煮沸至琼脂糖完全溶解，冷至50°C左右，加入5μ I EB储存液，使终浓度为O. 5 μ g/ml，摇匀后灌制凝胶平板。5. 3ffestern 免疫印迹I)蛋白裂解液(RIPA):
4BZjf 液HiJ体系
50 mil Tris pH8, OIM Tris pH8, O2.5 ml
150 mM NaCloM NaCII, 5 ml
I mM EDTA0. oM EDTA0, I ml
1% Triton x-100Triton x-1000. 5 ml
0.1% SDS10% SDS0.5ml
0.25% Sodium deoxycholat.e Sodium deoxycholate 0. 125 g
dd waterFiJl up to 500 ml 44.9 ml2)蛋白酶抑制剂EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail 药片(Roche, Cat.No. 04 69 3159 001) ;cocktail 中包含有 Pancreas-extract, Thermolysin (Metalloprotease), Chymotrypsin, Trypsin, Papain 等蛋白酶抑制剂。一片药片加 ImllXPBS 配成10XcocktaiI储存液，使用时稀释成IX。3)蛋白定量按照GE 2-D Quant Kit说明书进行。4)1M Tris-HCl (pH6. 8):称量 121. Ig Tris 置于 IL 瓶子中，加入约 800ml 的二级
水，充分搅拌溶解，用溶盐酸调节PH值至6. 8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。5)1. 5M Tris-HCl (pH8. 8):称量 181. 7g Tris 置于 IL 瓶子中，加入约 800ml 的二
级水，充分搅拌溶解，用溶盐酸调节PH值到8. 8，将溶液定容至1L。高温高压灭菌后，室温保存。6)10%(ff/V)过硫酸铵称I. Og过硫酸铵，加入IOml 二级水充分溶解，4°C暂时保存。或分装成100 μ I小份，密封，-20°c保存。7)5XTris-Glycine Buffer (SDS-PAGE 电泳缓冲液)称取 15. lgTris，94g甘氨酸，
5.Og SDS，加二级水定容至1L，室温保存。使用时用二级水稀释成IX缓冲液。8) 5XSDS-PAGE Loading Buffer :在 50ml 的塑料离心管中加入 I. 25ml 的 IMTris-HCl (pH6. 8), 0. 5g SDS, 25mg溴酹蓝,2. 5ml甘油，然后加二级水定容至50ml,稍加热溶解后，小份(Iml/管)分装后，室温保存。使用前每Iml Loading Buffer加入50 μ I 2-巯基乙醇或O. 25ml的IM DTT，充分混匀，室温保存。9) 5% 浓缩胶
试剂体积(mL)
二级水2.01
30%Arc-Bis (体积比37. 5:1)0.5
I,OMTris-HCl (p册.8)O. 375
ICWSDS0.03
10% APSO. 03
TEMEDO.003
Total310) 10% 分离胶
试剂体积(mL)
二级水5. 95
30%Arc-Bi s (体积比37. 5:1)5
I.5MTris-HCl(pH8.8)3. 75
101SDSO. 15
10% APSO. 15
TEMED0.006
Total1511)转膜液2. 9g Glycine, 5. 8g Tris，0.37g SDS，200ml 的甲醇，用二级水定容至1L,室温保存。12)1XTBST buffer 8. 8g NaCl，20ml 的 IM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，加约 800ml 的二级水，充分搅拌溶解，用二级水定容至1L,最后加入I. Oml Tween 20后充分混勻，室温保存。13)封闭液称取O. 5g脱脂奶粉加至IOml TBST buffer中，充分混匀溶解，现配现用。14) ECL 发光液pierce ECL enhance chemiluminescent westhern blottingsubstrate,购自Thermo,使用前I: I混合两种液体，现配现用。5. 4组织化学I) 10%福尔马林液50mL甲醛溶液(37%_40%)加到450mLl XPBS中，室温保存。2)4% 多聚甲醒(4%PFA):将 20g 的 paraformaldehyde 倒入 400mL 的 I XPBS 中，65°C溶解，溶解时每隔10-20分钟摇匀一下，近于完全溶解时，加入40 μ I的IM Na0H，lXPBS定容至500mL，混匀后降温至室温，4°C保存。5. 5 抗体
权利要求
1.中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2的建立方法,其特征在于,包括如下具体步骤 A)采用组织块贴壁法进行舌部鳞状上皮细胞癌细胞的原代培养； B)当细胞密度达到约80%的时候进行传代培养； C)将传代稳定的细胞经RT-PCR检测表明细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子 CK8、18、19 ； D)经免疫印迹实验检测贴壁细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18蛋白，由此从分子水平上证明成功建立中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2。
2.如权利要求I所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2的建立方法，其特征在于，步骤A的具体方法为 O I型胶原包被培养皿，室温静止Ih以上，IXPBS洗皿一次，待用； 2)准备培养液，放于37°C恒温水浴锅中温育10分钟； 3)在超净台中取出舌部鳞状上皮细胞癌组织，在酒精中消毒不超过10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培养液中； 4)将口腔组织剪成小碎块，均匀分种入培养皿中，加入适量培养液，使组织一半浸于培养液中； 5)置于370C, 5%C02的培养箱中培养； 6)第二天补充适量培养液至稍稍浸没组织块； 7)视细胞生长情况进行适当换液。
3.如权利要求I所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2的建立方法，其特征在于，步骤B的具体方法为 O弃培养液，用IXPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化； 2)加入血清终止消化； 3)吹打细胞，置于离心管中，加入适量的培养液吹打；4)离心IOOOrpm, 5min ； 5)弃上清，加入适量培养液吹打散； 6)将细胞悬液加入新的培养皿中，得到所述中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2。
4.如权利要求I所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2在研究治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。
5.如权利要求I所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2在治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2的建立方法，为研究人舌部鳞状上皮细胞癌的特性及其治疗药物提供了物质基础。该方法包括如下具体步骤采用组织块贴壁法进行舌部鳞状上皮细胞癌细胞的原代培养；当细胞密度达到约80%的时候进行传代培养；将传代稳定的细胞经RT-PCR检测表明细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18、19；经免疫印迹实验检测贴壁细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18蛋白，由此从分子水平上证明成功建立中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-2。
文档编号C12N5/09GK102911916SQ20121030699
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者张雁, 贺姮, 张海霞, 汪华 申请人:东莞中山大学研究院