一种总氮水生态学基准阈值确定方法与流程

本发明涉及环境科学水体保护技术领域，特别涉及一种基于人工水生微宇宙技术的总氮水生态学基准阈值确定方法。

背景技术：

水是必不可少的资源和至关重要的生命支持因素。在世界水文地图上，富营养化是导致淡水生态系统退化的重要原因之一。营养物(尤其是氮和磷)的过量富集，导致贫营养水体转变为中营养状态，富营养化，最后变成超富营养化。富营养化水体由于藻类的过量繁殖以及藻类的死亡和分解而导致的氧气短缺使淡水生态系统的基本生态系统服务功能(例如饮用水供应，娱乐、鱼类和野生动植物栖息地的供应)萎缩。用于饮用水供应的水体中如果发生蓝藻(蓝—绿色藻类)周期性水华，可能对动物和人类造成严重的健康危害。因此，必须要采取有效措施限制水环境中营养物含量，控制淡水生态系统富营养化现象。

生态系统在响应营养物的梯度变化时会有从一种状态快速转变为另一种状态的一个点或区间，即存在生态阈值。因此，定量描述水生生物对营养物的响应，制定引起水生生物变化的营养物水生态学基准阈值，将营养物含量控制在阈值以下，对约束水体污染，改善易受损水体水质具有重要作用。

不同于常规污染物，营养物本身并不具有毒性，但过量的营养物会通过增加藻类生物量、改变生物群落等方式对水生态系统的结构和功能产生不利影响，因此其生态学阈值需要在水生态系统食物链营养级水平进行，以保证其科学性和有效性。

微宇宙技术是利用自然生态系统的生物学模型，将复杂和不均一的自然生态系统加以简化并对其过程进行模拟，以得到各种定量数据的技术。微宇宙体系可通过室内实验，在每个营养级别上包含了多种物种(通常是几十种)的总体响应，实现污染物在群落及以上层面的风险评估，用于评估污染物的环境影响，确定可接受的胁迫暴露(即不产生不利生态影响的暴露)的极限，识别敏感物种和环境过程，并得出对更高水平生物潜在影响的假设。

目前，总氮水生态学基准阈值的确定多是基于野外调查实验后进行推导(如利用频数分布法和临界指示物种分析法)得出，考虑到已有的阈值是基于对有限种水生态系统的研究推导而来，具有一定的局限性，其准确性还需通过室内实验进一步验证。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种总氮水生态学基准阈值确定方法，解决了现有技术中存在的缺陷。

为了实现以上发明目的，本发明采取的技术方案如下：

一种总氮水生态学基准阈值确定方法，包括以下步骤：

步骤1，总氮浓度的设定；

设置总氮浓度水平，根据所设置的浓度水平添加氮、磷，每周补给三次。共设五个总氮浓度，如表1所示，利用kno3和nh4cl进行总氮的补给，每种处理3次重复，no3^--n与nh4⁺-n质量比为5:1。

表1浓度设置

步骤2，人工微宇宙系统的构建，子步骤如下：

(1)水生生物的采集

用自然淡水，采集表层水分装到5l烧杯进行微宇宙的构建，体系维持在恒定5l，利用过0.45μm滤膜的原水补给由于采样、蒸发等造成的损失，实验所用自然淡水营养物和浮游生物背景值见表2和3。

表2水体营养物背景值

表3水体浮游生物群落结构背景值

(2)环境条件的控制

培养期间通过建立成套控温水循环系统、光照控制装置和溶解氧含量控制与实时监测系统技术装备为微宇宙体系提供了稳定的环境条件，减少微宇宙重复间变异性，环境条件见表4。所述控温水循环系统、光照控制装置和溶解氧含量控制与实时监测系统技术装备在专利名称是自然淡水浮游生物微宇宙体系构建装置及方法，申请号为201910715123.6的中国发明专利中公开。

表4环境条件

(3)响应指标的筛选与测定

筛选浮游生物丰度、叶绿素a含量和浮游生物群落构建压力—响应关系，获得引起浮游生物群落变化的总氮阈值。多样性指数包括：浮游植物shannon-weaver多样性指数、margalef丰富度指数、pielou均匀度指数和浮游动物shannon-weaver多样性指数；

具体指标测定步骤如下：

a.样品的采集；

采样前，将容器的底部和侧壁刮干净，并充分搅拌混匀。

在充分混匀的微宇宙系统中取30-50ml样品，用gf/f滤膜立即过滤，滤膜于-20℃下避光冷冻保存，用于chla测定，chla浓度采用丙酮萃取分光光度法。

在充分混匀的微宇宙体系内取20-50ml水样立即加入鲁哥试剂进行固定，鲁哥试剂用量为水样量的1.5％。静置24h以上，然后用虹吸法吸取上清液，浓缩样品，进行植物样品鉴定，鉴定依据为《中国内陆水域常见藻类图谱》和《淡水微型生物与底栖动物图谱》。

在充分混匀的微宇宙体系内取200ml水样置于25号浮游生物网(25号浮游生物网是孔径为0.064mm的浮游生物网，用于浮游生物的采集)中过滤，将网口放入100ml塑料瓶中，抖动网衣使黏附在网上的浮游动物聚集到网底，打开阀门将收集到的样本移入瓶中，并用水样清洗滤网，将浮游动物洗入瓶中，重复3次，加入5ml福尔马林溶液固定，后进行浮游动物样品鉴定，鉴定依据为《淡水微型生物与底栖动物图谱》。

b.数据分析；

浮游生物群落多样性的计算

运用shannon多样性指数h、margalef丰富度指数m和pielou均匀度指数j对浮游生物数据进行分析。计算公式如下：

h＝-∑pilog2pi

m＝(s-1)/log2n

j＝h/lns

式中：

pi——第i种的个体数与总体数的比值，pi＝ni/n；

ni——第i种个体数；

n——所有种个体数；

s——种类数。

数据统计与分析

所有数据为三个平行样的平均值，实验结果均采用平均数±标准误表示。采用单因素方差分析(one-wayanova)进行两两比较，采用独立样本t检验进行处理组与对照组间的比较。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

首次提出了基于室内实验的在生态系统水平的总氮水生态学基准阈值确定方法，可对基于野外调查实验推导得到的阈值进行室内验证，同时对总氮水生态学基准值的确定和污染防控具有重要意义。本发明方法简便、应用范围广和实用性高的特点，提高了总氮水生态学基准阈值研究的科学性、可靠性和可操作性。

附图说明

图1为本发明实施例总氮水生态学基准阈值确定方法的流程图。

图2为本发明实施例总氮对浮游植物丰度的影响示意图；

图3为本发明实施例总氮对浮游动物丰度的影响示意图；

图4为本发明实施例不同时间点浮游植物叶绿素a含量对总氮的响应条形图；

图5为本发明实施例不同时间点浮游植物群落多样性指数对总氮的响应条形图；图5a代表浮游植shannon-weaver多样性指数；图5b为margalef丰富度指数；图5c为pielou均匀度指数；

图6为本发明实施例不同时间点浮游动物shannon-weaver多样性指数对总氮的响应条形图；

图2中同一时间点不同处理中字母不同表示不同处理间差异显著p<0.05；

图3中同一时间点不同处理中字母不同表示不同处理间差异显著p<0.05；

图4中*代表与对照组相比p＜0.05；**与对照组相比代表p＜0.01；

图5中*代表与对照组相比p<0.05；**代表与对照组相比p<0.01；***代表与对照组相比p<0.001；

图6中*代表与对照组相比p＜0.05；**与对照组相比代表p＜0.01。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下根据附图并列举实施例，对本发明做进一步详细说明。

如图1所示，一种总氮水生态学基准阈值确定方法，包括以下步骤：

步骤1，总氮浓度的设定；

综合考虑《地表水环境质量标准》(gb3838-2002)的总氮标准值分类、已推导的总氮基准值和2017年秋季海河流域水质调查结果设置总氮浓度水平。根据所设置的浓度水平添加氮、磷，每周补给三次。共设5个总氮浓度(见表1)，利用kno3和nh4cl(no3^--n与nh4⁺-n质量比为5:1)进行总氮的补给，每种处理3次重复。

表1实验浓度设置

步骤2，人工微宇宙系统的构建，子步骤如下：

(1)水生生物的采集

所用水体应为受人类干扰少的低污染的自然淡水，2018年春季于海河流域大清河(117°19′38″e，38°59′49″n)采集表层水分装到5l烧杯(17cm×27cm)进行微宇宙的构建，体系维持在恒定5l，利用过0.45μm滤膜的原水(避光贮存)补给由于采样、蒸发等造成的损失，实验所用自然淡水营养物和浮游生物背景值见表2和3。

表2实验水体营养物背景值

表3实验水体浮游生物群落结构背景值

(2)环境条件的控制

培养期间通过建立成套控温水循环系统、光照控制装置和溶解氧含量控制与实时监测系统技术装备为微宇宙体系提供了稳定的环境条件，减少微宇宙重复间变异性，环境条件见表4。所述控温水循环系统、光照控制装置和溶解氧含量控制与实时监测系统技术装备在专利名称是自然淡水浮游生物微宇宙体系构建装置及方法，申请号为201910715123.6的中国发明专利中公开。

表4实验期间环境条件

(3)响应指标的筛选与测定

一般来说，水质较好的水体，浮游植物的种类多且种间的比例较均匀，多样性指数较大，均匀度指数也较高，富营养条件下，藻类过量繁殖，叶绿素a含量增加。通过文献调研及前期实验结果分析，筛选浮游生物丰度、叶绿素a含量和浮游生物群落多样性指数(浮游植物shannon-weaver多样性指数、margalef丰富度指数、pielou均匀度指数和浮游动物shannon-weaver多样性指数)构建压力—响应关系，获得引起浮游生物群落变化的总氮阈值。具体指标测定步骤如下：

a.样品的采集

采样前，用预先清洗过的高压灭菌的橡胶刮板(该刮板安装在玻璃棒上)将容器的底部和侧壁刮干净，并充分搅拌混匀。

在充分混匀的微宇宙体系中取30-50ml样品，用gf/f滤膜立即过滤，滤膜于-20℃下避光冷冻保存，用于chla测定，chla浓度采用丙酮萃取分光光度法。

在充分混匀的微宇宙体系内取20-50ml水样立即加入鲁哥试剂进行固定，鲁哥试剂用量为水样量的1.5％。静置24h以上，然后用虹吸法吸取上清液，浓缩样品，进行植物样品鉴定，鉴定可依据为《中国内陆水域常见藻类图谱》和《淡水微型生物与底栖动物图谱》。

在充分混匀的微宇宙体系内取200ml水样置于25号浮游生物网中过滤，将网口放入100ml塑料瓶中，抖动网衣使黏附在网上的浮游动物聚集到网底，打开阀门将收集到的样本移入瓶中，并用水样清洗滤网，将浮游动物洗入瓶中，重复3次，加入5ml福尔马林溶液固定，后进行浮游动物样品鉴定，鉴定依据为《淡水微型生物与底栖动物图谱》。

b.数据分析

浮游生物群落多样性的计算

运用shannon多样性指数(h)、margalef丰富度指数(m)和pielou均匀度指数(j)对浮游生物数据进行分析。计算公式如下：

h＝-∑pilog2pi

m＝(s-1)/log2n

j＝h/lns

式中：

pi——第i种的个体数与总体数的比值，pi＝ni/n；

ni——第i种个体数；

n——所有种个体数；

s——种类数。

数据统计与分析

所有数据为三个平行样的平均值，实验结果均采用平均数±标准误表示。采用单因素方差分析(one-wayanova)进行两两比较，采用独立样本t检验进行处理组与对照组间的比较。

技术效果

(1)不同浓度总氮对浮游生物丰度的影响

浮游植物丰度在整体上呈现随培养时间和总氮浓度的增加而增长的趋势(如图2所示)。14d开始出现组间差异(p<0.05)，35d后，总氮4.0mg/l水平下，浮游植物丰度显著增加(p<0.05)。

浮游动物丰度的响应方式与浮游植物不同(如图3所示)，添加少量的氮(tn1.0mg/l和tn1.5mg/l)可促进浮游动物数量的持续增长，总氮浓度超过2.0mg/l时，浮游动物丰度随培养时间的增加而降低。

(2)叶绿素a含量

控制总氮水平，测定浮游植物叶绿素a含量，结果如图4所示：从21d开始，总氮浓度超过2mg/l时，叶绿素a浓度显著提高(p<0.05)，并一直持续到实验结束。

(2)不同浓度总氮对浮游生物群落多样性的影响

构建总氮与浮游植物shannon-weaver多样性指数、margalef丰富度指数、pielou均匀度指数和浮游动物shannon-weaver多样性指数的压力-响应关系，结果表明：浮游植物是营养盐的直接利用者，对总氮环境的变化响应敏感(如图5所示)，从14d开始，当总氮浓度超过2.0mg/l时，与对照(tn0.8mg/l)相比，群落多样性显著降低(p<0.05)。浮游动物是营养盐的间接利用者，其群落多样性对总氮的响应并不敏感(如图6所示)，但从14d开始，当总氮浓度高达4.0mg/l时，与对照相比整体上仍有所降低趋势。

(3)总结

定量描述浮游生物群落结构对营养物的响应，制定引起浮游生物群落结构变化的营养物生态学阈值，对推导营养物水环境生态学基准值，约束水体污染，改善易受损水体水质具有重要作用。本研究发现，在微宇宙体系内，当总氮超过2.0mg/l时浮游生物群落与对照之间产生明显差异，主要表现在浮游植物丰度和叶绿素a含量显著增加(p<0.05)，群落多样性明显降低(p<0.05)，浮游植物群落结构的变化进一步通过营养级联效应影响浮游动物丰度，使其丰度随培养时间的增加有所降低，群落多样性整体上有降低趋势。综上所述，建议总氮生态学阈值定为2.0mg/l。

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。