一种快速采集牛膝多糖核磁共振碳谱的分析方法与流程

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本发明属于分析测试实验技术领域，具体涉及一种快速采集牛膝多糖核磁共振碳谱的分析方法。


背景技术：

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牛膝是一种常见的中药，又名百倍、怀牛膝、鸡胶骨，属苋科，是多年生草本植物，它主要分布于我国四川、河南、河北及山东等地。牛膝多糖是一种生物活性多糖，一般从中药牛膝的根部提取纯化得到，是牛膝中一种含量丰富的活性成分。牛膝多糖作为一种重要的多糖药物具有显著的抗癌、抗炎、抗病毒、抗衰老等功能。牛膝多糖为禾本科型果聚糖，化学组成中主要包含葡萄糖、甘露糖、果糖等多个单糖组分。它通常包含下图中的结构单元，分子量较大，一般在几千甚至在几万以上。
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碳原子构成了有机化合物的骨架，核磁共振碳谱对于未知物的结构确证和推导的功效不言而喻。核磁共振碳谱测定的是
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c核，而在自然界中
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c核同位素丰度只有1％，这是核磁碳谱采集不易的主要原因。牛膝多糖本身分子量较大特点及在常见溶剂中溶解度有限等局限性，使得用常规方法采集牛膝多糖核磁共振碳谱困难重重，甚至可能花费了很长的机时都得不到碳谱信号。因此，开发一种简单易行的牛膝多糖核磁共振碳谱分析方法对其结构表征和药理临床应用研究具有积极意义。
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技术实现要素：

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本发明目的在于提供一种快速采集牛膝多糖核磁共振碳谱的分析方法。本发明方法能实现生物活性大分子牛膝多糖碳谱的快速测定，进而为对牛膝多糖进行更加详细的结构表征提供条件。具体包括以下步骤：
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(1)测试样品溶液制备：
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称取40～80mg牛膝多糖于5.0ml离心管中，然后加入1.0ml氘代试剂和10～30μl助溶剂，将所述离心管置于超声仪中超声处理5min以上，超声功率为120w，得到测试样品溶液；将测试样品溶液转移至核磁管中并密封，待上机测试用；
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所述氘代试剂为氘代甲醇、氘代二甲基亚砜或氘代水；
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所述助溶剂为氘代盐酸、氘代乙酸、氘代三氟乙酸、氘代氢氧化钠或氘代氢氧化钾溶液；
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(2)样品上机测试：
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将装有测试样品溶液的核磁管用无尘纸擦拭干净后放入布鲁克500m核磁共振波谱仪中，设置采样温度为20～50℃，采样时间为60min以上；采样结束后保存谱图。
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优选的，步骤(2)后还包括步骤(3)特征峰信噪比的计算：通过软件计算牛膝多糖核磁共振碳谱特征峰的信噪比。
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优选的，步骤(1)中，称取50～65mg牛膝多糖于5.0ml离心管中。
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优选的，步骤(1)中，超声处理的时间为5～10min。
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优选的，步骤(1)中，称取50mg牛膝多糖于5.0ml离心管中，然后加入1.0ml氘代水和10μl氘代盐酸。
[0016]
优选的，步骤(1)中，称取50mg牛膝多糖于5.0ml离心管中，然后加入1.0ml氘代水和15μl氘代乙酸。
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优选的，步骤(1)中，称取50mg牛膝多糖于5.0ml离心管中，然后加入1.0ml氘代水和15μl氘代氢氧化钠。
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优选的，步骤(1)中，称取50mg牛膝多糖于5.0ml离心管中，然后加入1.0ml氘代水和20μl氘代三氟乙酸。
[0019]
优选的，步骤(1)中，称取50mg牛膝多糖于5.0ml离心管中，然后加入1.0ml氘代水和20μl氘代乙酸。
[0020]
优选的，步骤(2)中，采样温度为25～35℃。
[0021]
优选的，步骤(2)中，采样时间为60～300min。
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与现有技术相比，本发明的有益效果是：
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本发明从测试样品的质量、氘代试剂及助溶剂的筛选、超声处理时间、采样温度和采集时间等多个方面优化了牛膝多糖碳谱的检测条件。本发明通过在测试样品中添加助溶剂，尤其是以氘代乙酸、氘代三氟乙酸为助溶剂时显著提高了测试溶液中牛膝多糖浓度，可在相对短的时间内获得清晰的信噪比较高的牛膝多糖样品的核磁共振碳谱图。本发明方法具有实验材料易得、操作简便等特点，同时充分提高了仪器测试效率，为牛膝多糖分子的结构表征和确证、进一步研究其潜在的药用价值提供了基础条件。
附图说明
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图1为实施例1测试得到的核磁共振碳谱；
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图2为实施例2测试得到的核磁共振碳谱；
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图3为实施例3测试得到的核磁共振碳谱；
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图4为实施例4测试得到的核磁共振碳谱；
[0028]
图5为实施例5测试得到的核磁共振碳谱；
[0029]
图6为实施例6测试得到的核磁共振碳谱；
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图7为实施例7测试得到的核磁共振碳谱；
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图8为实施例8测试得到的核磁共振碳谱；
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图9为实施例9测试得到的核磁共振碳谱。
具体实施方式
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为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施实例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
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实施例1
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准确称取纯化后的牛膝多糖样品50.0mg于5.0ml离心管中，加入氘代水1.0ml，将离心管置于超声仪中超声处理5min，超声功率为120w，得到测试样品溶液；用滴管将测试样品溶液转移至核磁管并密封。用无尘纸将核磁管擦拭干净后放入布鲁克500m核磁共振波谱仪，设置采样温度为25℃，采样时间为60min，采样结束后保存谱图。测试得到的核磁共振碳谱见图1，在图1中未见明显的
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c核磁共振信号。
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实施例2
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准确称取纯化后的多糖样品20.0mg于5.0ml离心管中，加入氘代水1.0ml，将离心管置于超声仪中超声处理5min，超声功率为120w，得到测试样品溶液；用滴管将测试样品溶液转移至核磁管并密封。用无尘纸将核磁管擦拭干净后放入布鲁克500m核磁共振波谱仪，设置采样温度为25℃，采样时间为400min，采样结束后保存谱图。测试得到的核磁共振碳谱见图2，在图2中未见明显的
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c核磁共振信号。
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实施例3
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准确称取纯化后的多糖样品40.0mg于5.0ml离心管中，加入氘代水1.0ml助溶剂氘代盐酸10μl，将离心管置于超声仪中超声处理5min，超声功率为120w，得到测试样品溶液；用滴管将测试样品溶液转移至核磁管并密封。用无尘纸将核磁管擦拭干净后放入布鲁克500m核磁共振波谱仪，设置采样温度为25℃，采样时间为300min，采样结束后保存谱图。测试得到的核磁共振碳谱见图3，通过软件计算得到牛膝多糖碳谱化学位移为73.29的特征峰的信噪比为5.01。
[0040]
实施例4
[0041]
准确称取纯化后的多糖样品90.0mg于5.0ml离心管中，加入氘代水1.0ml助溶剂氘代盐酸5μl，将离心管置于超声仪中超声处理5min，超声功率为120w，得到测试样品溶液；用滴管将测试样品溶液转移至核磁管并密封。用无尘纸将核磁管擦拭干净后放入布鲁克500m核磁共振波谱仪，设置采样温度为25℃，采样时间为300min，采样结束后保存谱图。测试得到的核磁共振碳谱见图4，在图4中未见明显的
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c核磁共振信号。
[0042]
实施例5
[0043]
准确称取纯化后的牛膝多糖样品50.0mg于5.0ml离心管中，加入氘代水1.0ml和助溶剂氘代盐酸10μl，将离心管置于超声仪中超声处理5min，超声功率为120w，得到测试样品溶液；用滴管将测试样品溶液转移至核磁管并密封。用无尘纸将核磁管擦拭干净后放入布鲁克500m核磁共振波谱仪，设置采样温度为25℃，采样时间为300min，采样结束后保存谱
图。测试得到的核磁共振碳谱见图5，通过软件计算得到牛膝多糖碳谱化学位移为73.29的特征峰的信噪比为10.40。
[0044]
实施例6
[0045]
准确称取纯化后的牛膝多糖样品50.0mg于5.0ml离心管中，加入氘代水1.0ml和助溶剂氘代乙酸15μl，将离心管置于超声仪中超声处理5min，超声功率为120w，得到测试样品溶液；用滴管将测试样品溶液转移至核磁管并密封。用无尘纸将核磁管擦拭干净后放入布鲁克500m核磁共振波谱仪，设置采样温度为25℃，采样时间为300min，采样结束后保存谱图。测试得到的核磁共振碳谱见图6，通过软件计算得到牛膝多糖碳谱化学位移为73.29的特征峰的信噪比为16.18。
[0046]
实施例7
[0047]
准确称取纯化后的牛膝多糖样品50.0mg于5.0ml离心管中，加入氘代水1.0ml和助溶剂氘代三氟乙酸5μl，将离心管置于超声仪中超声处理5min，超声功率为120w，得到测试样品溶液；用滴管将测试样品溶液转移至核磁管并密封。用无尘纸将核磁管擦拭干净后放入布鲁克500m核磁共振波谱仪，设置采样温度为25℃，采样时间为300min，采样结束后保存谱图。测试得到的核磁共振碳谱见图7，通过软件计算得到牛膝多糖碳谱化学位移为73.28的特征峰的信噪比为20.57。
[0048]
实施例8
[0049]
准确称取纯化后的牛膝多糖样品50.0mg于5.0ml离心管中，加入氘代水1.0ml和助溶剂氘代三氟乙酸20μl，将离心管置于超声仪中超声处理5min，超声功率为120w，得到测试样品溶液；用滴管将测试样品溶液转移至核磁管并密封。用无尘纸将核磁管擦拭干净后放入布鲁克500m核磁共振波谱仪，设置采样温度为30℃，采样时间为60min，采样结束后保存谱图。测试得到的核磁共振碳谱见图8，通过软件计算得到牛膝多糖碳谱化学位移为73.28的特征峰的信噪比为40.62。
[0050]
实施例9
[0051]
准确称取纯化后的牛膝多糖样品60.0mg于5.0ml离心管中，加入氘代水1.0ml和助溶剂氘代乙酸20μl，将离心管置于超声仪中超声处理5min，超声功率为120w，得到测试样品溶液；用滴管将测试样品溶液转移至核磁管并密封。用无尘纸将核磁管擦拭干净后放入布鲁克500m核磁共振波谱仪，设置采样温度为25℃，采样时间为180min，采样结束后保存谱图。测试得到的核磁共振碳谱见图9，通过软件计算得到牛膝多糖碳谱化学位移为73.29的特征峰的信噪比为32.84。
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最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而己，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。