一种可变色聚丙烯酰胺凝胶及包含其的试剂盒的制作方法

[0001]
本发明属于电泳技术领域，具体涉及到一种可变色聚丙烯酰胺凝胶试剂盒。


背景技术：

[0002]
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresls，简称page)是目前蛋白实验，中最为广泛和最为基础的实验，它包括非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (native-page)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。传统的page是丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺在过硫酸铵(aps)的催化作用下，以四甲基乙二胺(temed)为加速剂聚合而成，在聚合过程中，temed催化过硫酸铵产生自由基，自由基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，进而形成三维网状结构，制成丙烯酰胺凝胶。
[0003]
传统的丙烯酰胺凝胶存在以下缺点，temed有挥发性易燃，有腐蚀性，而且具有强神经毒性以及刺激气味；浓缩胶无色，上样时容易将样品加到样品孔外进而造成样品间污染，影响蛋白分离后的鉴定结果；无法判断分离胶和浓缩胶是否凝固，一般等待30min-1h，浪费大量时间；若减少等待时间容易因为分离胶和浓缩胶没有完全凝固导致制胶失败；制胶过程复杂，需要混合多种溶液，制胶过程费时耗力，降低实验效率。综上所述，对于传统的聚丙烯酰胺凝胶急需一种更加安全、高效的快速聚丙烯酰胺凝胶配置试剂盒。


技术实现要素：

[0004]
发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种可变色的聚丙烯酰胺凝胶及包含其的试剂盒。
[0005]
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0006]
一种彩色聚丙烯酰胺凝胶，其包含分离胶和浓缩胶，其中，所述分离胶包含6-15％聚丙烯酰胺、0.375m tris-hcl、0.1％sds、10％过硫酸铵、0.1％四乙基乙二胺、 0.002％～0.01％的着色剂；所述浓缩胶包含5％聚丙烯酰胺、0.25m tris-hcl、0.1％sds、 0.1％过硫酸铵、0.1％四乙基乙二胺和0.02％～0.1％的着色剂。
[0007]
具体地，所述聚丙烯酰胺由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按质量比为29:1聚合而成。
[0008]
所述分离胶的ph值为8.8，所述浓缩胶的ph值为6.8。
[0009]
具体地，所述着色剂为经过处理的direct red 80，其中，所述direct red 80进行如下处理：
[0010]
(1)取粉末direct red 80，超纯水溶解后，离心获取上层溶液；
[0011]
(2)依次经过活性炭吸附和明胶吸附，离心获取上清溶液；
[0012]
(3)上清液经过冷冻干燥后得到的固体即为最终所需的着色剂。
[0013]
本发明同时提出了上述的彩色聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0014]
(1)准备储备液：所述储备液包括30％acr-bis、4
×
上层胶缓冲液、4
×
下层胶缓冲液和过硫酸铵溶液；
[0015]
(2)配置聚丙烯酰胺分离胶：取配方量的30％acr-bis、0.1％sds、0.375m tris-hcl、 0.1％四乙基乙二胺和0.002％～0.01％的着色剂充分混匀后，加入过硫酸铵，充分混匀，然后迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上；
[0016]
(3)配置聚丙烯酰胺浓缩胶：取配方量的30％acr-bis、0.25m tris-hcl、0.1％sds、 0.1％四乙基乙二胺和0.02％～0.1％的着色剂，充分混匀，加入过硫酸铵，充分混匀，待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤，然后将配置好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套梳子，避免气泡，待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔。
[0017]
本发明进一步提出了一种彩色聚丙烯酰胺凝胶试剂盒，所述试剂盒由30％acr-bis、 4
×
上层胶缓冲液、4
×
下层胶缓冲液、过硫酸铵组成，其中，所述4
×
上层胶缓冲液由 0.25m tris-hcl、0.1％sds、0.1％四乙基乙二胺和0.02％～0.1％的着色剂组成，所述4
ꢀ×
下层胶缓冲液由0.375m tris-hcl、0.1％sds、0.1％四乙基乙二胺和0.002％～0.01％的着色剂组成。
[0018]
其中，所述着色剂为经过处理的direct red 80，其中，direct red 80进行如下处理：
[0019]
(1)取粉末direct red 80，超纯水溶解后，离心获取上层溶液；
[0020]
(2)依次经过活性炭吸附和明胶吸附，离心获取上清溶液；
[0021]
(3)上清液经过冷冻干燥后得到的固体即为最终所需的着色剂。
[0022]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0023]
(1)加速剂先预混在4
×
上层胶缓冲液和4
×
下层胶缓冲液中，减少加速剂毒性的设计保证了实验人员不受到挥发性有毒化合物的伤害；
[0024]
(2)着色剂直接添加在4
×
上层胶缓冲液和4
×
下层胶缓冲液中，方便使用者判断浓缩胶和分离胶是否凝固和上样，并且不影响蛋白分离效果；
[0025]
(3)预先将制胶试剂混合，加快制胶流程，提高实验效率。
附图说明
[0026]
图1为实施例3制备的10％彩色聚丙烯酰胺凝胶，上层为覆盖的醇或者水，下层为浅红色的分离胶(未凝固)；
[0027]
图2a为实施例3制备的10％彩色聚丙烯酰胺凝胶，上层为红色的浓缩胶(未凝固)，下层为无色的分离胶(凝固)；
[0028]
图2b为实施例3制备的10％彩色聚丙烯酰胺凝胶，上层为粉红色的浓缩胶(凝固)，下层为无色的分离胶(凝固)；
[0029]
图3为实施例3制备的10％彩色聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品；
[0030]
图4为对比实施例1制备的10％聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品；
[0031]
图5为实施例1制备的6％彩色聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品；
[0032]
图6为实施例2制备的8％彩色聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品；
[0033]
图7为实施例4制备的12％彩色聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品；
[0034]
图8为实施例5制备的15％彩色聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品。
具体实施方式
[0035]
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0036]
实施例所用marker为江苏凯基生物技术股份有限公司的预染彩色蛋白分子量 marker，货号kgm471；蛋白样品为牛血清白蛋白(bsa)。
[0037]
根据不同蛋白样品所需最佳分离范围不同，实验人员一般会选择不同浓度的凝胶来达到实验要求，本发明能在6％～15％的浓度范围内都能配制出凝胶。
[0038]
实施例1 6％彩色聚丙烯酰胺凝胶配置。
[0039]
1.各混合储备液组分：
[0040]
1)30％acr-bis：100ml，取丙烯酰胺29克，甲叉双丙烯酰胺1克，加水溶解后定容至100ml混匀；
[0041]
2)4
×
上层胶缓冲液：30ml，1m tris-hcl、0.4％sds、0.1％四乙基乙二胺和 0.02％～0.1％着色剂组成，ph 6.8；
[0042]
3)4
×
下层胶缓冲液：30ml，1.5m tris-hcl、0.4％sds、0.4％四乙基乙二胺和 0.002％～0.01％着色剂组成，ph 8.8；
[0043]
4)过硫酸铵：10％，去过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。
[0044]
2.6％彩色聚丙烯酰胺分离胶配置方法
[0045]
取蒸馏水2.7ml，30％acr-bis 1.0ml，4
×
下层胶缓冲液1.25ml充分混匀后，加入10％过硫酸铵50ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入水覆盖于分离胶之上。
[0046]
3.5％聚丙烯酰胺浓缩胶配置方法
[0047]
取蒸馏水1.17ml，30％acr-bis 0.33ml，4
×
上层胶缓冲液0.5ml充分混匀后，加入 10％过硫酸铵0.02ml，充分混匀，待分离胶由浅红色变为无色后，倒出覆盖层液体，然后将配置好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套树子，避免气泡，待浓缩胶由红色变为粉红色后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行sds-page电泳实验。
[0048]
图5为实施例1制备的6％彩色聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品。
[0049]
实施例2 8％彩色聚丙烯酰胺凝胶配置。
[0050]
1、各混合储备液组分：
[0051]
1)30％acr-bis：100ml，取丙烯酰胺29克，甲叉双丙烯酰胺1克，加水溶解后定容至100ml混匀；
[0052]
2)4
×
上层胶缓冲液：30ml，1m tris-hcl、0.4％sds、0.1％四乙基乙二胺和 0.02％～0.1％着色剂组成，ph 6.8；
[0053]
3)4
×
下层胶缓冲液：30ml，1.5m tris-hcl、0.4％sds、0.4％四乙基乙二胺和0.002％～0.01％着色剂组成，ph 8.8；
[0054]
4)过硫酸铵：10％，去过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。
[0055]
2、8％彩色聚丙烯酰胺分离胶配置方法
[0056]
取蒸馏水2.4ml，30％acr-bis 1.3ml，4
×
下层胶缓冲液1.25ml充分混匀后，加入 10％过硫酸铵50ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入水覆盖于分离胶之上。
[0057]
3、5％聚丙烯酰胺浓缩胶配置方法
[0058]
取蒸馏水1.17ml，30％acr-bis 0.33ml，4
×
上层胶缓冲液0.5ml充分混匀后，加入 10％过硫酸铵0.02ml，充分混匀，待分离胶由浅红色变为无色后，倒出覆盖层液体，然后将配置好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套树子，避免气泡，待浓缩胶由红色变为粉红色后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行sds-page电泳实验。
[0059]
图6为实施例2制备的8％彩色聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品。
[0060]
实施例3 10％彩色聚丙烯酰胺凝胶配置。
[0061]
1.各混合储备液组分：
[0062]
1)30％acr-bis：100ml，取丙烯酰胺29克，甲叉双丙烯酰胺1克，加水溶解后定容至100ml混匀；
[0063]
2)4
×
上层胶缓冲液：30ml，1m tris-hcl、0.4％sds、0.1％四乙基乙二胺和 0.02％～0.1％着色剂组成，ph 6.8
[0064]
3)4
×
下层胶缓冲液：30ml，1.5m tris-hcl、0.4％sds、0.4％四乙基乙二胺和 0.002％～0.01％着色剂组成，ph 8.8
[0065]
4)过硫酸铵：10％，去过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。
[0066]
2.10％彩色聚丙烯酰胺分离胶配置方法
[0067]
取蒸馏水2.0ml，30％acr-bis 1.7ml，4
×
下层胶缓冲液1.25ml充分混匀后，加入10％过硫酸铵50ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入水覆盖于分离胶之上。
[0068]
3.5％聚丙烯酰胺浓缩胶配置方法
[0069]
取蒸馏水1.17ml，30％acr-bis 0.33ml，4
×
上层胶缓冲液0.5ml充分混匀后，加入 10％过硫酸铵0.02ml，充分混匀，待分离胶由浅红色变为无色，倒出覆盖层液体，然后将配置好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套树子，避免气泡，待浓缩胶由红色变为粉红色，拔出梳子，形成加样孔，即可进行sds-page电泳实验。
[0070]
图1为实施例6制备的10％彩色聚丙烯酰胺凝胶，上层为覆盖的醇或者水，下层为浅红色的分离胶(未凝固)；
[0071]
图2a为实施例6制备的10％彩色聚丙烯酰胺凝胶，上层为红色的浓缩胶(未凝固)，下层为无色的分离胶(凝固)；
[0072]
图2b为实施例6制备的10％彩色聚丙烯酰胺凝胶，上层为红色的浓缩胶(凝固)，下层为无色的分离胶(凝固)。
[0073]
因此，从分离胶和浓缩胶颜色的变化可以直接判断是否凝固以及何时应该加样。
[0074]
实施例4 12％彩色聚丙烯酰胺凝胶配置。
[0075]
1.各混合储备液组分：
[0076]
1)30％acr-bis：100ml，取丙烯酰胺29克，甲叉双丙烯酰胺1克，加水溶解后定容至100ml混匀；
[0077]
2)4
×
上层胶缓冲液：30ml，1m tris-hcl、0.4％sds、0.1％四乙基乙二胺和0.02％～0.1％着色剂组成，ph 6.8；
[0078]
3)4
×
下层胶缓冲液：30ml，1.5m tris-hcl、0.4％sds、0.4％四乙基乙二胺和 0.002％～0.01％着色剂组成，ph 8.8；
[0079]
4)过硫酸铵：10％，去过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。
[0080]
2.12％彩色聚丙烯酰胺分离胶配置方法
[0081]
取蒸馏水1.7ml，30％acr-bis 2.0ml，4
×
下层胶缓冲液1.25ml充分混匀后，加入10％过硫酸铵50ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入水覆盖于分离胶之上。
[0082]
3.5％聚丙烯酰胺浓缩胶配置方法
[0083]
取蒸馏水1.17ml，30％acr-bis 0.33ml，4
×
上层胶缓冲液0.5ml充分混匀后，加入 10％过硫酸铵0.02ml，充分混匀，待分离胶有浅红色变为无色后，倒出覆盖层液体，然后将配置好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套树子，避免气泡，待浓缩胶由红色变为粉红色后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行sds-page电泳实验。
[0084]
图7为实施例4制备的12％彩色聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品。
[0085]
实施例5 15％彩色聚丙烯酰胺凝胶配置。
[0086]
1.各混合储备液组分：
[0087]
1)30％acr-bis：100ml，取丙烯酰胺29克，甲叉双丙烯酰胺1克，加水溶解后定容至100ml混匀；
[0088]
2)4
×
上层胶缓冲液：30ml，1m tris-hcl、0.4％sds、0.1％四乙基乙二胺和 0.02％～0.1％着色剂组成，ph 6.8
[0089]
3)4
×
下层胶缓冲液：30ml，1.5m tris-hcl、0.4％sds、0.4％四乙基乙二胺和 0.002％～0.01％着色剂组成，ph 8.8
[0090]
4)过硫酸铵：10％，去过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。
[0091]
2.15％彩色聚丙烯酰胺分离胶配置方法
[0092]
取蒸馏水1.2ml，30％acr-bis 2.5ml，4
×
下层胶缓冲液1.25ml充分混匀后，加入10％过硫酸铵50ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入水覆盖于分离胶之上。
[0093]
3.5％聚丙烯酰胺浓缩胶配置方法
[0094]
取蒸馏水1.17ml，30％acr-bis 0.33ml，4
×
上层胶缓冲液0.5ml充分混匀后，加入 10％过硫酸铵0.02ml，充分混匀，待分离胶由浅红色变为无色后，倒出覆盖层液体，然后将配置好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套树子，避免气泡，待浓缩胶由红色变为粉红色后后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行sds-page电泳实验。
[0095]
图8为实施例5制备的15％彩色聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品。
[0096]
实施例6 10％彩色非变性聚丙烯酰胺凝胶配置。
[0097]
1.各混合储备液组分：
[0098]
1)30％acr-bis：100ml，取丙烯酰胺29克，甲叉双丙烯酰胺1克，加水溶解后定容至100ml混匀；
[0099]
2)4
×
上层胶缓冲液：30ml，1m tris-hcl、0.1％四乙基乙二胺和0.02～0.1％着色
剂组成，ph 6.8
[0100]
3)4
×
下层胶缓冲液：30ml，1.5m tris-hcl、0.4％四乙基乙二胺和0.002～0.01％着色剂组成，ph 8.8
[0101]
4)过硫酸铵：10％，去过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。
[0102]
2.10％彩色非变性聚丙烯酰胺分离胶配置方法
[0103]
取蒸馏水2.0ml，30％acr-bis 1.7ml，4
×
下层胶缓冲液1.25ml充分混匀后，加入10％过硫酸铵50ul，充分混匀，迅速注入两玻璃板间隙中，再加入水覆盖于分离胶之上。
[0104]
3.5％聚丙烯酰胺浓缩胶配置方法
[0105]
取蒸馏水1.17ml，30％acr-bis 0.33ml，4
×
上层胶缓冲液0.5ml充分混匀后，加入 10％过硫酸铵0.02ml，充分混匀，待分离胶由浅红色变为无色后，倒出覆盖层液体，然后将配置好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套树子，避免气泡，待浓缩胶由红色变为粉红色后后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行下一步聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
[0106]
基于6％～15％其他浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶是溶液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的浓度决定的，所以这个浓度范围的非变性聚丙烯酰胺凝胶按照本发明的配方都可以实现，其具体步骤一样。
[0107]
对比实施例1 10％聚丙烯酰胺凝胶配置。
[0108]
1.各混合储备液组分：
[0109]
1)30％acr-bis：100ml，取丙烯酰胺29.2克，甲叉双丙烯酰胺0.8克，加水溶解后定容至100ml混匀；
[0110]
2)2mtris-hcl缓冲液：100ml，取tris 24.2228克，加适量水溶解，用hcl调ph 至8.8，定容至100ml混匀。
[0111]
3)1mtris-hcl缓冲液：50ml，取tris 6.057克，加适量水溶解，用hcl调ph至 6.8，定容至50ml混匀。
[0112]
4)10％sds：5ml，取sds 0.5克，加水溶解，定容至5ml。
[0113]
4)过硫酸铵：10％，取过硫酸铵0.1克，加1ml水溶解混匀。
[0114]
2.10％聚丙烯酰胺分离胶配置方法
[0115]
取蒸馏水2.2ml，30％acr-bis 1.7ml，2m tris-hcl缓冲液1ml，10％sds 50ul充分混匀后，加入10％过硫酸铵50ul，充分混匀，再加入temed 2ul充分混匀迅速注入两玻璃板间隙中，再加入醇或水覆盖于分离胶之上。
[0116]
3.5％聚丙烯酰胺浓缩胶配置方法
[0117]
取蒸馏水1.4ml，30％acr-bis 0.33ml，1m tris-hcl缓冲液250ul，10％sds 50ul 充分混匀后，加入10％过硫酸铵20ul，充分混匀，再加入temed 2ul待分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，然后将配置好的浓缩胶灌注在分离胶上，立即插入干净的配套树子，避免气泡，待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔，即可进行下一步聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
[0118]
图4为对比实施例1制备的10％聚丙烯酰胺凝胶加入marker和蛋白样品电泳后的图，泳道1为marker，泳道2为蛋白样品。从图3和图4的marker和蛋白样品的分离效果来看，本发明所制备的聚丙烯酰胺凝胶与传统的聚丙烯酰胺凝胶分离效果基本相同。
[0119]
本发明的分离胶含有0.002％～0.01％的着色剂，使分离胶在凝固前后的颜色发生变化，便于判断分离胶的凝固程度便于及时配置浓缩胶，且不影响蛋白的分离效果；浓缩
胶含有0.02％～0.1％的着色剂，使浓缩胶在凝固前后的颜色发生变化，便于判断浓缩胶的凝固程度，同时也方便使用者上样且不影响蛋白的分离效果。
[0120]
本发明提供了一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。