基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法与流程

本发明涉及乙酰胆碱酯酶检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法。

背景技术：

由于有机磷农药的过度使用，它们的残留物可能存在于大气、土壤、地下水甚至农业产品中，这些残留物即使浓度很低也对人体健康和生态环境有害，这给人们正常生活带来了极大的危险。有机磷农药主要通过抑制乙酰胆碱酯酶活性引起神经递质乙酰胆碱的积累，从而诱发严重的临床并发症，严重时会导致呼吸道纤维性化并最终死亡。尽管目前检测到大多数有机磷农药的浓度均没有超过标准，但其生物体内的累积效应和持续接触会提高对人类健康安全的风险，因此，有机磷农药残留分析是保证食品质量安全、保护生态环境和保护人类健康免受危害的重要手段。传统的有机磷农药残留检测方法通常采用高效液相色谱法、气相色谱法和质谱法等常规色谱技术进行。但这些方法有前处理过程繁琐、分析时间长、仪器及药品成本高等不足。因此，建立简单、快速且灵敏度高的有机磷农药检测方法逐渐成为研究重点。

现有的有机磷农药检测方法多使用大型仪器作为荧光的探测器，一方面较为笨重不易携带，另一方面检测不够简单快速，因此不利于对现场食品和环境中的有机磷农药残留检测。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的另一个目的是提供一种简单、便携、灵敏的检测方法，便于现场对食品和环境中的有机磷农药残留进行检测。

本发明提供的方案具体如下：

一种基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法，包括：

步骤一、将琼脂糖、碳点和碲化镉量子点混合溶解在tris-hcl缓冲液中制得目标响应水凝胶；

步骤二、制备n份不同浓度的有机磷农药标准溶液，其中，n≥2；

步骤三、将每份不同浓度的有机磷农药标准溶液分别与乙酰胆碱酯酶混合反应，再与硫代乙酰胆碱混合反应，然后添加铜离子和tris-hcl缓冲液后继续混合反应得到混合溶液，最后将所得的混合溶液与所述目标响应水凝胶于离心管中反应得到n份待检测标准溶液；

步骤四、在紫外线照射条件下，拍摄获得每份待检测标准溶液对应的离心管盖子上的彩色数字图像，对彩色图像进行分析获得绿色通道g和红色通道r，建立强度比值r/g与有机磷农药浓度之间的线性关系式。

上述技术方案中，使用荧光性能优越的碳点和量子点作为信号探针，以乙酰胆碱酯酶作为有机磷农药的承载媒介，使用紫外光照射，拍摄得到荧光的彩色数字图像，分析获得红绿色通道后，就可以建立建立强度比值r/g与有机磷农药浓度之间的线性关系式。该方案可以使用紫外暗箱、手机和笔记本电脑等便携式设备代替大型仪器作为荧光的探测器，检测方法更加简单、便携、灵敏，便于现场对食品和环境中的有机磷农药残留进行检测。

优选的是，所述的基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法中，直接利用紫外灯箱提供紫外线照射条件，直接利用智能手机拍摄获得彩色数字图片，利用imagej软件对彩色图片进行分析获得绿色通道和红色通道。

优选的是，所述的基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法中，所述碳点的制备过程包括：

步骤ⅰ、将间苯二胺溶于无水乙醇中搅拌并超声匀化，然后在180℃恒温反应12小时，冷却至20～25℃室温后得到棕色粗产物溶液；

步骤ⅱ、用二氯甲烷和甲醇混合物作为洗脱剂，用硅胶柱层析分离法纯化棕色粗产物溶液；

步骤ⅲ、将纯化的棕色粗产物溶液经过旋转蒸发和真空干燥除去溶剂后，得到固体粉末即为所述碳点。

优选的是，所述的基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法中，所述碲化镉量子点的制备过程包括：

步骤ⅰ、将碲粉和硼氢化钠添加到超纯水中，在氮气保护下冰浴搅拌得到nahte溶液；

步骤ⅱ、将氯化镉水合物和巯基丙酸溶解在水中，并使用氢氧化钠将溶液的ph值调节至10.5，在氮气保护下搅拌均匀后，将制得的nahte溶液注入，并继续通氮气20分钟；

步骤ⅲ、将步骤ⅱ制得的混合物加热回流，获得发射红色荧光的碲化镉量子点粗产物；将碲化镉量子点粗产物用乙醇沉淀后，离心除去未反应的杂质得到碲化镉量子点溶液；最后，将所得的碲化镉量子点溶液经过旋转蒸发、真空干燥除去溶剂后，最终得到的固体粉末即为碲化镉量子点。

优选的是，所述的基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法中，所述步骤一中目标响应水凝胶的制备方法具体为：

将0.024g的琼脂糖、1ml浓度为15μg/ml的碳点和1ml浓度为40μg/ml的碲化镉量子点混合溶解在2ml浓度为50mm和ph7.5的tris-hcl缓冲液中反应得到所述目标响应水凝胶。

优选的是，所述的基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法中，所述步骤二中的有机磷农药标准溶液的配制过程具体包括：

步骤a、使用敌敌畏原液和超纯水配制含有机磷农药的原溶液；

步骤b、分别量取不同体积的原溶液，并分别用相同浓度的tris-hcl缓冲液稀释至相同体积，配制成不同浓度的有机磷农药标准溶液。

优选的是，所述的基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法中，所述步骤二中，n＝7，7份有机磷农药标准溶液的浓度分别为0ppb、0.1ppb、0.5ppb、1ppb、5ppb、10ppb和50ppb。

优选的是，所述的基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法中，所述步骤三中，待检测标准溶液分为7份，每份分别加入步骤二配制的有机磷农药标准溶液，每份中加入的乙酰胆碱酯酶、硫代乙酰胆碱和铜离子的体积为100μl，7份待检测标准溶液中乙酰胆碱酯酶浓度为1.5u/l，硫代乙酰胆碱浓度为80μm，铜离子浓度为0.3μm，碳点的最终浓度为0.75μg/ml，碲化镉量子点的最终浓度为2μg/ml。

优选的是，所述的基于目标响应水凝胶与手机套件检测有机磷农药的方法中，所述步骤三中，tris-hcl缓冲液的浓度为50mm，ph为7.5。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明使用荧光性能优越的碳点和量子点作为信号探针，以乙酰胆碱酯酶作为有机磷农药的承载媒介，使用紫外光照射，拍摄得到荧光的彩色数字图像，分析获得红绿色通道后，就可以建立建立强度比值r/g与有机磷农药浓度之间的线性关系式。该方案可以使用紫外暗箱、手机和笔记本电脑等便携式设备代替大型仪器作为荧光的探测器，检测方法更加简单、便携、灵敏，便于现场对食品和环境中的有机磷农药残留进行检测。

本发明检测过程简单方便，灵敏度高，实现了有机磷农药的灵敏和比率型检测，并降低了有机磷农药的检测限。

本发明的方法中，碲化镉量子点表面的巯基丙酸与铜离子的亲和常数高，能通过形成络合物降低碲化镉量子点的稳定性，结合到碲化镉量子点表面的铜离子可通过电子转移猝灭碲化镉量子点的荧光。当存在乙酰胆碱酯酶时，硫代乙酰胆碱被水解并生成硫代胆碱，巯基化合物能通过对铜离子的络合作用降低碲化镉量子点的荧光猝灭，此时，碳点的荧光强度仍不会发生改变，当有机磷农药存在时，乙酰胆碱酯酶活性被抑制，从而抑制上述整个过程的发生，达到检测有机磷农药的目的。

本发明选用具有优异的荧光性能的碳点和碲化镉量子点作为荧光探针，在整个体系的设计中，对有机磷农药浓度变化敏感的碲化镉量子点作为比率型荧光探针中的工作信号，而碳点具有良好的光稳定性和化学惰性且对有机磷农药浓度变化不敏感，因此碳点被选作比率型荧光探针中的参比信号。

本发明采用比率型荧光检测方法，相对于单信号的荧光检测方法，比率型荧光方法的两个荧光峰的存在提供了对外部干扰的内在校正，以削弱甚至消除探针的浓度、基质的光散射、激发光源波动和样品所处的微环境因素的干扰，增加本方法检测的灵敏度和准确性。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的实施例4中在不同浓度的有机磷农药下，在紫外暗箱下通过智能手机摄像头得到的彩色数字图像；

图2为本发明实施例4中绿色通道(g)和红色通道(r)的强度比值r/g与有机磷农药浓度的对数之间的线性关系式。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

制备碳点：将0.5g的间苯二胺溶于50ml无水乙醇中搅拌并超声匀化5分钟。然后转移到25ml的高压反应釜中，在180℃条件下恒温反应12小时，冷却至室温后得到棕色粗产物溶液。用二氯甲烷和甲醇混合物作为洗脱剂，用硅胶柱层析分离法纯化棕色粗产物溶液。纯化的棕色粗产物溶液经过旋转蒸发后真空干燥除去溶剂后，最终得到固体粉末为碳点。最后将得到的碳点配制成浓度为15μg/ml的碳点溶液备用。

实施例2

制备碲化镉量子点：将0.0638g的碲粉和0.1g的硼氢化钠添加到1ml超纯水中，在氮气保护下冰浴搅拌6小时得到nahte溶液。将0.0457g的氯化镉水合物和42μl的巯基丙酸溶解在50ml水中，并使用1.0m的氢氧化钠将溶液的ph值调节至10.5，在氮气保护下经过30分钟在剧烈搅拌后，将200μl新鲜制备的nahte溶液迅速下注入并继续通氮气20分钟。将所得的混合物加热到100℃后将回流6小时，以获得发射红色荧光的碲化镉量子点粗产物。所得碲化镉量子点粗产物用三倍体积的乙醇沉淀后，通过以5000转/分钟离心5分钟除去未反应的杂质得到碲化镉量子点溶液，该纯化过程重复三次。最后，将得到的碲化镉量子点溶液经过旋转蒸发后真空干燥除去溶剂，最终得到固体粉末为碲化镉量子点。最后将得到的碲化镉量子点配制成浓度为40μg/ml的碲化镉量子点溶液。

实施例3

制备目标响应水凝胶：

将0.024g的琼脂糖、1ml实施例1中的碳点(15μg/ml)和1ml实施例2中的的碲化镉量子点(40μg/ml)混合溶解在2ml的tris-hcl缓冲液(50mm，ph7.5)得到目标响应水凝胶。然后，将200μl的目标响应水凝胶转移到离心管的盖子中备用。

实施例4

步骤一、使用敌敌畏原液和超纯水配制含有机磷农药的原溶液；分别量取不同体积的原溶液，并分别用相同浓度的tris-hcl缓冲液稀释至相同体积，配制成7份不同浓度的有机磷农药标准溶液；7份有机磷农药标准溶液的浓度分别为0ppb、0.1ppb、0.5ppb、1ppb、5ppb、10ppb和50ppb。

步骤二、将待检测标准溶液分为7份，将每份不同浓度的有机磷农药标准溶液100μl与100μl的乙酰胆碱酯酶(15u/l)混合在25℃反应25分钟，然后与50μl的硫代乙酰胆碱(0.8mm)混合并在37℃水浴中反应20分钟后，添加100μl的铜离子(3μm)和450μl的tris-hcl缓冲液(50mm，ph7.5)得到混合溶液。最后，将混合溶液倒置并渗透到实施例3的目标响应水凝胶中反应5分钟，分别得到7份待检测标准溶液。

步骤三、将步骤二中的7份待检测标准溶液在紫外灯箱里，在紫外线照射下，通过智能手机摄像头获得离心管盖子上的彩色数字图像。如图1所示，从左到右，随有机磷农药的浓度增加，水凝胶颜色从粉红色逐渐变为绿色。

步骤四、通过imagej软件对彩色数字图像分析，得到绿色通道(g)和红色通道(r)的强度比值r/g与有机磷农药浓度作标准曲线可得线性方程。如图2所示，建立强度比值r/g与有机磷农药浓度对数之间的线性关系式，以有机磷农药的浓度为横坐标，比值r/g为纵坐标，可得关系式r/g＝-0.77×log[c敌敌畏]+1.4，其中r²＝0.992，检出限可达2.3ppb。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。