一种用于血液分析的溶血素、其制备方法、试剂及试剂盒与流程

本发明涉及血液分析技术领域，具体是一种用于血液分析的溶血素、其制备方法、试剂及试剂盒。

背景技术：

由于临床的需要，五分类血液分析仪的需求越来越多。基于各厂家白细胞、有核红细胞分类原理不同，所用的试剂也不一样。主流五分类血液分析仪分类原理主要包括高频电导激光散射联合检测法(即vcs技术)、光散射和细胞染色联合检测法、电阻抗和射频电导联合检测法、多角度激光偏振光散射检测法等，但其方法不外乎为光学法加染色技术，其所用试剂主要包括溶血素和染色液。然而，目前大多数五分类血球仪是通过两个通道来分别检测有核红细胞和嗜碱细胞，即有核红细胞检测需要一种溶血素，而检测嗜碱细胞又需要另一种不同的溶血素，操作起来比较不方便。

另外，虽然，现有技术中也有用于检测嗜碱细胞和有核红细胞的试剂，但其大多数是国外进口原装试剂，即目前有核红细胞、嗜碱细胞分析试剂存在试剂配方难度大、使用成本高、长期依赖进口、购买渠道繁琐等问题，其无法及时满足国内医院的正常使用。因此，开发一种配方简易、成本较低、能够代替进口原装试剂、可降低对国外进口产品的依赖性的血液分析试剂，是十分必要的。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种用于血液分析的溶血素，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种用于血液分析的溶血素，每升所述的溶血素包括以下组分：季铵盐类表面活性剂0.1～2g、非离子表面活性剂1～5g、缓冲剂5～10g、ph调节剂1～5g、电导率补充剂1～5g。

作为本发明实施例的一个优选方案，每升所述的溶血素包括以下组分：季铵盐类表面活性剂0.5～1.5g、非离子表面活性剂2.5～4g、缓冲剂6～8g、ph调节剂2～3g、电导率补充剂3～4g；所述的季铵盐类表面活性剂为十二烷基三甲基氯化铵；所述的非离子表面活性剂为聚氧醇酯类表面活性剂或皂苷类表面活性剂；所述的缓冲剂为邻苯二甲酸氢钾。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的非离子表面活性剂为硬脂醇聚氧乙烯醚。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的ph调节剂为甲酸、柠檬酸和马来酸中的一种或者多种。优选的，所述的ph调节剂为马来酸。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的电导率补充剂为氯化钾、氯化钠和硫酸钠中的一种或者多种。优选的，所述的电导率补充剂为氯化钠。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述溶血素的制备方法，其包括以下步骤：

按照每升所述溶血素包括的组分含量，称取季铵盐类表面活性剂、非离子表面活性剂、缓冲剂、ph调节剂、电导率补充剂，备用；

往纯化水中依次添加上述称取的季铵盐类表面活性剂、非离子表面活性剂、ph调节剂、缓冲剂和电导率补充剂进行搅拌混合，并继续添加纯化水进行定容，得到混合液；

将上述混合液用孔径为0.1～0.3μm的微孔滤膜进行过滤，得到所述的溶血素。

本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述制备方法制得的溶血素。

本发明实施例的另一目的在于提供一种用于血液分析的试剂，其包括染色液以及上述的溶血素。

作为本发明实施例的另一个优选方案，每升所述的染色液包括以下组分：不对称菁类染料0.1～0.5g，余量为助溶剂；所述的助溶剂为乙二醇、甲醇和1,2-丙二醇中的一种或者多种。优选的，所述的助溶剂为乙二醇。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的染色液的制备方法包括以下步骤：

按照每升所述染色液包括的组分含量，称取不对称菁类染料和助溶剂，备用；

往助溶剂中添加上述称取的不对称菁类染料进行搅拌混合，并用助溶剂进行定容后，再用孔径为0.1～0.3μm的疏水性微孔滤膜进行过滤，得到所述的染色液。

本发明实施例的另一目的在于提供一种用于血液分析的试剂盒，所述的试剂盒包含上述的试剂。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：

本发明实施例提供了一种溶血素的原料易得、制备方法简单，其可以配合一种染色液同时对血液中的有核红细胞和嗜碱细胞进行准确地分析检测，从而可以降低血液分析成本以及提高分析操作的便捷性。另外，本发明实施例提供的试剂只由一种溶血素和一种染色液组成，其可替代进口原装试剂实现在一个通道里同时对有血液中的核红细胞和嗜碱白细胞进行准确地检测；其中，溶血素可溶解修饰细胞，染色液对有核红细胞、嗜碱细胞的核酸进行染色，多角度光散射可检测出这两类细胞。相比于传统的两通道检测技术，本发明技术方案的优点在于：试剂减少了一种，嗜碱细胞也采用了染色法进行检测，其计数更精确。

具体的，该试剂适用于核酸染色剂原理的血液分析仪，如希森美康xn系列五分类血液分析仪。该技术原理是在仪器的wnr检测池中，全血样品与溶血素充分混匀，加入染色液进行孵育，此过程中溶血素修饰固定嗜碱白细胞、有核红细胞的形态，使其保持自然的状态，对有核红细胞、嗜碱白细胞进行不同程度的染色，同时对细胞的膜(细胞膜、核膜、颗粒膜)也进行不同程度的着色。有核红细胞、嗜碱白细胞对染色液的着色程度不同、每种细胞特定的细胞核形态和颗粒的结构造成光散射的强度不同，产生了特定的吸光率和散射光强度。因此在散点图中根据吸光度及散射光强度的不同可以检测出有核红细胞、嗜碱白细胞的结果。

附图说明

图1为血液分析的标准散射图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

该实施例提供了一种用于血液分析的试剂，其包括溶血素和染色液。其中，溶血素的制备方法包括以下步骤：

s11、称取季铵盐类表面活性剂0.1g、非离子表面活性剂1g、缓冲剂5g、ph调节剂1g、电导率补充剂1g，备用；其中，季铵盐类表面活性剂为十二烷基三甲基氯化铵；非离子表面活性剂为市售的聚氧醇酯类表面活性剂；缓冲剂为邻苯二甲酸氢钾；ph调节剂为甲酸；电导率补充剂为氯化钾。

s12、往600ml的纯化水中依次添加上述称取的季铵盐类表面活性剂、非离子表面活性剂、ph调节剂、缓冲剂和电导率补充剂进行搅拌溶解混合，并继续添加纯化水定容至1l，得到混合液。

s13、将上述混合液用孔径为0.1μm的微孔滤膜进行过滤，即可得到所述的溶血素。

另外，染色液的制备方法包括以下步骤：

s21、称取不对称菁类染料0.1g、助溶剂1l，备用。其中，助溶剂为甲醇。

s22、往600ml的助溶剂中添加上述称取的不对称菁类染料进行搅拌溶解混合，并继续用助溶剂进行定容至1l后，再用孔径为0.1μm的疏水性微孔滤膜进行过滤，即可得到所述的染色液。

实施例2

该实施例提供了一种用于血液分析的试剂，其包括溶血素和染色液。其中，溶血素的制备方法包括以下步骤：

s11、称取季铵盐类表面活性剂2g、非离子表面活性剂5g、缓冲剂10g、ph调节剂5g、电导率补充剂5g，备用；其中，季铵盐类表面活性剂为十二烷基三甲基氯化铵；非离子表面活性剂为市售的皂苷类表面活性剂；缓冲剂为邻苯二甲酸氢钾；ph调节剂为甲酸、柠檬酸和马来酸按等质量比进行混合的混合物；电导率补充剂为氯化钾、氯化钠和硫酸钠按等质量比进行混合的混合物。

s12、往600ml的纯化水中依次添加上述称取的季铵盐类表面活性剂、非离子表面活性剂、ph调节剂、缓冲剂和电导率补充剂进行搅拌溶解混合，并继续添加纯化水定容至1l，得到混合液。

s13、将上述混合液用孔径为0.3μm的微孔滤膜进行过滤，即可得到所述的溶血素。

另外，染色液的制备方法包括以下步骤：

s21、称取不对称菁类染料0.5g、助溶剂1l，备用。其中，助溶剂为乙二醇、甲醇和1,2-丙二醇按等体积混合的混合物。

s22、往600ml的助溶剂中添加上述称取的不对称菁类染料进行搅拌溶解混合，并继续用助溶剂进行定容至1l后，再用孔径为0.3μm的疏水性微孔滤膜进行过滤，即可得到所述的染色液。

实施例3

该实施例提供了一种用于血液分析的试剂，其包括溶血素和染色液。其中，溶血素的制备方法包括以下步骤：

s11、称取季铵盐类表面活性剂0.5g、非离子表面活性剂2.5g、缓冲剂6g、ph调节剂2g、电导率补充剂3g，备用；其中，季铵盐类表面活性剂为十二烷基三甲基氯化铵；非离子表面活性剂为硬脂醇聚氧乙烯醚；缓冲剂为邻苯二甲酸氢钾；ph调节剂为柠檬酸；电导率补充剂为硫酸钠。

s12、往600ml的纯化水中依次添加上述称取的季铵盐类表面活性剂、非离子表面活性剂、ph调节剂、缓冲剂和电导率补充剂进行搅拌溶解混合，并继续添加纯化水定容至1l，得到混合液。

s13、将上述混合液用孔径为0.2μm的微孔滤膜进行过滤，即可得到所述的溶血素。

另外，染色液的制备方法包括以下步骤：

s21、称取不对称菁类染料0.3g、助溶剂1l，备用。其中，助溶剂为1,2-丙二醇。

s22、往600ml的助溶剂中添加上述称取的不对称菁类染料进行搅拌溶解混合，并继续用助溶剂进行定容至1l后，再用孔径为0.2μm的疏水性微孔滤膜进行过滤，即可得到所述的染色液。

实施例4

该实施例提供了一种用于血液分析的试剂，其包括溶血素和染色液。其中，溶血素的制备方法包括以下步骤：

s11、称取季铵盐类表面活性剂1.5g、非离子表面活性剂4g、缓冲剂8g、ph调节剂3g、电导率补充剂4g，备用；其中，季铵盐类表面活性剂为十二烷基三甲基氯化铵；非离子表面活性剂为硬脂醇聚氧乙烯醚；缓冲剂为邻苯二甲酸氢钾；ph调节剂为柠檬酸和马来酸的等质量比混合物；电导率补充剂为氯化钠和硫酸钠的等质量比混合物。

s12、往600ml的纯化水中依次添加上述称取的季铵盐类表面活性剂、非离子表面活性剂、ph调节剂、缓冲剂和电导率补充剂进行搅拌溶解混合，并继续添加纯化水定容至1l，得到混合液。

s13、将上述混合液用孔径为0.2μm的微孔滤膜进行过滤，即可得到所述的溶血素。

另外，染色液的制备方法包括以下步骤：

s21、称取不对称菁类染料0.3g、助溶剂1l，备用。其中，助溶剂为乙二醇和1,2-丙二醇的等体积比混合物。

s22、往600ml的助溶剂中添加上述称取的不对称菁类染料进行搅拌溶解混合，并继续用助溶剂进行定容至1l后，再用孔径为0.2μm的疏水性微孔滤膜进行过滤，即可得到所述的染色液。

实施例5

该实施例提供了一种用于血液分析的试剂，其包括溶血素和染色液。其中，溶血素的制备方法包括以下步骤：

s11、称取季铵盐类表面活性剂1g、非离子表面活性剂3g、缓冲剂7g、ph调节剂2.5g、电导率补充剂3.5g，备用；其中，季铵盐类表面活性剂为十二烷基三甲基氯化铵；非离子表面活性剂为硬脂醇聚氧乙烯醚；缓冲剂为邻苯二甲酸氢钾；ph调节剂为马来酸；电导率补充剂为氯化钠。

s12、往600ml的纯化水中依次添加上述称取的季铵盐类表面活性剂、非离子表面活性剂、ph调节剂、缓冲剂和电导率补充剂进行搅拌溶解混合，并继续添加纯化水定容至1l，得到混合液。

s13、将上述混合液用孔径为0.2μm的微孔滤膜进行过滤，即可得到所述的溶血素。

另外，染色液的制备方法包括以下步骤：

s21、称取不对称菁类染料0.3g、助溶剂1l，备用。其中，助溶剂为乙二醇。

s22、往600ml的助溶剂中添加上述称取的不对称菁类染料进行搅拌溶解混合，并继续用助溶剂进行定容至1l后，再用孔径为0.2μm的疏水性微孔滤膜进行过滤，即可得到所述的染色液。

需要说明的是，上述实施例1～5中涉及的不对称菁类染料均可采用现有市售toto染料和yoyo染料按等质量比混合的混合物。其中，toto和yoyo是由glazer等开发的一类对核酸具有高度亲和力的不对称菁染料。该染料在溶液中无荧光，降低了检测过程中的荧光背景干扰，且其与核酸结合后会发生强烈的荧光；它们分别由单体噻唑橙to和噁唑黄yo通过一个多亚甲基胺柔性链连接成二聚体。yoyo是toto的类似物，只是其中用苯并噁唑替换了苯并噻唑，其通式如下：

对比例1

该对比例提供了一种用于血液分析的进口原装试剂，其为希森美康的sysmex-xn(b4)市售产品。

在相同的实验环境下，取30份血液样品，分别用上述实施例5提供的试剂与对比例1提供的试剂进行检测分析，其分析结果如下表1～2所示。其中，血液分析仪器采用希森美康xn系列的五分类血液分析仪，检测通道为wnr。其检测原理为：血液标本和溶血素混匀，于孵育杯中反应，表面活性剂能溶解红细胞、血小板，有核红细胞溶解为裸核，白细胞除了嗜碱白细胞保持原来形状外，其它如淋巴、单核、中性白细胞等溶解为裸核，而本身有核红细胞体积远小于白细胞；然后加入染料，染料对细胞里面的核酸物质进行染色；靠液压作用通过鞘液流动池，无粒子颗粒的鞘液包围样本，使每个细胞以单个纵列的形式通过流动池的中心轴线，并被激光光束照射，由于每种颗粒有不同程度的荧光强度(sfl)和散射光强度(fsc)，仪器可将信号转变成电信号，通过散射图(如附图1所示，图1为标准的散射图)得出各有形成分的数量及形态特征，将有核红细胞(nrbc)、嗜碱白细胞(ba)、其它白细胞(wbc)分类计数，并在三维散射图中将各类细胞显示出来；另外，通过波长为633nm的激光照射细胞，其获得的前向散射光(fsc)、侧向散射光(ssc)、侧向荧光(sfl)可对血液样本中的细胞进行计数和分类；其中，fsc、ssc反映细胞表面构造、粒子形状、核形态、折射率和反射率等，一般情况下，细胞越大，fsc的信号就越强，细胞内部构造越复杂，ssc的信号也越强；sfl主要反映核酸和细胞小器官的种类和多寡。这3种信号，运用现有的数字技术和演算法，可将白细胞、有核红细胞、网织红细胞、血小板进行分类和计数，同时也可检出异常细胞和幼稚细胞。

表1

表2

从上表1～2可以看出，本发明实施例提供的只含有一种溶血素和一种染色液的试剂，可以同时准确地检测血液中有核红细胞和嗜碱细胞含量，其检测分析效果与现有市售的进口原装试剂的相近，可替代原装试剂进行使用，以降低血液分析研发成本及各医疗机构的试剂使用成本，并解决了各级医疗机构对进口试剂的依赖性。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。