一种影响角质层细胞间粘附蛋白质增减的组分的筛选方法与流程

1.本发明涉及一种影响角质层细胞间粘附蛋白质增减的组分的筛选方法、以及一种适用于该筛选方法的角质层细胞样本的制备方法。


背景技术：

2.作为角质细胞(keratinocyte)的粘合连接装置，具有代表性的是桥粒。众所周知，桥粒是参与表皮细胞间及角质层细胞间粘合连接的结构物，表皮细胞间借助于桥粒的粘合连接通过与由角蛋白纤维构成的细胞骨架相配合来维持上皮组织牢固的结构。
3.已知桥粒蛋白增加是皮肤状态恶化的原因之一，如皮肤粗糙、晒伤和干燥引起的角质层脱屑等。
4.作为控制桥粒蛋白量的方法，现有技术中已经公开了相关方案，其利用蓄积于角质层中的桥粒蛋白的蛋白酶进行分解，从而改善粉刺、头皮屑、脱屑(专利文献1)。
5.已知该桥粒的组成蛋白为桥粒芯糖蛋白1、2、3、4、桥粒芯胶粘蛋白1、2、3及桥粒斑蛋白1、2等。
6.在组成该桥粒的蛋白中，特别是粘附蛋白质的桥粒芯糖蛋白1在桥粒组分的蛋白分解与细胞剥离之间具有密切的相关关系。因此，确认角质层的桥粒芯糖蛋白的存在状态也是在对桥粒功能进行评估，在评估皮肤状态方面极为重要。
7.现有技术文献
8.专利文献
9.专利文献1:日本专利特表平7
‑
505383号公报


技术实现要素：

10.[发明所要解决的问题]
[0011]
综上所述，需要探索一种减少桥粒或构成桥粒的粘附蛋白质的量的组分。
[0012]
作为筛选这种组分的方法之一，可以通过使用胶带剥离法采集角质层细胞以及向载玻片转录，从而制备角质层细胞样本，利用免疫组织染色法对粘附蛋白质进行染色，并在任意显微镜下观察。
[0013]
然而，使用胶带剥离法进行角质层细胞的转录，粘胶带的组分会残留在载玻片上，其被染色后可能无法与粘附蛋白质区分开来，因此需要清洗载玻片。
[0014]
但是，清洗载玻片后，转录的角质层细胞也会剥离，以角质层细胞中存在的粘附蛋白质的存在量为指标的评估难以进行，因此不能说是一种充分的筛选方法。
[0015]
本发明的课题在于提供一种组份的筛选方法，其中，所述组分以桥粒芯糖蛋白为主，影响存在于角质层细胞间的粘附蛋白质增减；所述方法和现有方法相比更加准确。
[0016]
另外，本发明的另一课题在于提供一种角质层细胞样本的制备方法，其中，所述角质层细胞样本用于在上述筛选方法中更准确地评估粘附蛋白质的存在量。
[0017]
[解决课题的技术手段]
[0018]
为解决所述课题，本发明提供一种影响角质层细胞间粘附蛋白质增减的组分的筛选方法，包括：
[0019]
采集工序，使用胶带剥离法，采集角质层细胞；
[0020]
转录工序，将角质层转录到表面带正电荷的载玻片上；
[0021]
清洗工序，清洗所述载玻片；
[0022]
制备工序，在所述载玻片上添加待探索组分，利用免疫组织染色法对粘附蛋白质进行染色，制备筛选样本；
[0023]
图像获取工序，拍摄所述筛选样本的任意部位，得到用于进行分析的图像；及
[0024]
评估工序，以所述用于进行分析的图像中的染色部分的面积为指标，评估所述待探索组分对于致密角质层形成的阻碍作用。
[0025]
已知细胞表面由于磷脂质的羧基(coo
‑
)而具有负电荷。
[0026]
根据本发明的筛选方法，通过将角质层细胞转录到表面带正电荷的载玻片上，可以防止角质层细胞因清洗而剥离，可以更准确地评估角质层细胞中的粘附蛋白质的存在量。
[0027]
在本发明的较佳方式中，
[0028]
在所述制备工序中，制备不添加所述待探索组分的筛选对照样本，
[0029]
所述评估工序如下：比较所述筛选样本的染色部分的面积与所述筛选对照样本的染色部分的面积，当所述筛选样本的染色部分的面积较小时，评估所述待探索组分具有减少粘附蛋白质的量的作用。
[0030]
通过采用这种方式，可以更准确地筛选影响粘附蛋白质增减的组分。
[0031]
在本发明的较佳方式中，
[0032]
在所述制备工序中，制备所述待探索组分的种类相同且浓度不同的多个筛选样本，
[0033]
所述评估工序如下：比较多个所述筛选样本的染色部分的面积，评估在减少粘附蛋白质的量的作用中的最佳浓度。
[0034]
通过采用这种方式，不仅可以筛选具有减少粘附蛋白质的量的作用的组分，而且可以评估其最佳浓度。
[0035]
在本发明的较佳方式中，所述粘附蛋白质为桥粒芯糖蛋白1(desmoglein1)。
[0036]
在本发明的较佳方式中，所述载玻片为表面排列有nh
3+
的载玻片。
[0037]
nh
3+
与细胞表面的coo
‑
形成离子键，因此可以提高角质层细胞与载玻片的粘附性。
[0038]
在本发明的较佳方式中，所述清洗工序是一种将所述载玻片浸泡在二甲苯中的工序。
[0039]
通过将载玻片浸泡在二甲苯中以进行清洗，可以更好地抑制角质层细胞的剥离。
[0040]
另外，为解决所述课题，本发明提供一种使用胶带剥离法制备角质层细胞样本的方法，包括：
[0041]
转录工序，将角质层转录到表面带正电荷的载玻片上；及
[0042]
清洗工序，清洗所述载玻片。
[0043]
通过将角质层转录到表面带正电荷的载玻片上，可以抑制角质层细胞在之后的清洗工序中从载玻片上剥离。
[0044]
在本发明的较佳方式中，所述载玻片为表面排列有nh
3+
的载玻片。
[0045]
[发明效果]
[0046]
根据本发明的筛选方法，与现有方法相比，可以更准确地筛选影响粘附蛋白质增减的组分。
[0047]
另外，根据本发明的制备角质层细胞的方法，可以抑制载玻片上角质层细胞的剥离。
附图说明
[0048]
图1是表示本实施方式的筛选方法的流程图；
[0049]
图2是表示本实施方式中的角质层细胞样本的制备工序的流程图；
[0050]
图3是表示本实施方式中的评估工序的流程图；
[0051]
图4是在角质层细胞样本中添加野生百里香提取物、刺梨提取物作为待探索组分而得到的筛选样本及筛选对照样本的显微镜图像；
[0052]
图5是表示将筛选对照样本的染色部分的面积设为100％时筛选样本的染色部分的面积比的图表；
[0053]
图6是表示实施例2中的桥粒芯糖蛋白1量的测量结果的图(代表)；
[0054]
图7是表示实施例2中的桥粒芯糖蛋白1量的测量结果的图表；
[0055]
图8是表示实施例3中的l*值的测量结果的图表；
[0056]
图9是表示实施例3中的a*值的测量结果的图表；
[0057]
图10是表示实施例3中的b*值的测量结果的图表；
[0058]
图11是表示实施例3中的硬度的测量结果的图表；
[0059]
图12是表示实施例3中的桥粒芯糖蛋白1量的测量结果的图表；
[0060]
图13是表示实施例3中的桥粒芯糖蛋白1量的测量结果的图(代表)；
[0061]
图14是表示实施例4中的桥粒芯糖蛋白1量的测量结果的图(代表)；
[0062]
图15是表示实施例4中的桥粒芯糖蛋白1量的测量结果的图表；
[0063]
图16是表示实施例4中的观察角质层细胞剥离状态的光学显微镜图像；
[0064]
图17是表示实施例5中的桥粒芯糖蛋白1量的测量结果的图(代表)；
[0065]
图18是表示实施例5中的桥粒芯糖蛋白1量的测量结果的图表(6周)；
[0066]
图19是表示实施例5中的桥粒芯糖蛋白1量的测量结果的图表(12周)。
具体实施方式
[0067]
下面参考图1～3的流程图详细说明本发明的筛选方法。
[0068]
本发明的筛选方法包括角质层细胞样本制备步骤s10、筛选样本制备步骤s20、图像获取步骤s30及评估步骤s40。
[0069]
(1)角质层细胞样本制备工序
[0070]
图2示出了详细表示步骤s10的流程图。
[0071]
步骤s10中进行利用胶带剥离法采集角质层细胞的采集步骤s11。
[0072]
胶带剥离法是指将以粘胶带为代表的压敏胶粘贴在皮肤上并剥离，从而剥离皮肤细胞的方法的总称。
[0073]
对使用的压敏胶未作特别限制，但从便利性的观点来看，优选使用透明胶带。
[0074]
接着，进行转录步骤s12，将步骤s11中采集的角质层细胞转录到表面带正电荷的载玻片上。
[0075]
角质层细胞等人体细胞，受形成脂质双层膜的磷脂质的羧基(coo
‑
)的影响，表面带负电荷。
[0076]
在步骤s12中，通过将角质层细胞转录到表面带正电荷的载玻片上，由于静电相互作用角质层细胞难以从载玻片上剥离。
[0077]
作为一种表面带正电荷的载玻片的示例，其可以为一种表面用聚赖氨酸、聚烷基胺及氨基改性有机硅等修饰的载玻片。
[0078]
在本发明中，优选使用表面排列有nh
3+
的载玻片。
[0079]
nh
3+
与磷脂质的羧基形成离子键，因此角质层细胞更难从载玻片上剥离。
[0080]
表面排列有nh
3+
的载玻片可以使用市售载玻片，比如“pll包被载玻片”(松浪硝子工业株式会社生产)、“aps包被载玻片”(松浪硝子工业株式会社生产)及“mas包被载玻片”(松浪硝子工业株式会社生产)等。
[0081]
然后，进行清洗步骤s13，清洗转录有角质层细胞的载玻片。
[0082]
对载玻片的清洗方法未作特别限制，可使用振动式及超声波式清洗机进行清洗。
[0083]
在本发明中，优选为将载玻片浸泡在含有有机化合物的清洗剂中进行清洗。
[0084]
通过选用这种方式，可以更好地抑制角质层细胞的剥离。
[0085]
清洗剂可以使用例如二甲苯、三氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂，优选使用二甲苯，其不会影响角质层细胞的粘附蛋白质的量。
[0086]
进行浸泡清洗时，在室温下，该浸泡时间优选为3小时以上、更优选为6小时以上、进一步优选为12小时以上、特别优选为24小时以上。
[0087]
经过上述步骤，制备角质层细胞样本之后，接下来进行步骤s20，制备筛选样本。
[0088]
在步骤s20中，将作为探索对象的组分(以下，称作“待探索组分”)添加到角质层细胞样本中。
[0089]
对待探索组分未作特别限制，但考虑到要将具有减少粘附蛋白质的量作用的组分应用于人，例如可以将能够应用于化妆品的组分或能够应用于食品的组分设为待探索组分。
[0090]
比如，这种组分可以是植物提取物。
[0091]
优选地，待探索组分按照用于进行筛选的浓度，用磷酸缓冲生理盐水(pbs)进行稀释。
[0092]
在本发明的一实施方式中，也可制备不添加待探索组分的筛选对照样本。
[0093]
这种实施方式适合筛选具有减少粘附蛋白质的量的作用的组分种类。
[0094]
在本发明的一实施方式中，也可制备待探索组分的种类相同且浓度不同的多个筛选样本。
[0095]
这种实施方式适合筛选起到减少粘附蛋白质的量的作用的最佳浓度。
[0096]
另外，在步骤s20中，利用免疫组织染色法对添加有待探索组分的角质层细胞进行染色。
[0097]
利用免疫组织染色法的染色可采用常规方法进行，可根据粘附蛋白质的种类任意
选择直接法、间接法及敏化法。
[0098]
另外，可根据需要，使用任意封闭剂。
[0099]
作为染色对象的粘附蛋白质，只要包括在角质层细胞内则无特别限制，但优选为桥粒芯糖蛋白1。
[0100]
桥粒芯糖蛋白1在桥粒组分的蛋白分解与细胞剥离之间具有密切的相关关系，对于筛选影响其量增减的组分非常有用。
[0101]
然后，进行图像获取步骤s30，拍摄粘附蛋白质染色后的角质层细胞图像。
[0102]
使用显微镜进行图像拍摄。对显微镜的种类未作特别限制，可根据步骤s20中进行的免疫组织染色法使用适合的显微镜。
[0103]
显微镜可以列举光学显微镜、共焦激光显微镜、光学显微镜、电子显微镜等。
[0104]
在本发明中，优选使用共焦激光显微镜。
[0105]
通过使用共焦激光显微镜，可以拍摄到在染色部分(粘附蛋白质)与未染色部分(粘附蛋白质以外的部分、载玻片等)之间的边界不模糊的合焦的图像，因此可以提高本发明以染色部分为指标的筛选方法的精度。
[0106]
此外，使用共焦激光显微镜时，优选采用荧光抗体法作为所述免疫组织染色法。
[0107]
然后，从拍摄的图像中，将在转录有角质层细胞的部分内随机选择的范围放大，并转换为黑白图像(二值图像)。
[0108]
根据获得的图像，计算出染色部分和/或未染色部分的面积值、或者染色部分和/或未染色部分的面积比例(％)(以下仅称作“面积”，此时包括面积值及面积比例两者)。
[0109]
上述图像处理及面积计算可使用图像分析软件。
[0110]
例如，图像分析软件可以列举“image j(美国国立卫生研究院、nih)”等。
[0111]
优选地，将染色部分的面积设定为根据多个随机选择的范围计算出的面积的平均值。
[0112]
通过以多个部位的面积的平均值为指标，可以进行更准确的筛选。
[0113]
接着，进行评估步骤s40，以步骤s30中获得的面积为指标，评估待探索组分对粘附蛋白质增减的影响。
[0114]
图3示出了详细表示步骤s40的流程图。参照图3，对比较所述筛选样本的染色部分的面积与所述筛选对照样本的染色部分的面积的一实施方式中的评估工序进行说明。
[0115]
在步骤s41中，比较筛选样本的染色部分的面积at与筛选样本的染色部分的面积ac。
[0116]
面积的比较可以比较面积的绝对值，也可以比较将筛选对照样本的面积设为100％时的面积的比例。
[0117]
对多个筛选样本进行评估时，优选地，进行将筛选对照样本的面积设为100％时的比较。
[0118]
当面积at小于面积ac时(面积at＜面积ac)，进入步骤s42，评估添加到该筛选样本中的待探索组分是具有减少粘附蛋白质的量的作用的组分。
[0119]
另一方面，当面积at与面积ac相同或面积at大于面积ac时(面积at≤面积ac)，进入步骤s43，评估添加到该筛选样本中的待探索组分是具有减少粘附蛋白质的量的作用的组分。
[0120]
参照图3对一实施方式的评估工序进行了说明，但本发明的筛选方法中的评估工序只要是以筛选样本的染色部分的面积为指标评估对粘附蛋白质增减的影响，则不做特别限制。
[0121]
例如，要筛选增加粘附蛋白质的量的组分时，在步骤s41中判定是否为“面积at＞面积ac”，若结果为“是”，则可以在步骤s42中评估为“是具有增加粘附蛋白质的量的作用的组分”。
[0122]
另外，也可以在步骤s42中评估为“是具有减少粘附蛋白质的量的作用的组分”，在步骤s43中评估为“是具有增加粘附蛋白质的量的作用的组分”。
[0123]
另外，在另一实施方式中，如步骤s20中说明的一样，也可以是一种制备待探索组分的浓度不同的多个筛选样本并对它们进行评估的工序。
[0124]
在该实施方式中，比较多个筛选样本中的面积，在使粘附蛋白质的量减少或增加的作用中，如果存在用于表达显著效果阈值的特定浓度时，可以评估为“该待探索组分具有在特定浓度以上使粘附蛋白质的量显著减少或增加的作用”。
[0125]
另外，对于只有在特定浓度以上才表达上述作用的组分，可以评估为“该待探索组分在特定浓度以上，表达出减少或增加粘附蛋白质的量的作用”。
[0126]
优选地，本发明的筛选方法用于筛选用于改善和/或预防敏感性肌肤的组分。
[0127]
其中，本说明书中的“敏感性肌肤”是指对外部刺激(干燥、紫外线、涂抹化合物)的抵抗性降低(皮肤刺激指数降低)的肤质。
[0128]
更具体地，本说明书中的“敏感性肌肤”是指(1)和/或(2)中提到的肤质。
[0129]
(1)“对外用药物制剂、化妆品、植物、紫外线、金属等物质起反应，容易发生皮肤问题的肌肤。以及，对过敏性物质(花粉、香料等)或刺激性物质(酒精等)过敏的肌肤”。
[0130]
(2)“在睡眠不足、过度疲劳、生理期、换季、精神压力大等情况下，对刺激物容易暂时发生皮肤问题的肌肤”。
[0131]
另外，本说明书中的“用于改善和/或预防敏感性肌肤”是指对于抵抗外部刺激能力降低(皮肤刺激阈值降低)的肤质的改善和/或预防肤质抵抗外部刺激能力的降低(皮肤刺激阈值降低)。
[0132]
另外，优选地，本发明的筛选方法用于筛选对人体表皮角质细胞具有细胞间粘合连接抑制作用的组分。
[0133]
此外，在本说明书中，“细胞间粘合连接”一词是指由桥粒蛋白(含有桥粒芯糖蛋白的蛋白质组)的增加而引起的角质层粘合连接功能异常(因细胞粘合连接性增强，角质层的多层化加重)(如有需要，参照日本发明专利4197194号、日本发明专利第4002635号)。
[0134]
另外，在本说明书中，“抑制细胞间粘合连接”的概念包括细胞间粘合连接的预防及改善。
[0135]
其中，可以通过抑制人体表皮角质细胞的细胞间粘合连接，从而抑制角质层的多层化，获得抑制角质层多层剥离的作用。
[0136]
即，本技术发明的筛选方法可用于筛选对角质层多层剥离具有预防或改善作用的组分。
[0137]
此外，在本说明书中，“角质层多层剥离”是指角质层以多片重叠的状态从皮肤表面剥落。皮肤是否处于角质层多层剥离状态，可利用胶带剥离法采集角质层，对采集的角质
层进行染色并观察来确认。
[0138]
另外，如后述的实施例所示，在皮肤亮度低的部位，存在大量桥粒芯糖蛋白1，皮肤亮度降低可以认为是由角质层的多层化引起的。
[0139]
根据上述见解，具有减少桥粒芯糖蛋白作用的组分可以说是一种具有改善皮肤亮度作用的组分。
[0140]
即，本发明的筛选方法可用于筛选具有改善皮肤亮度作用的组分。
[0141]
其中，在本说明书中，“改善皮肤亮度”是指正常状态的皮肤与因桥粒芯糖蛋白过多而导致亮度降低的皮肤之间的亮度差异减小。
[0142]
另外，如后述的实施例所示，具有减少桥粒芯糖蛋白作用的组分具有一种改善皮肤的作用，改善后的皮肤更具透明感。即，本发明的筛选方法可用于筛选具有提高皮肤透明感作用的组分。
[0143]
另外，如后述的实施例所示，在皮肤硬度高的部位，存在大量桥粒芯糖蛋白1，可以认为皮肤硬度的主要原因在于角质层的多层化。
[0144]
基于上述见解，通过减少桥粒芯糖蛋白，可获软化皮肤的效果。即，本发明的筛选方法可用于筛选具有软化皮肤作用的组分。
[0145]
其中，皮肤软化可以使其他药剂组分更加有效地渗透。因此，本发明的筛选方法可用于筛选具有使美白剂等药效组分更有效地渗透到皮肤中的作用的组分。
[0146]
实施例
[0147]
[实施例1]
[0148]
<角质层细胞样本的制备工序>
[0149]
将用透明胶带从人前臂外侧采集的角质层转录到载玻片(“mas包被”，松浪硝子工业株式会社生产)上，将该载玻片在二甲苯中浸泡了一晚。
[0150]
接着，用二甲苯清洗该载玻片10分钟，清洗两次后，用pbs清洗。
[0151]
<待探索组分的制备>
[0152]
将野生百里香提取液(一丸自然美健公司生产、百里香(wild thyme,t.serpyllum)的地面部提取物)、及刺梨提取液(丸善制药株式会社生产、刺梨(rosa roxburghii)的果实提取物)分别用pbs稀释至浓度为0.1质量％、0.05质量％、0.025质量％、0.0125质量％，获得了待探索组分。
[0153]
<筛选用样本的制备>
[0154]
将角质层细胞在待探索组分中浸泡一晚，得到样本。另外，准备未在待探索组分中浸泡的角质层细胞作为对照样本。
[0155]
<免疫染色试验>
[0156]
用pbs清洗各样本后，在4％的pfa
·
磷酸缓冲液中于室温下温育15分钟。
[0157]
接着，用pbs清洗各样本后，在20％的block ace(ds pharma biomedical公司生产)水溶液中，于室温下温育1小时。
[0158]
在各样本中加入一抗(anti
‑
desmoglein 1,mouse
‑
mono)，在保湿盒中于室温下温育2小时。
[0159]
用pbs分别清洗样本5分钟，清洗3次之后，加入二抗(allexa fluor@488goat anti
‑
mouce igg)，在保湿盒中于室温下温育1小时。
[0160]
用pbs分别清洗样本5分钟，清洗3次，并用蒸馏水清洗2次后，使用fluoromout
‑
g(southern biotech公司生产)封入，得到了多个筛选样本及筛选对照样本。
[0161]
<图像分析>
[0162]
使用共焦激光显微镜分别拍摄筛选样本及筛选对照样本的用于进行分析的图像(图4)。
[0163]
使用图像分析软件(image j)，放大用于进行分析的图像中任意4处范围并进行黑白图像化，计算出染色部分及未染色部分的面积，计算出平均值。
[0164]
将筛选对照样本的染色部分的面积设为100％，计算出筛选样本的染色部分的面积的比例(4处的平均值)。结果在表1、图5中示出。
[0165]
[表1]
[0166]
样本平均sd无添加(对照样本)10010.981270.1％野生百里香34.4650214.894970.05％野生百里香85.260244.5072920.025％野生百里香87.750527.995820.0125％野生百里香98.4365610.217720.1％刺梨提取液bg9.2626498.0405110.05％刺梨提取液bg72.4828414.282120.025％刺梨提取液bg74.374029.3435350.0125％刺梨提取液bg70.430138.672259
[0167]
如图4及图5所示，可得知添加了野生百里香提取物及刺梨提取物的筛选样本与筛选对照样本相比，桥粒芯糖蛋白1的表达量减少。
[0168]
根据该结果，可以评估野生百里香提取物及刺梨提取物是具有减少桥粒芯糖蛋白1的量的作用的组分。
[0169]
另外，可得知添加的野生百里香提取物的浓度为0.1质量％的筛选样本与浓度为0.05、0.025和0.0125质量％的筛选样本相比，染色部分的面积减少了约2.5倍～2.8倍。
[0170]
同样，可得知刺梨提取物添加浓度为0.1质量％的筛选样本与浓度为0.05、0.025和0.0125质量％的筛选样本相比，染色部分的面积减少了7.6～8.0倍。
[0171]
由此，可以评估为野生百里香提取物及刺梨提取物在其浓度0.1质量％以上，具有显著减少桥粒芯糖蛋白1的量的作用。
[0172]
[实施例2]
[0173]
<角质层细胞样本的制备工序>
[0174]
利用与实施例1相同的方式制备角质层细胞样本。
[0175]
<待探索组分的制备>
[0176]
将药用蜀葵提取液(jurlique公司生产、药用蜀葵(althaea officinalis)根的提取物)用pbs稀释至浓度为0.25质量％，获得待探索组分。
[0177]
<筛选用样本的制备>
[0178]
将角质层细胞在待探索组分中浸泡一晚，得到样本。另外，准备未在待探索组分中浸泡的角质层细胞作为对照样本。
[0179]
<免疫染色试验>
[0180]
利用与实施例1相同的方式得到筛选用样本及筛选对照样本。
[0181]
<图像分析>
[0182]
利用与实施例1相同的方式，拍摄筛选用样本及筛选对照样本的用于进行分析的图像，将筛选对照样本的染色部分的面积设为100％，计算出筛选样本的染色部分面积的比例。结果在表2、图6及图7中示出。
[0183]
[表2]
[0184]
受试样本桥粒芯糖蛋白1表达量(％)无添加1000.25质量％药用蜀葵提取液72.09
[0185]
如图6及图7所示，可得知添加了药用蜀葵提取物的筛选样本与筛选对照样本相比，桥粒芯糖蛋白1的表达量减少。
[0186]
根据该结果，可以评估为药用蜀葵提取物是具有减少桥粒芯糖蛋白1的量的作用的组分。
[0187]
[实施例3]
[0188]
以下显示了证实皮肤亮度差异与桥粒芯糖蛋白1的存在量之间的相关性、以及证实桥粒芯糖蛋白1的存在量与皮肤硬度之间的相关性的试验结果。
[0189]
(1)受试者及测量部位
[0190]
本实施例中，以20名40岁到52岁的女性为受试者。
[0191]
然后，在本实施例中，选择受试者面部中能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)和正常状态的部位(参照图13中部位b)作为测量部位。
[0192]
(2)测量
[0193]
(2
‑
1)l*值、a*值、b*值的测量
[0194]
将分光光度计放置在上述测量部位，各部位分别测量5次，从而测量到l*值、a*值、b*值。
[0195]
结果在图8～图10中示出。
[0196]
关于l*值，能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)与正常状态的部位(参照图13中部位b)相比，显示出明显较低的值。即，能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)与正常状态的部位(参照图13中部位b)相比颜色较暗。
[0197]
关于a*值，能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)与正常状态的部位(参照图13中部位b)相比，显示出明显较高的值。即，能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)与正常状态的部位(参照图13中部位b)相比红色较强。
[0198]
关于b*值，能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)与正常状态的部位(参照图13中部位b)相比，显示出明显较高的值。即，能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)与正常状态的部位(参照图13中部位b)相比黄色较强。
[0199]
(2
‑
2)硬度测量
[0200]
将直读压痕硬度计按压在上述(2
‑
1)的试验中所用的各测量部位上分别进行5次测量，从而测量到硬度。
[0201]
结果在图11中示出。
[0202]
关于硬度，能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)与正常状态的部位(参照图13中部位b)相比，显示出明显较低的值。即，能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)与正常状态的部位(参照图13中部位b)相比较为坚硬。
[0203]
(2
‑
3)桥粒芯糖蛋白1(dsg1)染色
[0204]
用胶带剥离法采集上述(2
‑
1)、(2
‑
2)的试验中所用的各测量部位的角质层细胞，并粘贴在载玻片上。
[0205]
将粘贴有角质层细胞的载玻片在二甲苯浸泡一晩。
[0206]
浸泡后，清洗、风干之后，在4％的多聚甲醛
·
磷酸缓冲液中，于室温条件下静置15分钟。
[0207]
15分后，用pbs清洗角质层细胞，并在0.5％的tritonx(nacalai tesque公司生产)/pbs溶液中，于室温条件下浸泡5分钟。
[0208]
浸泡后，清洗，在block ace水溶液中(ds pharma biomedical uk
‑
b80)，于室温条件下静置1小时。
[0209]
静置后，用免疫组化笔(大道产业公司生产)加框，加入一抗，在保湿盒中，于室温条件下静置2小时。
[0210]
使用anti desmoglein 1,mouse mono(dsg1 p23)progen,651110原液(igg浓度：10
‑
15g/ml)作为一抗。
[0211]
静置后，使用pbs清洗，加入二抗，在保湿盒中，于室温条件下静置1小时。
[0212]
使用alle xa fluor@488goat anti mouse igg invitrogen,a 11001 pbs的200倍稀释溶液作为二抗。
[0213]
静置后清洗，用fluoromout
‑
g(southern biotech公司生产)封入，于室温下干燥30分钟。
[0214]
干燥后，用指甲油固定玻璃盖片，使其干燥后，用于使用共焦激光显微镜(nikon a1)、
×
20进行观察(拍摄)。
[0215]
结果在图12中示出。
[0216]
关于桥粒芯糖蛋白1(dsg1)量，能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)与正常状态的部位(参照图13中部位b)相比，显示出明显较高的值。即，能够通过肉眼确认亮度降低的部位(黑色部分、参照图13中部位a)与正常状态的部位(参照图13中部位b)相比桥粒芯糖蛋白1(dsg1)量较多。
[0217]
(3)考察
[0218]
如图8～图10及图12所示，可得知皮肤亮度较低的部位中存在较多桥粒芯糖蛋白1。其中，可以认为皮肤亮度降低是由于皮肤的ph低，分解桥粒芯糖蛋白1的丝氨酸蛋白酶的活性低，角质层的重叠变密(角质层的多层化)所致。
[0219]
而且，如上所述，本技术发明的有效组分起到了减少桥粒芯糖蛋白的作用。
[0220]
根据上述见解可知，本发明的有效组分通过减少桥粒芯糖蛋白1起到了改善皮肤
亮度的作用。
[0221]
如图11～图12所示，可知皮肤硬度高的部位，存在大量桥粒芯糖蛋白1。其中，可以认为皮肤较硬主要是受皮肤的ph低，分解桥粒芯糖蛋白1的丝氨酸蛋白酶的活性低，角质层的重叠变密(角质层的多层化)所影响。
[0222]
基于上述见解可知，通过减少桥粒芯糖蛋白1，皮肤会变柔软。
[0223]
而且，如上所述，本技术发明的有效组分起到了减少桥粒芯糖蛋白的作用。
[0224]
即，可得知本发明的有效组分通过减少桥粒芯糖蛋白1起到软化皮肤的作用。
[0225]
[实施例4]
[0226]
以下示出组合物抑制多层剥离作用的验证结果，该组合物含有具有减少桥粒芯糖蛋白作用的组分。
[0227]
(1)制剂的制备
[0228]
按照表3所记载的组成，制备含有刺梨提取物的制造例1的化妆品。
[0229]
[表3]
[0230]
组分制造例1脂肪酸40甘油19.2双甘油3.5羧甲基纤维素钠0.4丙烯酸
·
二甲基二烯丙基氯化铵
·
丙烯酰胺共聚物液2二甲基二烯丙基氯化铵
·
丙烯酰胺共聚物液4.5氢氧化钾8.5烷基糖苷1.5刺梨提取物0.4水20合计100
[0231]
(2)受试者及目标部位
[0232]
在本实施例中，以5名女性为受试者，在受试者的左前臂和右前臂内侧部(n＝10)每天2次(早晚)涂抹制造例1的化妆品，持续10天。
[0233]
(3)桥粒芯糖蛋白减少作用的验证
[0234]
在制造例1的化妆品的使用前、使用后(连续10天后)的各个阶段中，按照实施例1的“<角质层细胞样本的制备工序>”中所述的方法，采集各受试者的左前臂内侧部和右前臂内侧部的角质层，制备角质层细胞样本。接着，按照实施例1的“<免疫染色试验>”中所述的方法，对角质层细胞样本中的桥粒芯糖蛋白1进行染色，使用共焦激光显微镜拍摄使用制造例1之前和之后的用于进行分析的图像，确认荧光(染色)。
[0235]
将用于进行分析的图像整体的面积设为100％，计算出荧光部分的面积。结果在图14、图15中示出。此外，在图15中，*为p＜0.05。
[0236]
如图14及图15所示，可以确认通过连续使用含有刺梨提取物的制造例1的化妆品，桥粒芯糖蛋白1的量减少。
[0237]
(4)验证多层剥离抑制作用
[0238]
在使用制造例1的化妆品之前和之后，按照实施例1的“<角质层细胞样本的制备工序>”中所述的方法，采集各受试者左前臂内侧部和右前臂内侧部的角质层，制备了角质层细胞样本。接着，使用龙胆紫和煌绿，利用常规方法对各个角质层细胞样本进行染色，用光学显微镜进行观察。
[0239]
结果的代表图在图16中示出。
[0240]
如图16所示，使用制造例1之前的角质层细胞的光学显微镜图像中存在多个颜色较深的部分。该颜色较深的部分是角质层细胞通过胶带剥离法进行了多层剥离的部分。
[0241]
另一方面，在连续10天使用制造例1之后采集的角质层细胞样本中，与使用前采集的角质层细胞样本相比，大部分染色较浅。该较浅的部分是角质层细胞仅剥离一层的部分，也就是说，没有发生多层剥离。
[0242]
如上所示，可以确认通过使用含有具有桥粒芯糖蛋白减少作用的组分的制造例1的化妆品，从而多层剥离得到改善。
[0243]
[实施例5]
[0244]
以下，调查了含有具有桥粒芯糖蛋白减少作用的组分的组合物减少桥粒芯糖蛋白的能力。
[0245]
(1)组合物的制备
[0246]
按照下述表4所示的配方，制备了含有野生百里香提取物的化妆品(乳液)。即，将组分(a)、(b)、(c)分别加热到7o℃，将(c)加入到(b)中进行中和，一边对其搅拌一边缓慢加入(a)以乳化，使用均质器均质之后，一边搅拌一边冷却，得到了制造例2的乳液。
[0247]
[表4]
[0248][0249]
(2)受试者及测量部位
[0250]
本实施例中，以20名40岁到52岁的女性为受试者。
[0251]
然后，在本实施例中，选择受试者面部存在斑点的部位(92处)作为测量部位。
[0252]
在各受试者存在斑点的部位1天2次涂抹制造例1的乳液，持续12周。
[0253]
(3)测量
[0254]
在使用制造例的乳液前、连续使用6周的时间点及12周的时间点，按照实施例1的“<角质层细胞样本的制备工序>”中所述的方法，采集受试者存在斑点的部位的角质层细胞，制备了角质层细胞样本。接着，按照实施例1的“<免疫染色试验>”中所述的方法，对各个角质层细胞样本中的桥粒芯糖蛋白1进行染色，使用共焦激光显微镜拍摄使用制造例2之前和之后的用于进行分析的图像，确认荧光(染色)。
[0255]
将用于进行分析的图像整体的面积设为100％，选出荧光部分的面积。结果在表5、表6及图17(代表)、图18、19中示出。此外，针对使用乳液经过12周后的数据，统计斑点部位93处中的80处的数据，并与相同部位中的使用乳液前的数据进行了比较。另外，在图18中、**为p＜0.01，在图19中，***为p＜0.001。
[0256]
[表5]
[0257]
桥粒芯糖蛋白1量(％)使用前连续使用6周平均23.920.9标准偏差9.429.68样本数n＝92n＝92
[0258]
[表6]
[0259]
桥粒芯糖蛋白1量(％)使用前连续使用12周平均23.210.6标准偏差7.889.62样本数n＝80n＝80
[0260]
如表5～6及图17～19所示，可以确认通过连续使用含有野生百里香提取物的乳液，斑点部位中的桥粒芯糖蛋白1量显著减少。
[0261]
产业上的可利用性
[0262]
本发明可应用于与粘附蛋白质的量相关的分析方法。