一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系ctsc-1及其建立方法
【专利摘要】本发明提供了一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系的建立方法，为研究人舌部鳞状上皮细胞癌的特性及其治疗药物提供了物质基础。该建立方法包括如下具体步骤：采用组织块贴壁法进行舌部鳞状上皮细胞癌细胞的原代培养；当细胞密度达到约80%的时候进行传代培养；将传代稳定的细胞经RT-PCR检测表明细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18、19；经免疫印迹实验检测贴壁细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18蛋白，由此从分子水平上证明成功建立中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1。
【专利说明】一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1及其建立
方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及人舌部鳞状上皮细胞癌细胞【技术领域】,具体地,涉及一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1及其建立方法。
【背景技术】
[0002]1.1舌部鳞状上皮细胞癌的发病与预后
[0003]舌癌是最常见的口腔鳞状上皮细胞癌，常发生在舌前2/3处。舌癌高发于东南亚，以印度为最高，年发生率达到9.4/100万。近年来研究显示，世界范围内舌癌总发生率逐步提高，而且有年轻化的趋势。由于其发生部位的组织学特点以及舌癌的生物学特性，舌癌使患者舌部运动受限，导致吞咽、说话、进食困难。另外，舌癌易转移，预后较差。
[0004]1.2肿瘤干细胞的研究进展
[0005]1.2.1肿瘤干细胞理论的提出与发展
[0006]传统观念认为，肿瘤是一群由体细胞突变，获得无限增殖能力的细胞组成，但是小鼠致瘤实验和体外克隆形成实验结果表明，并非所有的肿瘤细胞都可以增殖。说明肿瘤不是一个均质的个体，它具有异质性，在组织中存在不同的细胞亚群。肿瘤组织中可能有一部分具有干细胞特性的细胞，这类型细胞被称为肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)。
[0007]肿瘤干细胞理论最早在白血病中被证实，1994年Lapidot等通过FACS利用细胞表面标志⑶34+⑶38-和小鼠致瘤模型中分离出人急性粒细胞白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)干细胞，随后，Bonnet等发现只有⑶34+/⑶38-白血病细胞能在非糖尿病重度联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combinedimmunodeflcient, N0D/SCID)小鼠体内致瘤。2003年，Clarke等第一次将肿瘤干细胞理论运用到实体瘤中，他们在乳腺癌中证实了这个观点，⑶44+⑶24-/low细胞只需要100个便可以致瘤。之后，研究发现胶质母细胞瘤等脑肿瘤、肝癌、肺癌等癌症中也能分离出肿瘤干细胞，支持了这个学说。2006年，AACR(American As sociation for Cancer Research)对肿瘤干细胞做出了定义:肿瘤中具有自我更新能力，并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。它具有三大特性:1、分化能力:肿瘤干细胞在肿瘤中担任形成和分化各类型肿瘤细胞的角色，在肿瘤生长过程中，不断补充所需的各类肿瘤细胞。2、自我更新能力:生成一部分与自己相同的，具有增殖、扩张和分化潜能的细胞，从而维持干细胞的衡定。3、稳态控制能力:调节和平衡肿瘤的分化，根据环境的刺激对肿瘤做出调控。
[0008]1.2.2肿瘤干细胞在口腔癌中的研究及其应用
[0009] 口腔癌同一癌灶组织内包含有不同分化程度、不同阶段的癌细胞。有研究证实，头颈部鳞状上皮细胞癌中存在一群具有自我更新、多向分化潜能和有致瘤能力的癌细胞。肿瘤干细胞大多处于休眠状态，对放、化疗不敏感，是导致手术后肿瘤易复发、耐药强、难治愈的根源，肿瘤干细胞理论的提出可以使治疗的目标从肿瘤整体转移至肿瘤干细胞，提出针对癌细胞和肿瘤干细胞相结合的综合性治疗策略。肿瘤干细胞的研究也为肿瘤的研究带来了一个新的思路。
[0010]1.3细胞系的建立
[0011]建立肿瘤细胞系是研究肿瘤致关重要的环节。细胞系广泛应用于生物学各个研究领域。它是指直接从生物体的组织中分离培养出细胞，为后续研究提供稳定细胞系的一种方法。细胞系是研究特定细胞的生长、代谢、调控特性，细胞与细胞间相互作用，细胞与基质的相互作用等有效的研究材料。人类的第一株连续细胞系是1951年由George Otto Gey实验室建立的子宫颈癌细胞系(Hela)，这株细胞系的建立是人体细胞体外培养的里程碑，Hela细胞推进了细胞、基因、病毒、疫苗等许多研究领域的进程，也加深了人们对肿瘤的认识:发现肿瘤的各种特性、研究肿瘤发生发展的原因和过程、筛选抗癌药物等。除了研究细胞本身的特性和癌症的发生发展外，还应用于遗传、免疫、分化、发育的研究领域。此外，国内外不少企业还可以利用细胞进行生产各种因子、蛋白等。细胞的广泛应用推动了细胞生物学的蓬勃发展。
[0012]原代培养主要有机械法和酶消化法。机械法主要是利用物理剪切，直接将组织剪碎，然后将这些组织小块贴壁培养的方法。酶消化法是应用适当的酶裂解组织从而分离出单细胞，直接悬浮或贴壁培养的方法。用于消化的酶主要有:胰蛋白酶、胶原酶、链酶蛋白酶、透明质酸酶等。 [0013]鳞状上皮细胞癌细胞系的鉴定有以下几个方面:1、病理切片鉴定:世界卫生组织(WH0，2005)根据细胞和细胞核的多形性、细胞分裂状态、角化程度等将其分为高、中、低三级。高分化鳞癌与正常鳞状上皮类似、角化明显、核分裂相少、细胞和细胞核多形性不明显；中分化鳞癌角化较少见，核分裂相多、细胞多形性明显；低分化鳞癌有大量的核分裂相、细胞多形性明显、角化非常少见；2、细胞形态:一般为多角形上皮样，核质比高，核仁清晰个数较多，细胞排列紧密后呈铺路石样；3、细胞间桥粒连接:相邻细胞之间的膜上有一块圆形区域，负责细胞间的连接、通讯、抵抗外力拉扯，桥粒多见于上皮，皮肤、口腔、食管等处的复层扁平上皮细胞间较多，能被胰蛋白酶、胶原酶及透明质酸酶所破坏，电镜下可见致密斑和中间纤丝，上皮细胞中多是角蛋白丝；4、分子标志:主要是细胞角蛋白(cytokeratin,CK)，特异地表达于上皮细胞，是构成上皮细胞内细胞骨架的中间纤丝类蛋白质，共有20种，CK1-9是偏碱性或中性的II型角蛋白，CK10-20是偏酸性的I型角蛋白，这些角蛋白一般表达于特定的器官或组织，CK8、CK18、CK19常表达于单层上皮。鳞状上皮细胞癌的上述特征为分析新建立的舌部鳞状上皮细胞癌细胞系的生物学特性提供了理论依据。
[0014]第一株舌部鳞状上皮细胞癌细胞系建立于1981年，是由日本报道的，这一株细胞系未能使小鼠致瘤。而后1983年在我国上海报道建立了一株舌癌Tca8113,1995在我国香港报道建立了一株舌癌细胞系 PWH-S1。现存在 Americantype culture colIection(ATCC)中的舌癌细胞系共有5株，分别为SCC-15、SCC-4、SCC-25、SCC-9、CAL27，均是20世纪80年代的，之后鲜有报道。
[0015]不同舌癌细胞的生物学特性会存在差异，这种差异源于患者本身和接受治疗的方法。有些舌癌的分化度低，恶性程度高；有些舌癌的分化度高，恶性程度低。有些患者在术前接受化疗，因此术后所得到的细胞有较高的耐药性。正是这种差异的存在，使我们对舌癌的多样性和复杂性有了更多的认识，而存在差异的舌癌细胞系便成为研究舌癌发生发展的有效体外模型。
【发明内容】
[0016]为此，本发明提供了一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1及其建立方法。
[0017]本发明的技术方案如下:中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，包括如下具体步骤:
[0018]A)采用组织块贴壁法进行舌部鳞状上皮细胞癌细胞的原代培养；
[0019]B)当细胞密度达到约80%的时候进行传代培养；
[0020]C)将传代稳定的细胞经RT-PCR检测表明细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18、19 ；
[0021]D)经免疫印迹实验检测贴壁细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8U8蛋白，由此从分子水平上证明成功建立中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1，获得的CTSC-1保藏于中国典型培养物保藏中心；地址:中国武汉市武汉大学；保藏号CCTCCNO:C2012176，保藏日期为2012年11月14日。
[0022]所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，步骤A的具体方法为:
[0023]I) I型胶原包 被培养皿室温静止I小时以上，IXPBS洗皿一次，待用；
[0024]2)准备培养液，放于37°C恒温水浴锅中温育10分钟；
[0025]3)在超净台中取出舌部鳞状上皮细胞癌组织，在酒精中消毒不超过10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培养液中；
[0026]4)将组织剪成小碎块，均匀分种入培养皿中，加入适量培养液，使组织一半浸于培养液中；
[0027]5)置于37°C，5%C02的培养箱中培养；
[0028]6)第二天补充适量培养液至稍稍浸没组织块；
[0029]7)视细胞生长情况进行适当换液。
[0030]所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，步骤B的具体方法为:
[0031]I)弃培养液，用IXPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化；
[0032]2)加入血清终止消化；
[0033]3)吹打细胞，置于离心管中，加入适量的培养液吹打；
[0034]4)离心 lOOOrpm，5 分钟；
[0035]5)弃上清，加入适量培养液吹打散；
[0036]6)将细胞悬液加入新的培养皿中，得到所述中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1。
[0037]中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1在研究治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。
[0038]所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1在治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。
[0039]所述中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1已经在中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)进行保藏。
[0040]本发明的有益效果为:本发明建立了中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1，并用该细胞系实现了肿瘤干细胞的富集，为研究人舌部鳞状上皮细胞癌的特性及其治疗药物提供了物质基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1、细胞来源患者组织切片H&E染色，光镜下观察原代细胞和CTSC-1传代细胞系的细胞形态。
[0042]图2、透射电镜下观察CTSC-1细胞的超微结构图。
[0043]图3、琼脂糖凝胶检测正常颊粘膜细胞、CAL27舌癌细胞系、CTSC-1细胞的CK8、18、19的mRNA的表达情况；
[0044]图4、Western免疫印迹方法检测CAL27舌癌细胞系、CTSC-1细胞的CK8、18和E-cadherin的蛋白表达情况。
[0045]图5、CTSC-1细胞染色体显示；
[0046]图6、随机选择计算了 100个分散均匀的CTSC-1细胞染色体后用SSCP统计所得结果;
[0047]图7、CTSC-1细胞的细胞生长曲线；
[0048]图8、CTSC-1细胞的克隆形成；
[0049]图9、CTSC-1细胞小鼠移植瘤组织切片H&E染色；
[0050]图10、免疫荧光检测 CTSC-1 细胞系对 CD133，Sox2, Nanog, 0ct4, SSEA-1, SSEA-4,TRA-1-60, TRA-1-81 的表达；
[0051]图11、无血清悬浮培养富集CTSC-1细胞系肿瘤干细胞及其形态学观察；
[0052]图12、H&E染色CTSC-1球囊细胞；
[0053]图13、CTSC-1球囊细胞和贴壁细胞对CK8、CK18、CK19的表达；
[0054]图14、CTSC-1贴壁细胞和球囊细胞在BME中的克隆形成统计结果；
[0055]图15、流式细胞仪检测CTSC-1球囊细胞和贴壁细胞的干细胞分子标志物表达的对比；
[0056]图16、用脂肪诱导培养的方法检测CTSC-1球囊细胞的分化能力结果。
【具体实施方式】
[0057]以下将结合具体实施例对本发明所述中国人舌癌细胞系CTSC-1的建立方法进一步说明。
[0058]一、舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立以及特性鉴定
[0059]材料说明:
[0060]I临床标本
[0061]本实验所用的口腔组织均取自中山大学附属光华口腔医院手术切除标本。
[0062]2细胞系
[0063]本实验所用的舌部鳞状上皮细胞癌CAL27细胞株购自ATCC
[0064]3主要仪器[0065]
【权利要求】
1.中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法,其特征在于,包括如下具体步骤: A)采用组织块贴壁法进行舌部鳞状上皮细胞癌细胞的原代培养； B)当细胞密度达到约80%的时候进行传代培养； C)将传代稳定的细胞经RT-PCR检测表明细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子 CK8、18、19 ； D)经免疫印迹实验检测贴壁细胞表达人舌部鳞状上皮细胞癌细胞标志性分子CK8、18蛋白，由此从分子水平上证明成功建立中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1。
2.如权利要求1所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，其特征在于，步骤A的具体方法为: O I型胶原包被培养皿室温静止1小时以上，IXPBS洗皿一次，待用； 2)准备培养液，放于37°C恒温水浴锅中温育10分钟； 3)在超净台中取出舌部鳞状上皮细胞癌组织，在酒精中消毒不超过10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培养液中； 4)将组织剪成小碎块,均匀分种入培养皿中，加入适量培养液，使组织一半浸于培养液中； 5)置于370C, 5%C02的培养箱中培养； 6)第二天补充适量培养液至稍稍浸没组织块； 7)视细胞生长情况进行适当换液。
3.如权利要求1所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1的建立方法，其特征在于，步骤B的具体方法为: O弃培养液，用IXPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化； 2)加入血清终止消化； 3)吹打细胞，置于离心管中，加入适量的培养液吹打； 4)离心1000rpm,5分钟； 5)弃上清，加入适量培养液吹打散； 6)将细胞悬液加入新的培养皿中，得到所述中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1。
4.如权利要求1所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1在研究治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。
5.如权利要求1所述的中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系CTSC-1在治疗人舌部鳞状上皮细胞癌的药物中的用途。
【文档编号】C12Q1/02GK103966169SQ201310374517
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2012年8月24日
【发明者】张雁, 贺姮, 张海霞, 汪华 申请人:中山大学