使用质谱鉴定免疫球蛋白的制作方法

背景

1.技术领域

本文件涉及用于鉴定和/或定量来自生物样品的免疫球蛋白的材料和方法，其中在使用质谱进行电离和检测之前无需对免疫球蛋白进行预纯化。例如，在用含有酸和还原剂的水性缓冲液稀释含有单克隆免疫球蛋白的样品，然后将所述样品与α-氰基-4-羟基肉桂酸基质(chca)混合之后，可以使用基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof)质谱观察来自单克隆免疫球蛋白的单克隆轻链。在另一个实例中，在用水稀释含有单克隆免疫球蛋白的样品，然后将所述样品与chca基质混合后，可以使用maldi-tof质谱在样品中观察到完整的单克隆免疫球蛋白。

2.背景信息

人免疫球蛋白含有通过二硫键结合在一起的两个相同的重链多肽和两个相同的轻链多肽。有两种不同的轻链同种型(κ和λ)和五种不同的重链同种型(igg、iga、igm、igd和ige)。可以通过准确的分子量使用质谱仪来鉴定单克隆免疫球蛋白、多克隆免疫球蛋白以及来自单克隆免疫球蛋白或多克隆免疫球蛋白的轻链和/或重链的任何组合。

通过质谱检测和监测免疫球蛋白是本领域众所周知的。

例如，wo2015/154052a和wo2014/150170公开了在液相色谱和esi-q-tof四极杆飞行时间质谱分析之前，使用melon凝胶(melongel)从血清样品中富集免疫球蛋白。wo2015/154052a类似地用lc-esi-q-tof质谱使用melon凝胶纯化。barnidged.r.等人(j.neuroimmunology(2015),285,123-126)也描述了从血清样品中富集免疫球蛋白。然后在通过lc-ms分析之前，使用dtt(二硫苏糖醇)还原纯化的血清样品。

mills等人(clin.chem.(2016)62(10)1334-1344)描述了在maldi-tof之前使用针对重链恒定区或轻链恒定区的骆驼科动物源的纳米抗体来纯化抗体。

这些实例表明，常规地，抗体在通过质谱分析之前被纯化或富集的。

在质谱(m.s.)之前免疫球蛋白的复杂纯化或富集增加了研究样品中免疫球蛋白的时间。

horting.l.和remaleya.t.(clin.geonomics(2006)103-114)描述了主要血浆蛋白和血清样品的质量测定。样本用含有10mmol/l乙酸铵和10g/l芥子酸(sinapinicacid)的40％丙烯腈/10％乙醇/50％水/0.1％三氟乙酸稀释。

分析了多种纯化的蛋白质，其包括糖蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白g、载脂蛋白和甲状腺素运载蛋白。

两个样本的稀释血清样品能够鉴定igg、白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白和载脂蛋白。该论文的结论是对于质量小于30,000的几种最丰富的蛋白质(即，排除例如质量为147,000的igg)，可以以足够的精度和准确性进行质量测量，以允许检测化学修饰和序列修饰。该论文还指出，在没有分级的复杂混合物的分析中存在缺陷。首先，只能观察到最丰富的成分。其次，高蛋白和盐浓度通常抑制信号。观察到白蛋白干扰检测其它峰(m/z为30,000)的能力。该论文的结论是应使用igg和白蛋白的选择性消耗。没有公开其它免疫球蛋白或实际上轻链的鉴定。

存在许多与抗体产生细胞相关的增生性疾病。

在许多此类增生性疾病中，浆细胞增殖形成相同浆细胞的单克隆肿瘤。这导致产生大量相同的免疫球蛋白，并且被称为单克隆丙种球蛋白病。

诸如骨髓瘤和原发性系统性淀粉样变性(al淀粉样变性)的疾病分别占英国癌症死亡的大约1.5％和0.3％。多发性骨髓瘤是非霍奇金淋巴瘤后的第二种最常见形式的血液恶性肿瘤。在高加索人群中，发病率大约为每年百万分之40。通常，多发性骨髓瘤的诊断基于骨髓中过量的单克隆浆细胞、血清或尿液中的单克隆免疫球蛋白以及相关器官或组织损伤(如高钙血症、肾功能不全、贫血或骨损伤)的存在。骨髓的正常浆细胞含量为约1％，而在多发性骨髓瘤中，该含量通常大于10％，经常大于30％，但可能超过90％。

al淀粉样变性是一种蛋白质构象病症，其特征在于作为淀粉样蛋白沉积物的单克隆游离轻链片段的积聚。通常，这些患者存在心脏或肾衰竭，但也可能涉及外周神经和其它器官。

有许多其它疾病可以通过患者的血流或实际上尿中单克隆免疫球蛋白的存在来鉴定。这些包括浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤(一种在骨髓外出现并可在任何器官中发生的浆细胞肿瘤)。当存在时，单克隆蛋白通常是iga。多发性孤立性浆细胞瘤可以在有或没有多发性骨髓瘤证据的情况下发生。瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症是与单克隆igm的产生相关的低度淋巴组织增生性病症。在美国每年有大约1,500例新病例，在英国每年有大约300例新病例。血清igm定量对于诊断和监测都是重要的。在英国，b细胞非霍奇金淋巴瘤大约占所有癌症死亡的2.6％，并且已经使用标准电泳方法在约10-15％的患者的血清中鉴定了单克隆免疫球蛋白。最初的报道表明，在60-70％的患者的尿液中可以检测到单克隆游离轻链。在b细胞慢性淋巴细胞性白血病中，已通过游离轻链免疫测定法鉴定到单克隆蛋白。

另外，存在所谓的mgus病况。这些是具有不确定意义的单克隆丙种球蛋白病。该术语表示在没有多发性骨髓瘤、al淀粉样变性、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症等证据的个体中意外存在单克隆完整免疫球蛋白。mgus可能在50岁以上人群中占1％，在70岁以上人群中占3％，并且在80岁以上的人群中高达10％。其中大多数是igg或igm相关的，但很少是iga相关或双克隆的。尽管大多数患有mgus的人死于无关疾病，但mgus可能会转变为恶性单克隆丙种球蛋白病。

对于上述疾病，至少在一些情况下，疾病表现出异常浓度的单克隆免疫球蛋白或游离轻链。当疾病产生浆细胞的异常复制时，这经常导致该类型细胞产生更多的免疫球蛋白，因为该“单克隆”繁殖并在血液中出现。

概述

本文件涉及用于鉴定和/或定量来自生物样品的免疫球蛋白的材料和方法，其中在使用质谱进行电离和检测之前无需对免疫球蛋白进行预纯化。在一些情况下，质谱技术可以被用于鉴定和/或定量生物样品中的免疫球蛋白，而不需要通过免疫纯化或从样品中去除其它非免疫球蛋白蛋白来额外纯化免疫球蛋白。如本文所证明的，单克隆免疫球蛋白或多克隆免疫球蛋白、以及来自单克隆免疫球蛋白或多克隆免疫球蛋白的轻链和/或重链的任何组合，可以通过在含有或不含有还原剂的缓冲液中稀释样品来鉴定。与在使用质谱进行电离和检测之前采用纯化的其他方法相比，该方法的执行速度更快，从而降低了成本并提高了通量。

申请人出乎意料地发现，即使在相对复杂的样品(如血液、血清、血浆或脑脊液)中，通过使用水或水性缓冲液稀释样品或甚至重构干燥的样品，也可以检测和定量免疫球蛋白。

本发明提供了用于鉴定和/或定量样品中单克隆和/或多克隆免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：

(i)提供含有来自对象的免疫球蛋白的样品；

(ii)用水或水性缓冲液稀释所述样品以形成稀释的样品；

(iii)电离所述稀释的样品，并通过质谱检测和任选地定量完整的免疫球蛋白或所述免疫球蛋白的轻链或重链。

质谱可能是任何质谱技术。这包括，例如，四极飞行时间质谱，例如与液相色谱组合，诸如液相色谱电喷雾电离质谱(lc-esi-ms)。然而，更典型地，质谱是基质辅助激光解吸飞行时间(maldi-tof)质谱。如上所述，将未纯化的稀释样品引入质谱系统，这意味着同时将样品的所有成分引入系统。在使用液相色谱质谱(lc-ms)的本发明的实施方案中，液相色谱柱简单地分离样品的成分，使得它们在不同的时间到达质谱仪，这取决于它们如何与液相色谱柱相互作用。

在基于质谱的技术包括使用基质的情况下，可以在电离之前使稀释的样品与合适的基质混合。例如，基质可以是与乙腈和含有酸(如三氟乙酸)的水混合的α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)基质。其它基质包括，例如，芥子酸或2,5-二羟基苯甲酸的混合物。

样品缓冲液可以是任何合适的水性缓冲液，但包括例如含有酸(如乙酸)和还原剂(如tcep(三(2-羧乙基)膦)、tcep-hcl、2-巯基乙醇(bme)或二硫苏糖醇(dtt))的混合物的缓冲液。在本发明的优选实施方案中，缓冲液可以含有乙酸和tcep-hcl，例如，缓冲液可以含有5％乙酸(v/v)和20mmtcep-hcl。可替代地，可以使用还原剂(如dtt)还原样品，然后将其与酸性水性溶液混合。例如，可以用10mmdtt还原样品，然后将其与酸性水性溶液混合。

通过在缓冲液中包含还原剂或将还原剂作为样品的单独添加物，可以将与轻链连接的重链彼此分离。还原剂将重链与轻链分开并允许检测和/或定量分开的重链和轻链。合适的还原剂包括本领域通常已知的那些，诸如dtt，例如200mm的dtt。检测到的重链可以是igg、iga、igm、igd或igm。轻链可以是κ轻链或λ轻链。

通常，完整的免疫球蛋白、完整的轻链或完整的重链在进行质谱分析之前不使用特定的试剂进行片段化。例如，免疫球蛋白通常在进行质谱分析之前不用特定的蛋白酶酶促消化。

通常免疫球蛋白例如在进行质谱分析之前不通过亲和纯化来富集或纯化。例如，通常免疫球蛋白不通过使用抗重类和/或轻链型抗体(如抗igg、抗iga、抗igm、抗κ或抗λ抗体)来免疫纯化。通常，免疫球蛋白不用例如melon凝胶、蛋白a(proteina)或蛋白g(proteing)纯化。通常，免疫球蛋白不通过例如色谱法(如尺寸排阻色谱法)纯化。

在提供血液或组织样品的情况下，可以在稀释之前，例如通过离心去除细胞(如红细胞和/或白细胞)。

样品可以选自例如血清、血浆、血液、尿液和脑脊液，尤其是血液、血浆或血清。样品可以来自人类对象。

样品可以来自来自患有或疑似患有与血浆产生细胞相关的增生性疾病的对象(如人类对象)。那些增生性疾病包括上述那些，如单克隆丙种球蛋白病。这些疾病包括，例如，骨髓瘤和al淀粉样变性，以及如上所述的其它此类疾病。

样品可以是干燥的或至少部分干燥的样品，其用水或水性缓冲液再水化。这可能意味着允许样品以干燥状态储存或允许在制品(如衣服)上回收来自对象的干燥样品。通常不需要对样品进行进一步的处理。

通常，检测和/或定量的免疫球蛋白是单克隆免疫球蛋白、单克隆重链或单克隆轻链。如附图中所示的，单克隆免疫球蛋白在背景多克隆抗体产生之上产生不同的峰。这可以通过本发明的方法容易地检测和/或定量。可替代地，可以检测和定量多克隆重链、多克隆轻链和多克隆完整免疫球蛋白。

可替代地，可以定量κ轻链和λ轻链的相对量以确定κ轻链与λ轻链的比例。

通常轻链是游离轻链。

样品通常但不总是在通过质谱分析之前稀释。典型的稀释是1:1,280，但在通过质谱检测之前稀释可以为1:50至1:5000，更典型地为1:500至1:3000或1:1000至1:2000的范围。

本发明提供了使用质谱快速检测例如单克隆免疫球蛋白存在或不存在的方法，其中不需要样品的复杂的额外纯化技术。

除非另有定义，否则本文种所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文中所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以被用于实施本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。

在附图和下面的描述中阐述本发明的一个或多个实施方案的细节。从说明书和附图以及从权利要求书中，本发明的其他特征、目的和优点将变得显而易见。

附图描述

图1显示了通过以下获得的8个质谱：1)在含有5％乙酸和20mm盐酸三(2-羧乙基)膦(tcep)的水性缓冲液中系列稀释单克隆iga1κ标准品(浓度为31g/l)；2)将经稀释的样品与chca基质混合；3)使用maldi-tof质谱分析样品。质谱覆盖10,500至13,000的m/z范围，其包括单克隆κ轻链的+2电荷态。在图1中在1比1,280的稀释下标记到轻链，并且在1比160、1比320、1比640和1比2,560的稀释下也清楚地观察到轻链。

图2显示了来自在含有5％乙酸和20mmtcep的水性缓冲液中的iga1κ标准品的系列稀释的+2电荷态的强度图。该图表明来自单克隆κ轻链的信号强度随着样品稀释至1比1,280而增加，然后在随后的稀释下降低。随着样品稀释，来自单克隆κ轻链的+2电荷态的信号增加的观察结果与样品中基质与总蛋白的比例有关。

图3显示了在7,000至25,000的m/z范围内来自图1的1比1,280稀释的maldi-tof质谱。来自单克隆κ轻链的+1、+2和+3电荷态在图中与来自血清白蛋白的+3、+4、+5和+6电荷态一起被标记。该图证明了在血清白蛋白(血清中最丰富的蛋白质)存在下观察单克隆轻链的能力。

图4显示了来自具有iggκm蛋白(浓度为4.0g/l)的患者样品的maldi-tof质谱，所述iggκm蛋白(浓度为4.0g/l)在含有5％乙酸和20mmtcep的水性缓冲液中以1比1,280稀释。在11,724.196m/z处观察到来自单克隆κ轻链的+2电荷态离子。来自血清白蛋白的+4电荷态离子也在图中被标记。

图5显示了来自具有iggλm蛋白(浓度为6.0g/l)的患者样品的maldi-tof质谱，所述iggλm蛋白(浓度为6.0g/l)在含有5％乙酸和20mmtcep的水性缓冲液中以1比1,280稀释。在11,467.0m/z处观察到来自单克隆λ轻链的+2电荷态离子。来自血清白蛋白的+4电荷态离子和多克隆κ的分子量分布也在图中被标记。

图6显示了来自具有igaκm蛋白(浓度为37g/l)的患者样品的maldi-tof质谱，所述igaκm蛋白(浓度为37g/l)在含有5％乙酸和20mmtcep的水性缓冲液中以1比1,280稀释。在11,891.836m/z处观察到来自单克隆κ轻链的+2电荷态离子。

图7显示了来自具有igaλm蛋白的患者样品的maldi-tof质谱，所述igaλm蛋白未通过血清蛋白电泳定量，所述igaλm蛋白在含有5％乙酸和20mmtcep的水性缓冲液中以1比1,280稀释。在图中标记了来自在11,139.298m/z处标记的单克隆λ轻链的+2电荷态离子。

图8显示了来自具有igmκm蛋白(浓度为8.0g/l)的患者样品的maldi-tof质谱，所述igmκm蛋白(浓度为8.0g/l)在含有5％乙酸和20mmtcep的水性缓冲液中以1比1,280稀释。在11,746.744m/z处观察到来自单克隆κ轻链的+2电荷态离子。

图9显示了来自具有igmλm蛋白(浓度为7.0g/l)的患者样品的maldi-tof质谱，所述igmλm蛋白(浓度为7.0g/l)在含有5％乙酸和20mmtcep的水性缓冲液中以1比1,280稀释。在11,350.780m/z处观察到来自单克隆λ轻链的+2电荷态离子。

图10显示了来自具有iggκm蛋白(浓度为20g/l)的患者(顶部质谱)和正常人血清(底部质谱)的maldi-tof质谱，各自在水中以1比200稀释。由于每个样品在没有酸或还原剂的情况下在水中稀释，在51,150.933m/z处观察到完整的单克隆iggκ的+3电荷态，其中重链和轻链仍通过二硫键连接(顶部质谱)。在该分子量下，正常人血清的质谱(底部质谱)中不存在峰。

图11显示了来自具有iggκm蛋白(浓度为20g/l)的患者(顶部质谱)和正常人血清(底部质谱)的maldi-tof质谱，各自在水中以1比200稀释。由于每个样品在没有酸或还原剂的情况下在水中稀释，在49,027.884m/z处观察到完整的单克隆iggκ的+3电荷态，其中重链和轻链仍通过二硫键连接(顶部质谱)。在该分子量下，正常人血清的质谱(底部质谱)中不存在峰。

图12显示了健康血液和掺有10g/liggκ骨髓瘤的血液的重构干燥样品，其包括单电荷(+1)峰(图12a)和双电荷峰(图12b)。

样品和样品制备

如本文中所述的用于鉴定和定量单克隆免疫球蛋白或多克隆免疫球蛋白的材料和方法可以包括任何合适的样品。样品可以是任何生物样品，诸如组织(例如脂肪、肝脏、肾脏、心脏、肌肉、骨或皮肤组织)或生物流体(例如血液、血清、血浆、尿液、泪液或唾液)。样品可以来自具有免疫球蛋白的患者，其包括但不限于哺乳动物，例如人、狗、猫、灵长类动物、啮齿类动物、猪、绵羊、牛、马、鸟、爬行动物或鱼。样品也可以是人造试剂，诸如已知组成的混合物或对照样品。在一些情况下，样品是来自人类患者的血清。

质谱法

如本文中所述的用于鉴定和定量单克隆免疫球蛋白或多克隆免疫球蛋白的材料和方法可以包括任何合适的质谱(ms)技术。在一些情况下，基质辅助激光吸附电离(maldi)飞行时间(tof)ms可以被用于分析样品的质谱。

将在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中所描述的本发明的范围。

实施例

实施例1：在含有酸和还原剂的水性缓冲液中稀释血清样品，然后使用maldi-tofms分析样品

通过首先用含有酸和还原剂的水性缓冲液稀释含有免疫球蛋白的样品，然后将样品与maldi基质(如α-氰基-4-羟基肉桂酸基质(chca))混合，可以使用基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof)质谱在样品中鉴定和/或定量单克隆和/或多克隆轻链。

实施例2：在水中稀释血清样品，然后使用maldi-tofms分析样品

通过首先用水稀释含有免疫球蛋白的样品，然后将样品与maldi基质(如α-氰基-4-羟基肉桂酸基质(chca))混合，可以使用基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof)质谱在样品中鉴定和/或定量观察到完整的单克隆免疫球蛋白和/或完整的多克隆免疫球蛋白。

实施例3全血干点分析

方法。

无论是否存在骨髓瘤iggκ副蛋白，将新鲜从手指刺取的毛细血管血与去离子水1+1混合。将10μl点样到3mm滤纸(whatman)上，并风干15分钟。将含有全血斑的滤纸在-80℃下最多保存3天。

在提取之前，从冷冻器中取出干燥的血斑，并使其温热至环境温度。从滤纸上切下干燥的血斑，小心地置于1.5mleppendorf管中，然后用100μl还原-洗脱缓冲液(含有20mmtcep的5％乙酸)提取30min。在离心脉冲之后除去提取的液体材料。使用半湿夹心治方法，使用自动液体处理系统(mosquito)在maldi钢靶板上进行提取物的点样。首先施加1μl的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液(chca，10mg/ml)并使其干燥。接着将1μl提取的样品，随后1μl(chca)一起施加，并使其干燥15min。在正离子模式下，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)系统获取质谱，其m/z范围涵盖5000至32,000da。

结果。

健康全血光谱显示血红蛋白的强信号，其包括源自β链的单电荷离子(+1，15870m/z)和双电荷离子(+2，m/z为7940)(图12a)。当用10g/liggk副蛋白补充血液时，观察到源自κ轻链的其它信号，其包括单电荷离子(+1，m/z为22508)和双电荷离子(+2，m/z为11261)(图12a和b)。

结论。

可以使用maldi-tofms获得、洗脱和分析全干血斑，而不需要样品处理或富集

其它实施方案

应当理解，虽然已经结合其详细描述描述了本发明，但是上述描述旨在说明而不是限制由所附权利要求书的范围所限定的本发明的范围。其它方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。