一种氧氟沙星检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及免疫学技术和食品安全检测
技术领域：
，具体为一种氧氟沙星检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：氧氟沙星(ofl)是第3代喹诺酮类抗菌药物，具有高效的抗菌作用，左氧氟沙星(lvl)是氧氟沙星的左旋异构体，为半水合物，在水中溶解度为氧氟沙星的十倍，lvl的体外抗菌活性为氧氟沙星的2倍。包括口服吸收好、血药浓度高等优点，具有抗菌谱广，抗菌能力强、毒副作用低、安全性大、作用持久、生物利用度高、组织分布广、临床疗效高和良好的药代动力学性质等特点，在临床用药、兽药和水产养殖中应用较为广泛。氧氟沙星的作用机制是通过抑制细菌的dna旋转酶的活性，从而抑制细菌dna合成和复制而导致细菌的死亡，起到快速杀菌的作用。但随着喹诺酮类药物的广泛使用，它在动物源性食品中残留的问题以及残留可能引起的耐药性等问题日益突出并引起广大学者的关注。这种药物作为兽药和饲料添加剂大量用于动物，因此残留在动物源性食品中的可能性很大。这些残留物除直接对人造成危害外，更严重的是含较低浓度氧氟沙星药物的动物源性食品的长期大量使用，会诱使人们对氧氟沙星药物敏感的致病菌产生耐药性，影响该类药物的临床疗效，从而间接危害人类健康。这些潜在的不良反应逐渐受到人们的重视，此外在当下环境、经济、贸易飞速发展的情况下，兽药残留对环境的可持续发展以及生态环境的平衡带来影响，对于我国的畜牧业及经济贸易发展极为不利。中国、美国、日本、欧盟等均对喹诺酮类药物的使用做出了限定。我国以及世界卫生组织、欧盟、日本等国家和组织都将喹诺酮类药物列入限制使用的兽药。农业部组织开展的兽药安全性评价认为，氧氟沙星原料药的各种盐、酯及其各种制剂可能对养殖业、人体健康造成危害或者存在潜在风险。农业部第2292号公告决定在食品动物中停止使用氧氟沙星等4种兽药，撤销相关兽药产品批准文号。目前，对氧氟沙星的检测主要在食品领域以及农兽药残留，食品安全检测作为保障食品安全的重要手段，发挥着越来越重要的作用。因此，寻求简便、快速、灵敏、准确检测乳与乳制品、畜禽、水产中氧氟沙星药物残留量的检测方法，满足愈来愈严格的限量要求，从而保证人类食用动物源性食品的安全。农兽药残留的检测方法主要有:理化分析法(包括高效液相色谱法、液相色谱一质谱法)、微生物法、免疫法、氧氟沙星药物在国标法中的检测方法为高效液相色谱法。高效液相色谱法等仪器方法优点是准确，缺点是所需仪器昂贵，操作繁琐、需要专业的操作人员和设备要求较高，且需要较长的时间，检测氧氟沙星药物的检出限较高，因此，不利于基层开展大量样品的检测。微生物抑制法准确度较高，检测成本低、操作简便、检测较快速、重复性好，适宜基层实验室的检测，但检测灵敏度较其他方法偏低，适用于残留量较高样品的筛选检测，而且实验周期长，微生物培养至少需要8h，不适合大批量样本的快速检测。elisa法需酶标仪读数，检测成本不高、操作较简便、检测速度快、准确度较好、重复性较好、灵敏度高，检测程序及所需条件比仪器法更加方便，适用于残留量低样品的检测。因此，利用酶联免疫试剂盒能够比国标方法更加快速、简便地检测出样本中的氧氟沙星含量，而且试剂盒的操作时间仅需45min，且特异性很好，便于现场大量检测样本的检测，更适于中小企业对成本控制的需求。免疫学检测是农兽药残留检测的发展方向，它可以做到快速和特异性。酶联免疫吸附方法(elisa法)已经逐步成为食品中农兽药残留检测的一种重要方法，及时开发出优于目前的、快速灵敏的检测试剂可谓是当务之急。技术实现要素：(一)解决的技术问题1.要解决的技术问题针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种氧氟沙星检测试剂盒及其检测方法，解决了上述问题。(二)技术方案为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种氧氟沙星检测试剂盒，所述氧氟沙星试剂盒包含试剂：96孔氧氟沙星酶标板；氧氟沙星标准品：0、0.1、0.25、0.5、1、5ng/ml，回收用100ng/ml；10x氧氟沙星抗体；抗体稀释液；酶标二抗；10x样本提取液；20x浓缩洗液；终止液和tmb底物；所述氧氟沙星试剂盒的制备方法包括以下步骤：①包被：将包被原用包被液适当稀释，100ul抗原稀释液/孔来包被96孔氧氟沙星酶标板，4℃过夜；②洗涤：用浓缩洗液洗板3次，拍干；③封闭：用封闭液进行封闭，每孔180ul，37℃封闭1.5h；④干燥：取出酶标板，倾去孔内液体，吸水纸上拍干，对酶标板进行真空干燥，贴好封板膜，便于保存。优选的，所述包被液为0.05mph9.6的碳酸盐缓冲液(cbs)，所述封闭液为1％bsa+10％蔗糖。优选的，所述浓缩洗液为1xpbst，所述浓缩洗液含0.05％tween-20，所述1x样本提取液为10xpbs缓冲液。优选的，所述终止液为1m硫酸，所述tmb为四甲基联苯胺。优选的，所述pbs缓冲液由二水合磷酸二氢钠0.39g、十二水磷酸氢二钠5.54g、nacl8.5g和蒸馏水定容至1l而成。一种氧氟沙星检测试剂盒的检测方法，其特征在于：采用间接竞争elisa法检测，操作步骤如下：①加入50ul的标准液或样品于所设定的孔中；②在每孔中加入50μl酶标二抗，再加入50μl1x氧氟沙星抗体，混匀1分钟；③室温(25℃)避光孵育30分钟；④洗板5次，每次加入300μl工作洗液，最后一次洗板尽量甩干并在吸水纸上吸干；⑤加入100ul的tmb底物；⑥加入底物后立即计时，轻敲试剂盒三秒使混匀；⑦在室温下培养15分钟，加入100ul的终止液终止反应，在450m下读0d值。优选的，所述间接竞争elisa方法的建立：一、最佳抗原包被稀释度、单克隆抗体稀释度的确定：棋盘法确定最适抗原包被稀释度，氧氟沙星标准品质量浓度使用0ng/ml，抗原液稀释倍数：10000、20000、40000；单克隆抗体液稀释倍数：10000、20000、40000、80000；酶标二抗为羊抗鼠igg-hrp，稀释倍数为3000，将包被抗原不同稀释倍数酶标板用不同稀释倍数的单克隆抗体和酶标二抗进行配合使用，筛选出吸光度在1.8-2.2左右所对应的浓度为包被抗原、抗体和酶标二抗最佳工作浓度；二、氧氟沙星标准品浓度的确定：测不同浓度氧氟沙星标准品溶液(0-100ng/ml)，初步确定线性范围，再根据结果细致缩小范围，通过不同浓度的尝试，绘制出标准曲线线性最好的一组浓度作为氧氟沙星试剂盒的最终标准品浓度。优选的，所述tmb底物底物本身是无色的，若出现颜色变化不能使用，孵育时适当覆盖微孔板。优选的，在步骤⑦所述读数前用无绒布擦拭微孔底部水分和指模。(三)有益效果与现有技术相比，本发明提供了一种氧氟沙星检测试剂盒及其检测方法，具备以下有益效果：(1)本发明的氧氟沙星检测试剂盒及其检测方法，可用于食品检测行业中氧氟沙星含量的检测，测定准确、灵敏、特异性好、重现性好、操作简单、样本前处理简单、成本低、检测量大、绿色环保、检测速度快并且易于推广。(2)本发明制备出的氧氟沙星检测试剂盒检测限低，可达0.1ng/ml，灵敏度高，板内和板间变异系数均小于10％，板内板间差异小，样本添加回收率在89.3％-114.8％，与其他类似物的交叉反应均较低，说明氧氟沙星抗体对氧氟沙星检测的特异性较高，具有良好的稳定性。附图说明图1为本发明实施例一的曲线图。具体实施方式下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例一：一种氧氟沙星检测试剂盒，氧氟沙星试剂盒包含试剂：96孔氧氟沙星酶标板；氧氟沙星标准品：0、0.1、0.25、0.5、1、5ng/ml，回收用100ng/ml；10x氧氟沙星抗体；抗体稀释液；酶标二抗；10x样本提取液；20x浓缩洗液；终止液和tmb底物；氧氟沙星试剂盒的制备方法包括以下步骤：①包被：将包被原用包被液适当稀释，100ul抗原稀释液/孔来包被96孔氧氟沙星酶标板，4℃过夜；②洗涤：用浓缩洗液洗板3次，拍干；③封闭：用封闭液进行封闭，每孔180ul，37℃封闭1.5h；④干燥：取出酶标板，倾去孔内液体，吸水纸上拍干，对酶标板进行真空干燥，贴好封板膜，便于保存。氧氟沙星试剂盒原理：氧氟沙星酶联免疫反应试剂盒基于竞争性酶联反应原理，氧氟沙星的抗体已经包被于微孔板上，样品同酶标氧氟沙星共同被添加到板孔中，如果样品中含有药物，会竞争一抗，抑制抗体与酶标抗原结合，加入底物后，产物的颜色强弱与样品中药物的浓度成反比，根据标准曲线，可计算出残留氧氟沙星的含量。进一步的，包被液为0.05mph9.6的碳酸盐缓冲液(cbs)，封闭液为1％bsa+10％蔗糖。进一步的，浓缩洗液为1xpbst，浓缩洗液含0.05％tween-20，1x样本提取液为10xpbs缓冲液。进一步的，终止液为1m硫酸，tmb为四甲基联苯胺。进一步的，pbs缓冲液由二水合磷酸二氢钠0.39g、十二水磷酸氢二钠5.54g、nacl8.5g和蒸馏水定容至1l而成。一种氧氟沙星检测试剂盒的检测方法，其特征在于：采用间接竞争elisa法检测，操作步骤如下：①加入50ul的标准液或样品于所设定的孔中；②在每孔中加入50μl酶标二抗，再加入50μl1x氧氟沙星抗体，混匀1分钟；③室温(25℃)避光孵育30分钟；④洗板5次，每次加入300μl工作洗液，最后一次洗板尽量甩干并在吸水纸上吸干；⑤加入100ul的tmb底物；⑥加入底物后立即计时，轻敲试剂盒三秒使混匀；⑦在室温下培养15分钟，加入100ul的终止液终止反应，在450m下读0d值。进一步的，tmb底物底物本身是无色的，若出现颜色变化不能使用，孵育时适当覆盖微孔板。进一步的，在步骤⑦读数前用无绒布擦拭微孔底部水分和指模。进一步的，间接竞争elisa方法的建立：一、最佳抗原包被稀释度、单克隆抗体稀释度的确定：棋盘法确定最适抗原包被稀释度，氧氟沙星标准品质量浓度使用0ng/ml，抗原液稀释倍数：10000、20000、40000；单克隆抗体液稀释倍数：10000、20000、40000、80000；酶标二抗为羊抗鼠igg-hrp，稀释倍数为3000，将包被抗原不同稀释倍数酶标板用不同稀释倍数的单克隆抗体和酶标二抗进行配合使用，筛选出吸光度在1.8-2.2左右所对应的浓度为包被抗原、抗体和酶标二抗最佳工作浓度；二、氧氟沙星标准品浓度的确定：测不同浓度氧氟沙星标准品溶液(0-100ng/ml)，初步确定线性范围，再根据结果细致缩小范围，通过不同浓度的尝试，绘制出标准曲线线性最好的一组浓度作为氧氟沙星试剂盒的最终标准品浓度。经实验证明选择包被抗原稀释倍数为20000，抗体稀释倍数为40000，酶标二抗稀释倍数为3000最佳。标准曲线的绘制：用拜发计算软件选双对数作图，如说明书附图1得出标准曲线方程、曲线的线性以及半数抑制量ic50：百分吸光率(％)＝b/b0*100(其中b为标准或样品的平均吸光度值，b0为零标准溶液的平均吸光度值)。将样本测定的吸光度值代入标准曲线，可得出样本所对应的质量浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氧氟沙星的实际质量浓度，如下表所示：实验例：实验一、试剂盒灵敏度和检测限实验：对20份空白样品进行检测，通过标准曲线得到其吸光度值所对应的浓度，用20份样本质量浓度的平均值加上3倍标准差来表示该试剂盒对这种样品的检测限；该试剂盒的检测限结果为：鲜奶：0.1ng/g，蛋/纯牛奶：1ng/g，奶粉/婴幼儿配方奶粉：2ng/g，组织(牛肉、鸡肉、猪肉)/鱼/虾：0.2ng/g，该氧氟沙星试剂盒的灵敏度可达到0.1ng/g。实验二、检测方法的精密度：测定板内和板间误差来评价该检测方法的精密度，其他条件一致情况下，同一酶标板内重复8次，计算板内变异系数来表示板内误差，不同的酶标板分别测定八次，计算板间变异系数来表示板间误差，结果如下表所示，变异系数＝标准差/吸光度平均值：由上表可知：板内和板间变异系数均小于10％，因此本发明的检测方法的精密度比较好。实验三、检测方法的准确度：通过添加回收实验来评价方法的准确度，以回收率作为方法准确度评价指标。分别按0.5、1ng/ml两个浓度的氧氟沙星对样品进行添加回收实验，每个样品做两个平行进行测定。添加回收实验中均取称好的样品直接添加氧氟沙星。添加回收实验：(1)鲜奶：添加浓度为0，0.5，1ng/ml(稀释1倍)鲜奶处理方法：①对于去脂牛奶，直接取50ul样品用于检测分析；②对于含脂牛奶，将样本4000rpm离心5分钟后弃掉脂肪层，再取50ul用于检测分析；稀释倍数:1。(2)纯牛奶：添加浓度为0，5，10ng/ml(稀释10倍)纯牛奶处理方法：①取0.1ml混匀的样本加入到0.9ml1x样品提取液中，混匀；②每孔取50μl用于检测分析；稀释倍数:10。(3)乳粉/奶粉：添加浓度为0，10，20ng/ml(稀释20倍)乳粉/奶粉处理方法：①称取1g样本，加入5ml蒸馏水，涡流振荡5分钟，充分混匀；②室温下4000g离心5分钟；③避开脂肪层取0.1ml奶样，加入0.3ml1x样品提取液，涡旋混匀；④每孔取50μl用于检测分析；稀释倍数:20。(4)鸡肉：添加浓度为0，1，2ng/ml(稀释2倍)肉类/组织/鱼/虾处理方法：①去脂肪样品，匀浆适量；②取lg匀质去脂肪样品，加入3ml乙腈，涡旋震荡5分钟；③室温下4000g离心5分钟；④取1ml上层清液(相当于0.25g原样)，在50-60℃水浴中氮气吹干；⑤加入2ml正己烷溶解残渣，再加入0.5ml1x样品提取液，涡旋30秒；⑥室温下4000g离心5分钟；⑦每孔取50μl下层液体用于检测；稀释倍数:2。蛋：添加浓度为0，5，10ng/ml(稀释10倍)(5)蛋处理方法：①匀浆样本适量；②取1g样品，加入4ml1x样品提取液，涡旋震荡5分钟；③室温下4000g离心5分钟；④取0.2ml上清液，加入0.2ml1x样品提取液，混匀；⑤每孔取50μl用于检测分析；稀释倍数:10。实验四：特异性：选择与氧氟沙星具有类似结构的药物来进行elisa测定，通过各种药物的标准曲线分别得出其ic50(半数抑制浓度)，计算氧氟沙星试剂盒对其他类似物的交叉反应率。交叉反应率(％)＝ic50(ofl)/ic50(类似物)*100(其中ic50(ofl)为引起50％抑制的氧氟沙星浓度，ic50(类似物)为引起50％抑制的氧氟沙星类似物浓度)；左氧氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、依诺沙星、吡哌酸、倍诺沙星、恩诺沙星、恶喹酸、萘啶酸等药物用pbs稀释至与试剂盒标准品相同浓度，进行实验，得到抑制曲线，从而计算交叉反应率，结果如下表所示：名称ic50交叉反应率(％)氧氟沙星1.1100环丙沙星2.642达氟沙星3.432依诺沙星7.914吡哌酸1011倍诺沙星36.73恩诺沙星36.73恶喹酸27.54萘啶酸552实验五、稳定性测试：由于酶联免疫试剂盒的试剂(尤其是酶)会受到温度的影响，保存温度的过高或过低都会对其质量产生影响，因此稳定性测试是评价试剂盒质量的一个重要方面，本发明通过分析该试剂盒在不同温度下的保存时间，结果表明，当试剂盒在4℃条件下保存12个月，在37℃条件下保存7d，测定的最大光密度值(零标准)、50％抑制浓度、喹诺酮类药物添加回收率均在正常范围之内，验证了该试剂盒具有良好的稳定性。综上所述：本方法制备出的氧氟沙星检测试剂盒检测限低，可达0.1ng/ml，灵敏度高，板内和板间变异系数均小于10％，板内板间差异小，样本添加回收率在89.3％-114.8％，与其他类似物的交叉反应均较低，说明氧氟沙星抗体对氧氟沙星检测的特异性较高，且具有良好的稳定性。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12