专利名称：一种牛血清白蛋白提取方法
技术领域：
本发明涉及白蛋白的制备方法，具体涉及一种牛血清白蛋白提取方法。
背景技术：
牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66. 430 kDa，等电点为4. 7，是生物学诸多学科及医、药学各领域广泛应用的生化试剂，也可用作医药保健食品、调味品。牛血清白蛋白最常用的制备方法是以牛血为原料分离出血清，用硫酸铵分级沉淀后，经辛酸处理精制而得；中国专利文献CN 1544470C公开了一种牛血清白蛋白热乙醇法提取工艺，其方法是采用3. 8%枸橼酸钠抗凝血得到血浆，加热加入辛酸钠，调pH值后加乙醇，再经过滤、脱盐、浓缩、冻干后得牛血清白蛋白。上述牛血清白蛋白制备方法中需要添加许多成本较高的盐类(如枸橼酸钠、辛酸钠等)及有机化学物质(乙醇溶剂等)，制备出白蛋白的纯度难以保证，而且生产工艺较复杂，难以进行大批量生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种纯度高、工艺流程简单、成本低的牛血清白蛋白提取方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是 一种牛血清白蛋白提取方法，包括以下步骤
(1)取新鲜的牛血，离心分离后取上清液，加入与上清液等体积的无菌无热原去离子水，再按上清液体积的1/4 3/4加入60 70°C的0. 024M软脂酸钠溶液，混勻后静置50 100 min ；
(2)向上步所得溶液中加稀盐酸，调节溶液pH至4.0 6. 5，60 70°C下水浴1 2h,过滤得滤液；
(3)按上清体积的40%向上步所得滤液中加入3mol/L HC1，混勻后再加入氯化钠，使其在溶液中的质量浓度达到4%，0 4°C下放置30 60min ；
(4)静置后过滤得沉淀，按上清体积的4 6%向沉淀中加入无菌无热原去离子水，加稀碱溶液，调溶液pH至9. 0 10. 0 ；
(5)待沉淀完全溶解后，再加稀盐酸调溶液pH至8.0 9. 0，在无菌无热原去离子水中透析10 16h ；
(6)透析液放入冻干机中，45 50小时后取出，得蛋白粉。在所述步骤(1)中，离心分离的转速为观00 3200r/m，时间为10 20 min。在所述步骤(2)、(5)中，所用稀盐酸的浓度为lmol/L。在所述步骤(4)中，所用稀碱溶液为lmol/L NaOH溶液。本发明具有积极有益的效果
1.纯度高、质量好，易于保存，在生产过程中只加少量保护剂，不含其它盐类及化学物质，因而保证了成品的纯度，产品可室温下保存。2.常规方法中提取白蛋白采用3. 8%枸橼酸钠抗凝血得到血浆，而本发明采用血清，避免加入枸橼酸钠，一方面节约成本，另外减少化学原料的参入，提高了白蛋白的纯度； 常规提取白蛋白的辛酸法，辛酸的价格远高于软脂酸，同时软脂酸为十六烷酸，较辛酸结合白蛋白的能力强，保护白蛋白的作用相应也提高。3.本发明用料少，工艺流程短，操作简单，适合批量生产，生产效率比冷盐析法(耗时需5天)提高了 5倍；收率高，一般在1. 8 2. 0 % ；软脂酸的价格远低于辛酸，因此生产成本大大降低，如与冷盐析法相比，成本低50%。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所用的原料及设备，如无特别说明，均为市售。实施例1 一种牛血清白蛋白提取方法，包括以下步骤
取新鲜的牛血，3000r/m离心lOmin，取上清液，_20°C冻存备用。取充分融化后的牛血清30ml，加去离子水30ml，充分搅勻，再加入70°C的0. 024M软脂酸钠溶液20ml，放置 75min。测得混合溶液的pH为8. 76，加IM HCl 1. 6ml，使pH至5. 16，水浴1.釙(温度从 65°C升至70°C)。用单层普通滤纸进行过滤，得滤液60ml，加3M HCl 12ml,NaCl 2. 88g，4°C 放置30min，使用双层过滤，将沉淀加水1. 7ml，搅成糊状，加IM NaOH 3. 5ml，pH至9. 98，再加IM HCl 0. Ilml至pH8. 45，在去离子水中透析12h。将透析液13. 5ml，放入冻干机中，48 小时后取出，得蛋白粉。实施例2 —种牛血清白蛋白提取方法，包括以下步骤 取新鲜的牛血，3000r/m离心lOmin，取上清，_20°C冻存备用。取充分融化后的牛血清30ml，加去离子水30ml，充分搅勻，再加入70°C的0. 024M 软脂酸钠溶液20ml，放置75min。测得混合溶液的pH为8. 78，加IM HCl 1. 7ml，使pH至 5. 17，水浴1. (温度从65°C升至70°C)。用单层滤纸进行过滤，得滤液60ml，加3M HCl 12ml,NaCl 2. 88g，4°C放置30min，使用双层过滤，将沉淀加水1. 5ml，搅成糊状，加IM NaOH 3. 0ml，pH至10. 04，再加IM HCl 0. 20ml至pH8. 51，在去离子水中透析12h。将透析液 12. 5ml，放入冻干机中，48小时后取出，得蛋白粉。上述实施例1、2中所制得的牛血清白蛋白的主要性能指标如下
①外观灰白色疏松固体，无融化现象；复溶后为淡黄色澄明液体，无浑浊；
②得率(冻干粉质量/原血清中的蛋白总量χ100 %) > 26. 0% ；
③含水量(真空减压干燥法)<0. 3% ；
④PH值(生理氯化钠溶液将供试品蛋白质含量稀释成10g/L):7. 3 7. 4 ；
⑤水溶性(向无菌去离子水中加入蛋白制品，超声30min，在25°C恒温箱中水平振荡 24h,如无沉淀，再加入蛋白样品，如此反复，直至不能溶解，取上清，测蛋白含量)> 8% ；
⑥纯度(白蛋白的浓度/总蛋白的浓度X100 %) > 95. 0%。
权利要求
1.一种牛血清白蛋白提取方法，包括以下步骤(1)取新鲜的牛血，离心分离后取上清，加入与该上清等体积的无菌无热原去离子水， 再按所述上清体积的1/4 3/4加入60 70°C的0. 024M软脂酸钠溶液，混勻后静置50 IOOmin ；(2)向上步所得溶液中加稀盐酸，调节溶液pH至4.0 6. 5，60 70°C下水浴1 2h,过滤得滤液；(3)按所述上清体积的40%向上步所得滤液中加入3M HC1，混勻后再加入氯化钠，使其在溶液中的质量浓度达到4%，0 4°C下放置30 60min ；(4)静置后过滤得沉淀，按所述上清体积的4 6%向沉淀中加入无菌无热原去离子水， 加稀碱溶液，调溶液pH至9. 0 10. 0 ；(5)待沉淀完全溶解后，再加稀盐酸调溶液pH至8.0 9. 0，在无菌无热原去离子水中透析10 16h ；(6 )透析液放入冻干机中，45 50h后取出，得蛋白粉。
2.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，离心分离的转速为观00 3200r/m，时间为10 20 min。
3.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，在所述步骤(2)、(5) 中，所用稀盐酸的浓度为lmol/L。
4.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所用稀碱溶液为lmol/L NaOH溶液。
全文摘要
本发明涉及一种牛血清白蛋白提取方法。旨在解决牛血清白蛋白的生产工艺较复杂、纯度不高且生产成本高难以进行大批量生产的技术难题。本发明通过向分离血清中添加入适量软脂酸钠静置，调节溶液pH后水浴加热1～2h，过滤后向滤液中依次加3MHCl、氯化钠，4℃放置，过滤得沉淀，向沉淀中加入适量水，并调pH使沉淀溶解，再调溶液pH至8.0～9.0，透析后冻干即得。本发明工艺用料少，工艺流程短，操作简单，生产效率高，适合批量生产，所得产品纯度高、质量好，易于保存。
文档编号C07K14/765GK102241767SQ20111016847
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者丁利静, 何美霞, 华海婴, 崔西国, 张勇, 张红梅, 张黎蓉, 李志刚, 王芳, 贺石林, 高元法 申请人:河南省医药科学研究院