一种液相色谱-串联质谱法测定血浆中拉西地平浓度的方法与流程

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种液相色谱-串联质谱法测定血浆中拉西地平浓度的方法。

背景技术：

拉西地平（lacidipine，lac）为第三代二氢吡啶类钙拮抗剂，其降压作用温和持久，用量少，副作用小，临床上将其列为治疗轻、中度原发性高血压（eh）的首选药物之一。

拉西地平仿制药研发过程中需要进行临床生物等效性研究，对比仿制药物和原研药物在人体内暴露量及吸收程度。因此需要测定血液中拉西地平的浓度。拉西地平临床用药量为每日4-8mg，服用4mg后单次给药的达峰浓度为2-8ng/ml，但现有的检测方法的灵敏度较差，受限于检测方法灵敏度，临床研究中常常通过增加药物剂量的方法，提升药物在血液中的浓度，进而获得完整的药物动力学参数。药物剂量的提升容易对受试者的身体造成不良影响。另外现有方法也存在操作复杂、需要耗时的浓缩步骤、分析时间长、信噪比不佳等特点。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种灵敏的液相色谱-串联质谱法测定血浆中拉西地平的方法。采用本发明的方法可以实现对血浆中拉西地平灵敏、快速检测；而且血浆用量少，样品前处理简单。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种液相色谱-串联质谱法测定血浆中拉西地平浓度的方法，包括如下步骤：

（1）对血浆样品进行前处理；

（2）采用液相色谱-串联质谱法测定步骤（1）中经前处理后的血浆样品中拉西地平的浓度；

所述液相色谱-串联质谱法包括色谱条件和质谱条件，其中：

所述色谱条件包括：以体积百分数为0.005%的甲酸水溶液作为流动相a，以乙腈作为流动相b，梯度洗脱，在0min时，流动相a：流动相b体积比为20:80，在0.6min时，流动相a：流动相b体积比为50:50，在1.5min时，流动相a：流动相b体积比为75:25，在2.4min时，流动相a：流动相b体积比为45:55，在3.2min时，流动相a：流动相b体积比为25:75，在3.5min时，流动相a：流动相b体积比为20:80；流速0.6ml/min。

所述质谱条件包括：离子源：电喷雾电离正离子检测；喷雾气温度：500℃；雾化气：65psi；气帘气：35psi；碰撞气：9psi；电离电流：3.0μa；扫描时间：200ms；扫描方式：多反应监测。用于定量的离子反应分别为：m/z473.5→354.3（拉西地平）和m/z481.4→362.3（拉西地平-¹³c8）；碰撞能量20ev。

优选的，步骤（1）中，对血浆样品进行前处理的方法为：向50µl血浆样品中加入50µl内标溶液，再加入400µl的乙腈，涡流振荡10min，4℃条件下以3900rpm速度离心10min，将离心后的上清液转移至另一96孔板中。

更优选的，所述内标溶液为50ng/ml的拉西地平-¹³c8溶液，溶剂为体积比50:50的甲醇：水混合液。

优选的，步骤（2）中，所述色谱条件还包括：色谱柱为lunapfp柱，进样量为10.0µl。

本发明的有益效果：

（1）本发明建立了液相色谱-串联质谱法测定人血浆中拉西地平的方法。血浆样品以沉淀蛋白法进行处理后直接进样分析，分析方法的定量下限为0.025ng/ml，较现有最灵敏的检测方法灵敏度提升4.0倍。

（2）本发明与现有技术相比灵敏度得到较大提升，拉西地平临床生物等效性研究中药物的剂量大幅降低，显著提高了临床研究的安全性。

附图说明

图1：拉西地平的[m+h]⁺的产物离子扫描图。

图2：拉西地平-¹³c8的[m+h]⁺的产物离子扫描图。

图3：空白血浆样品中拉西地平（左）和拉西地平-¹³c8（右）的典型色谱图。

图4：定量下限样品中拉西地平（左）和拉西地平-¹³c8（右）的典型色谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：

拉西地平（批号：hd037-s-171106，纯度：99.62%）购于北京百美特生物制药有限公司；拉西地平-¹³c8（批号：dbg-als-07-178b，化学纯度98.5%，同位素纯度99.0%）购于北京百美特生物制药有限公司；色谱级甲醇和乙腈均购于美国sigma公司；色谱级甲酸购于日本tci公司；去离子水由法国millipore纯水仪制备。美国菲罗门公司的lunapfp柱。

实施例1：液相色谱-串联质谱法测定血浆中拉西地平

1.仪器：

sciex公司的triplequad^tm6500⁺三重四极杆串联质谱仪和analyst1.6.3数据处理软件；日本岛津公司的lc-30高效液相色谱系统，包括dgu-20a5r脱气机，lc-30ad输液泵，sil-30ac自动进样器，cto-20a柱温箱。

2.血浆样品前处理：

向50µl血浆样品中加入50µl拉西地平-¹³c8内标溶液（浓度为50ng/ml，溶剂为体积比50:50的甲醇：水混合液），再加入400µl的乙腈，涡流振荡10min，4℃条件下以3900rpm速度离心10min，将离心后的上清液转移至另一96孔板中。取上清液10.0µl进行lc-ms/ms分析。

3.标准系列样品和质控样品的制备：

称取两份拉西地平标准品，用甲醇定容溶解获得浓度分别为0.150mg/ml和0.152mg/ml的拉西地平的储备液，一份用于标准系列溶液的配制，一份用于质控（qc）溶液的配制。取拉西地平的储备液和qc储备液以甲醇-水（1:1，v/v）稀释，获得拉西地平标准系列工作溶液和质控溶液，以人的空白血浆稀释标准系列工作溶液和质控溶液，获得浓度分别为0.0250、0.0500、0.125、0.375、1.25、3.75、9.00和10.00ng^.ml⁻¹标准曲线系列样品，以及浓度分别为0.0750ng^.ml⁻¹、0.625ng^.ml⁻¹、8.00ng^.ml⁻¹质控样品。

3.lc-ms/ms分析：

3.1色谱条件：

采用lunapfp柱，以体积百分数为0.005%的甲酸水溶液作为流动相a，以乙腈作为流动相b，梯度洗脱，在0min时，流动相a：流动相b体积比为20:80，在0.6min时，流动相a：流动相b体积比为50:50，在1.5min时，流动相a：流动相b体积比为75:25，在2.4min时，流动相a：流动相b体积比为45:55，在3.2min时，流动相a：流动相b体积比为25:75，在3.5min时，流动相a：流动相b体积比为20:80；流速0.6ml/min；进样量10.0µl。

3.2质谱条件：

离子源：电喷雾电离正离子检测；喷雾气温度：500℃；雾化气：65psi；气帘气：35psi；碰撞气：9psi；电离电流：3.0μa；扫描时间：200ms；扫描方式：多反应监测。用于定量的离子反应分别为：m/z473.5→354.3（拉西地平）和m/z481.4→362.3（拉西地平-¹³c8）；碰撞能量20ev。

实施例2：方法学验证

对实施例1的测定方法进行方法学验证，具体如下：

1.选择性：

分析6个不同来源个体空白血浆、溶血血浆、高血脂血浆以及上述空白血浆配制的定量下限样品评价方法的选择性。

结果表明，内源性物质不干扰拉西地平及拉西地平-¹³c8的测定。

2.标准曲线：

以拉西地平理论浓度为横坐标（x），拉西地平与拉西地平-¹³c8的峰面积比为纵坐标（y），进行回归分析计算的直线回归方程，权重因子w=1/x²，拉西地平血浆浓度范围0.025~10.0ng^.ml⁻¹内线性关系良好。典型的标准曲线回归方程为：y=0.392x+0.000911（r=0.9968）。

3.精密度和准确度：

方法验证三个分析批中，每一批检测定量下限样品及低（0.075ng/ml）、中(0.625ng/ml)、高浓度(8.00ng/ml)水平qc样品各6样本，计算各批内（n=6）以及批间（n=18）精密度和准确度。

结果表明，qc样品的精密度（cv%）最大值为10.4，相对偏差（re%）为-1.6~4.4。

4.回收率：

拉西地平在低、中、高三个质控浓度水平下的提取回收率接近，分别为103.2%、99.4%和101.3%。内标的回收率为102.1%。

5.基质效应：

本试验考察6个不同来源空白血浆中，拉西地平在低、高两个质控浓度水平下的基质效应，内标归一化基质效应因子均值分别为100.7%和100.3%，不同来源空白血浆无明显差异，精密度均小于2.4%。测定高脂血浆和溶血血浆配制的低、高两浓度质控样品，用于评价高脂和溶血血浆的基质效应。

结果表明，高脂和溶血血浆不影响拉西地平浓度测定，测定值与理论值相对偏差在-7.1%~1.2%之间。因此本实验检测条件下，可忽略基质效应的影响。

综合上述实施例可以看出：本发明建立了灵敏、快速的液相色谱-串联质谱法测定人血浆中拉西地平的方法。血浆样品以乙腈作为溶剂，采用沉淀蛋白法进行处理后直接进样分析，分析方法的定量下限为0.025ng/ml，较现有最灵敏的检测方法灵敏度（0.1ng/ml）有了大幅的提升。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。