野六谷药材的质量控制方法与流程

本发明属于中草药药材质量控制技术领域，尤其涉及一种野六谷药材的质量控制方法。

背景技术：

野六谷为禾本科植物薏苡(coixlacryma-jobil.)的干燥根。薏苡，瑶族民间称为野六谷，也称为老鸦珠。野六谷，以根作为药用部位，始载于《本经》，俗名打碗子根，且在中国各少数民族如壮族、瑶族、傣族等，均有记载，曾收载于我国部分省市的地方药材标准，如《云南省中药材标准(2005年版)(第三册·傣族药)》和《上海市中药材标准》等。此外，《中国植物志》、《中药大辞典》、《全国中草药汇编》、《中华本草》、《广西本草选编》等大型辞书中对其药用价值、原植物、地理分布、产销情况亦有简要记述。野六谷在广西瑶族集居地，如金秀、恭城、巴马和凤山等地均有分布。本品多生于湿润的屋旁、山谷，野生或栽培。野六谷为广西瑶族民间习惯常用的药材，在瑶族民间中使用广泛，野六谷在瑶族地区部分药市有销售，如《广西恭城瑶族端午药市药用植物资源》中就有记载。《中国瑶药学》记载，本品具有健脾利肺，清热利湿，祛风除湿，驱虫的功效，主要用于尿路感染或结石、黄疽型肝炎、肝硬化腹水、水肿、尿浊、白带、经闭、疝气、虫积腹痛、小儿肺炎、高热喘咳、风湿性关节炎、肾炎腰痛、夜盲症、血尿等。

野六谷在广西瑶族民间主要以根入药用。本品全年均可采挖。产地加工大多除去芦头及泥沙，晒干。文献报道，野六谷主要含酚类、薏苡多糖类、脂类(薏苡素)等成分，分别具有一定的药理作用，其中薏苡素为野六谷的主要有效成分，具有抗癌、镇痛、消炎等功效。瑶医认为，野六谷具有清热利湿、健脾和杀虫等功效，用于治疗热淋、血淋、石淋、黄疸、水肿、白带过多、脚气、风湿痹痛和蛔虫病等症。研究资料表明，从野六谷根中分离得到的benzoxanzinoid类化合物——薏苡素，具有抗炎镇痛作用，可以抑制刀豆蛋白a，刺激及免疫蛋白e(反应素)致敏的小鼠肥大细胞的组胺释放。此外，有研究表明，薏苡素对癌细胞有抑制作用，且对中枢神经系统有镇静、镇痛的作用；能有效缓解疼痛及炎症反应，有抗血栓等作用；对肌肉具有收缩作用，对中枢神经系统具有镇静、抑制、镇痛及降温与解热作用。

野六谷在民间的临床疗效作用已得到认可，但作为广西瑶族民间常用药材，野六谷尚未建立质量控制方法，难以控制药材品质，不利于野六谷药材的生产、流通、使用、检验及监管。因此，需要建立野六谷的质量控制方法，以控制野六谷药材的质量。目前，未见关于野六谷药材的显微鉴别、薄层鉴别相关研究的报道。野六谷薏苡素含量测定方法虽已有文献报道，但文献方法采用的流动相为乙腈-水或乙腈0.1％磷酸溶液，且均采用等度洗脱，结果目标峰的出峰时间较长。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种野六谷药材的质量控制方法，以便于鉴别野六谷药材真伪、评价野六谷药材质量优劣，保证用药安全。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

野六谷药材的质量控制方法，主要包括薏苡素含量测定，含量测定采用甲醇超声提取野六谷药材，以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为232nm。

含量测定按以下操作进行：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；按下表梯度洗脱程序中规定进行梯度洗脱；

表1梯度洗脱程序

其中，柱温25℃；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

对照品溶液与供试品溶液分别按以下操作进行制备：

对照品溶液：精密称薏苡素对照品，加甲醇制成每1ml含薏苡素55μg的溶液，即得；

供试品溶液：取野六谷药材粉末1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

上述野六谷药材的质量控制方法，还包括薄层鉴别，薄层鉴别采用硅胶gf254薄层板，以石油醚-二氯甲烷-甲醇-冰醋酸溶液作为展开剂。

展开剂为体积比6：4：1：0.1的石油醚-二氯甲烷-甲醇-冰醋酸溶液。

薄层鉴别按以下操作进行：吸取供试品溶液、对照药材溶液各4～8μl，对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以展开剂进行展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。

供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液分别按以下操作进行制备：

供试品溶液或对照药材溶液：取野六谷药材粉末或野六谷对照药材粉末1g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得；

对照品溶液：取薏苡素对照品，加甲醇制成每1ml含薏苡素1mg的溶液。

上述野六谷药材的质量控制方法，还包括药材显微鉴别，显微鉴别中，

根横切面的表皮细胞1列，方圆形；皮层宽，下皮层细胞4～6列，细胞类圆形或多角形，其间有1～2列纤维环状分布，纤维壁薄，木化，在下皮层和中柱间有18～20余个花瓣状裂隙环绕，裂隙之间有1～3列薄壁细胞分隔；内皮层明显，向内的细胞壁明显增厚；韧皮部薄，细胞类圆形或不规则形；木质部稍宽，导管1列沿切向排列成环，直径45～115μm；髓部约占茎的四分之一，细胞类圆形，壁较厚；薄壁细胞中有的含有淀粉粒；

药材粉末呈灰黄色；纤维成束或分离，先端圆钝或折断，纤维壁厚薄不一，有的纤维密布圆形或人字形纹孔；纤维直径15～38μm；淀粉粒单粒或复粒，圆形、半圆形或类圆形，脐点点状、裂缝状或人字状，直径6～16μm；导管为网纹导管和具缘纹孔导管，直径20～68μm；木薄壁细胞长方形，有较多的点状纹孔，长90～170μm，宽16～38μm。

针对目前野六谷药材缺乏相关质量标准的问题，在现有技术手段的基础上，经过科学系统的研究，发明人建立了一种野六谷药材的质量控制方法，主要包括薏苡素含量测定，采用甲醇超声提取野六谷药材，以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为232nm。实验表明，该方法具有较强的专属性和良好的重现性，结果缩短了目标峰的出峰时间，提高了效率。据此，发明人进一步研究了野六谷药材的薄层鉴别和显微鉴别，为制订科学的野六谷药材质量标准提供了科学依据。综上，本发明可用于鉴别野六谷药材真伪和评价野六谷药材质量优劣，控制野六谷药材的质量，确保人民群众用药安全有效。

附图说明

图1是野六谷横切面的构造图，图中：1.表皮，2.纤维，3.皮层，4.裂隙，5.内皮层，6.韧皮部，7.木质部，8.导管，9.髓部。

图2是野六谷粉末的构造图，图中：1导管，2淀粉粒，3纤维，4木薄壁细胞。

图3是10种不同产地野六谷的薄层鉴别图，图中：1-10分别是1#～10#不同产地的野六谷药材，其中8#是野六谷对照药材；11.薏苡素对照品；特征斑点a、b、c为暗斑点。

图4是hplc色谱图，图中：a.对照品，b.供试品，c.阴性对照，*—薏苡素峰。

具体实施方式

以下各例所用野六谷药材来自10个不同产地，经专家鉴定为禾本科植物薏苡coixlacryma-jobil.的根。药材来源详细信息见表2。

表2不同产地野六谷编号

实施例1显微鉴别(图1、图2)

对自10个不同产地的野六谷药材的显微结构进行了鉴别，结果如图1：

野六谷的根横切面表皮细胞1列，方圆形。皮层宽，下皮层细胞4～6列，细胞类圆形或多角形，其间有1～2列纤维环状分布，纤维壁薄，木化，在下皮层和中柱间有18～20余个花瓣状裂隙环绕，裂隙之间有1～3列薄壁细胞分隔。内皮层明显，向内的细胞壁明显增厚。韧皮部薄，细胞类圆形或不规则形。木质部稍宽，导管1列沿切向排列成环，直径45～115μm。髓部约占茎的四分之一，细胞类圆形，壁较厚。本品薄壁细胞中有的含有淀粉粒。

对所有野六谷药材粉末进行了显微观察，结果如图2：

药材粉末呈灰黄色。纤维成束或分离，先端圆钝或折断，纤维壁厚薄不一，有的纤维密布圆形或人字形纹孔；纤维直径15～38μm。淀粉粒单粒或复粒，圆形、半圆形或类圆形，脐点点状、裂缝状或人字状，直径6～16μm。导管为网纹导管和具缘纹孔导管，直径20～68μm。木薄壁细胞长方形，有较多的点状纹孔，长90～170μm，宽16～38μm。

综上，野六谷药材的显微鉴别要点：根的横切面皮层宽，其间有1～2列纤维环状分布，在下皮层和中柱间有18～20余个花瓣状裂隙环绕，裂隙之间有1～3列薄壁细胞分隔；木质部导管1列沿切向排列成环；根横切面和粉末薄壁细胞中有的含有淀粉粒；粉末可见网纹导管和具缘纹孔导管。

实施例2薄层色谱分析

以野六谷药材粉末制成的溶液为供试品，取药材粉未1g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取野六谷对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取薏苡素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各4～8μl，对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以石油醚-二氯甲烷-甲醇-冰醋酸(6：4：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。

测定10批药材样品，结果如图3所示，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，也说明tlc方法重复性较好。

实施例3含量测定

一、仪器与材料

lc-20at高效液相色谱仪(岛津公司，带自动进样器及dad检测器)；kq-3200db型数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)；xs205十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；master-s15超纯水器(上海和泰公司)等。薏苡素对照品(南昌贝塔生物科技有限公司，批号20607-201809，纯度为99.8％，供含量测定用)；流动相所用甲醇、乙腈为色谱纯(德国merck公司)、水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

二、方法

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为菲罗门gemininx-c18(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸溶液为流动相b，按表1梯度洗脱程序中规定进行梯度洗脱；柱温25℃，检测波长为232nm。理论板数按薏苡素峰计算应不低于2000。精密称薏苡素对照品适量，加甲醇制成每1ml含薏苡素55μg的溶液，即得对照品溶液。取野六谷药材粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果：如图4所示，供试品溶液和对照品溶液色谱图相应的位置上，有保留时间相同的色谱峰，而阴性对照液色谱图则无此色谱峰。

1>线性关系考察

取薏苡素对照品适量，加甲醇制成0.184mg/ml的溶液。分别精密吸取以上对照品溶液0.1、1、2、4、6、10ml置10ml量瓶中，各加甲醇定容至10ml，摇匀。分别精密吸取上述供试品溶液各10μl，注入hplc，以薏苡素峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。得到薏苡素的回归方程：y＝3627016.9x-38601.8，r＝0.9997，薏苡素对照品进样量在0.0184～1.840ug范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2>精密度试验

取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样测定6次。结果：6次测定薏苡素峰面积的rsd＝0.30％。表明仪器精密度良好。

3>重复性试验

取同一样品粉末6份，每份1g，精密称定，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果：6份供试品溶液中薏苡素含量的rsd为0.74％。表明本方法重现性良好。

4>稳定性试验

取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0、2、4、6、12、24h进样测定。结果：6次测得的薏苡素含量rsd为0.01％。表明供试品溶液中的薏苡素在24h之内稳定性良好。

5>加样回收率试验

取己知含量同一样品粉末6份，各0.5g，精密称定，精密加入薏苡素对照品溶液(16.00μg/ml)20ml，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定薏苡素含量，计算平均回收率及rsd。结果：测定薏苡素含量平均回收率为97.87％，rsd＝0.02％。

三、样品测定

参照《中国药典》2015版一部通则0512高效液相色谱法，按照上述方法对12批次药材样品进行测定，结果见表3。

表3样品含量测定结果(n＝2)

结果表明：10批样品薏苡素含量为0.0060％～0.1489％，平均含量为0.046％。根据10批样品的测定结果，考虑到药材来源差异情况，拟定本品标准按干燥品计算含薏苡素(c8h7no3)不得少于0.010％。