一组用于预测鼻咽癌转移风险的标志物及其应用的制作方法

本发明涉及生物标志物技术领域，更具体地，涉及一组用于预测鼻咽癌转移风险的标志物及其应用。

背景技术：

鼻咽癌(npc)是一种侵袭性头颈恶性肿瘤，全世界大约40％的病例发生在我国，而在我国尤以广东省等华南地区最为高发。鼻咽癌高发于青壮年，70％的患者初次就诊时已属中晚期，给患者家庭带来沉重负担，给我国人民的生命健康带来严重威胁。近年来，随着现代影像技术的应用、放射治疗技术的进步和放化疗综合治疗策略的应用，鼻咽癌的局部控制率明显提高，远处转移成为治疗失败的主要模式。根据文献报道，鼻咽癌患者在初诊根治性治疗后的远处转移率高达30～40％，且转移性鼻咽癌患者对治疗的反应性差，预后不良，其中位生存期约12个月，3年生存率不到10％。

目前，鼻咽癌远处转移的预测主要是基于tnm临床分期，(t是原发灶，n是淋巴结，m是远处转移)，其中主要以n分期，即淋巴结分期预测鼻咽癌患者远处转移风险。最近也有研究发现，治疗前外周血的eb病毒dna载量(高发区的鼻咽癌跟eb病毒感染密切相关)也有一定的预测鼻咽癌患者转移的作用。但是相同分期和治疗前ebv水平相近的患者，在接受同一标准治疗后，是否发生转移也存在着较大差异。显然，仅仅基于解剖学信息的tnm临床分期和治疗前ebv-dna水平并不能完全准确地预测鼻咽癌患者的转移风险及预后。同时，tnm临床分期和治疗前ebv-dna水平不能很好地用于指导个性化用药，导致目前转移鼻咽癌患者的化疗有效率仅为40～65％，且化疗毒副反应大。如何有效根据患者的表型指导临床用药，具有非常重要的意义。

甄别具有“转移潜能”的鼻咽癌患者，做到提前预测并给予有效的治疗，可以显著改善这部分患者的预后。

技术实现要素：

本发明第一个方面的目的，在于提供一组用于预测鼻咽癌转移风险的标志物。

本发明第二个方面的目的，在于提供定量上述标志物或其产物表达量的试剂在制备预测鼻咽癌转移风险的检测试剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一组用于预测鼻咽癌转移风险的标志物，该组标志物包括slamf5，esm-1，mmp-8，insr，serpina5。

根据本发明第一个方面所述的标志物，该组标志物由slamf5，esm-1，mmp-8，insr，serpina5组成。

优选地，根据本发明第一个方面所述的标志物，所述标志物用于预测鼻咽癌转移风险的评分公式根据lasso-cox模型确定。

更具体地，根据本发明第一个方面所述的标志物，所述评分公式为：分值＝(0.0208×slamf5表达量)+(0.1039×esm-1表达量)+(0.1761×mmp-8表达量)+(0.0161×insr表达量)+(0.3738×serpina5表达量)。

更进一步地，根据本发明第一个方面所述的标志物，表达量log2转换，进一步地，单位为(pg/ml)。

本发明的第二个方面，提供定量标志物表达量的试剂在制备预测鼻咽癌转移风险的检测试剂中的应用，所述标志物如本发明第一个方面所述。

根据本发明第二个方面所述的应用，定量标志物表达量的试剂为蛋白定量检测试剂。

优选地，根据本发明第二个方面所述的应用，定量标志物表达量的试剂为血浆中蛋白定量检测试剂。

更优选地，根据本发明第二个方面所述的应用，所述蛋白定量检测试剂选自：elisa试剂、蛋白定量芯片。

根据本发明第二个方面所述的应用，所述定量标志物或其产物表达量的试剂用于预测鼻咽癌转移风险的评分公式根据lasso-cox模型确定。

根据本发明第二个方面所述的应用，所述定量标志物或其产物表达量的试剂用于预测鼻咽癌转移风险的评分公式为：分值＝(0.0208×slamf5表达量)+(0.1039×esm-1表达量)+(0.1761×mmp-8表达量)+(0.0161×insr表达量)+(0.3738×serpina5表达量)。

更进一步地，根据本发明第二个方面所述的应用，表达量经log2转换，进一步地，单位为(pg/ml)。

本发明的有益效果是：

本发明筛选出来的5个蛋白表达构成的蛋白标签，可以反映鼻咽癌患者的生物学特异性，可以更准确地预测鼻咽癌患者的转移风险及预后，更好地指导临床用药，对无远处生存的预测效能要优于单个蛋白，肿瘤n分期和ebv-dna水平。

附图说明

图1：k-m生存分析显示psdm高风险组鼻咽癌患者(a)无远处转移生存，(b)无疾病生存，和(c)总生存。

图2：森林图显示单因素和多因素cox分析，psdm是鼻咽癌患者无远处转移生存、无疾病生存和总生存的独立预后因素。

图3：时间依赖的roc和auc分析显示(a)5年时间点上时间依赖的roc曲线显示psdm预测鼻咽癌远处转移的效能优于每个单独的蛋白，(b)连续7年时间里时间依赖的auc分析显示psdm预测鼻咽癌远处转移的效能优于每个单独的蛋白，(c)5年时间点上时间依赖的roc曲线显示psdm预测鼻咽癌远处转移的效能优于肿瘤n分期和治疗前ebv-dna水平，和(d)连续7年时间里时间依赖的auc分析显示psdm预测鼻咽癌远处转移的效能优于肿瘤n分期和治疗前ebv-dna水平。

图4：k-m生存分析显示根据psdm分组组鼻咽癌患者是否接受tpf诱导化疗的预后(a)低风险组的无远处转移生存，(b)低风险组的无疾病生存，(c)低风险组的总生存，(d)高风险组的无远处转移生存，(e)高风险组的无疾病生存，(f)高风险组的总生存。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

病例筛选：

发明人选取了228例病人作为非转移性初治的局部晚期鼻咽癌患者的血浆样本，这些患者病人都接受是经过了根治性放射性治疗。其中的93.4％的患者病人(211例)接受过以顺铂为基础的同期化疗。经过87.5个月的随访，其中41人在随访期间发生了转移。

发明人采用raybiotechquantibodyhumankiloplexproteomicsarray高通量蛋白芯片检测了8例高转移风险(初诊无转移，但在根治性治疗后出现远处转移)和8例低转移风险(初诊无转移，且根治性治疗后随访未出现转移及复发)鼻咽癌患者的初诊血浆标本中1000个血管生成、免疫、炎症等相关蛋白，通过筛选得到50个差异蛋白。

实施例1标志物的筛选

确定与鼻咽癌无转移生存相关的蛋白：

发明人利用定制的raybiotechquantibodyarray蛋白芯片技术平台在226例标本中检测这50个差异表达基因，利用单因素cox分析筛选出与鼻咽癌无远处转移生存相关的18个血浆蛋白。

鼻咽癌转移蛋白标志物的发现：

发明人采用lasso-cox模型进一步挑选5个蛋白构成一组标志物，包括：slamf5，esm-1，mmp-8，insr，serpina5，并将这5个蛋白标志物命名为psdm(protein-basedsignaturefordistantmetastasisinla-npc，局部晚期鼻咽癌远处转移蛋白标签)。

所述标志物用于预测鼻咽癌转移风险的评分公式为：

psdm评分公式＝(0.0208×slamf5表达量)+(0.1039×esm-1表达量)+(0.1761×mmp-8表达量)+(0.0161×insr表达量)+(0.3738×serpina5表达量)。式中，表达量经raybiotech人蛋白抗体芯片测量，并经过标准化和log2转换，单位为(pg/ml)。

用时间依赖的roc曲线5年时间点曲线的敏感性和特异性之和最大的值(7.6030)作为阈值，由此将81例(35.8％)患者分为高风险组，145例(64.2％)分为低风险组；这两组患者五年的无远处转移生存率在高风险组为64.2％(95％ci置信区间54.5-75.5)，在低风险组为94.41％(95％置信区间90.6-98.2；hr风险比5.94,95％ci2.97-11.86；p<0.001；图1a)。与低风险组患者相比，高风险组患者的无疾病生存(hr2.78，95％ci1.70-4.53；p<0.001；图1b)和总生存(hr3.22,95％ci1.64-5.62；p<0.001；图1c)均较差。发明人进一步进行了单因素和多因素cox分析，显示psdm为局部晚期鼻咽癌患者无远处转移生存的独立预后因素(p<0.001；图2)。

实施例2蛋白标志物的效能试验

发明人随后将蛋白标志物组合预测鼻咽癌远处转移的效能和单个蛋白以及n分期、ebv-dna水平进行比较。时间依赖的roc曲线显示，在5年时间点上，蛋白标志物组合的效能优于每一个单独的蛋白(c-index:0.76,95％ci0.67-0.85；p<0.05；图3a)，而时间依赖的auc分析显示，在连续7年的时间跨度上，蛋白标志物组合效能总是优于每一个单独的蛋白(p<0.05；图3b)。同样地，我们也发现蛋白标志物在5年时间点和连续时间上，预测鼻咽癌转移的效能均优于n分期和治疗前ebv-dna水平(p<0.05；图3c-d)。

此外，发明人还分析了dmgn是否能预测鼻咽癌患者对多西他赛+顺铂+5-氟尿嘧啶(tpf)诱导化疗的获益。在226例患者中，利用倾向性匹配挑选了42例接受tpf诱导化疗和顺铂同期放化疗的鼻咽癌患者和42例与之性别、年龄、t分期、n分期、ebv-dna水平和接受放疗的技术匹配的单独接受顺铂同期放化疗的患者。分析显示，低风险组的患者是否接受tfp诱导化疗，生存结局无统计学差异(dmfs:hr0.59；95％ci0.10-3.54；p＝0.59；dfs:hr0.37；95％ci0.11-1.22；p＝0.089；os:hr0.35；95％ci0.07-1.83；p＝0.194；图4a-c)；而高风险组的患者接受tpf诱导化疗后无远处转移生存(hr0.21；95％ci0.05-0.92；p＝0.023；图4d)，无疾病生存(hr0.27；95％ci0.08-0.95；p＝0.029；图4e)和总生存(hr0.13；95％ci0.02-0.99；p＝0.019；图4f)均得到显著改善。

综上所述，上述5个蛋白表达构成的蛋白标签，可以反映鼻咽癌患者的生物学特异性，可以更准确地预测鼻咽癌患者的转移风险及预后，更好地指导临床用药，对无远处生存的预测效能要优于单个蛋白，肿瘤n分期和ebv-dna水平。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。