一种利用高效液相电感耦合等离子体质谱测定硒形态的方法与流程

1.本发明涉及一种利用高效液相电感耦合等离子体质谱测定硒形态的方法，属于分析测试领域。


背景技术：

2.目前的研究发现硒在环境介质中主要以seo
32
‑
、seo
42
‑
、se0、se2‑
的形式存在；而硒在农作物中主要以semet、secyscysse、mesecys、seo
32
‑
、seo
42
‑
等形式存在，一般通过lc
‑
afs、hplc
‑
icp
‑
ms等方法予以分析。全国供销行业标准《富硒农产品gh/t1135
‑
2017》中推荐的检测方法为lc
‑
afs，而低硒、含硒或天然富硒的农产品经样品前处理后往往达不到afs的仪器检测限。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种利用高效液相电感耦合等离子体质谱测定硒形态的方法，不仅仅是检测元素总量，同时优化了定量方法，排除实验干扰，提高检测效率与准确率。
4.为了实现上述目的，本发明提供了一种利用高效液相电感耦合等离子体质谱测定硒形态的方法，包括以下步骤：
5.(1)流动相制备：将铵盐溶液及色谱纯甲醇配制成甲醇
‑
柠檬酸铵缓冲液并调节ph值；使用0.22μm滤膜对流动相进行抽滤，超声脱气，得到流动相；
6.(2)采用高效液相色谱
‑
电感耦合等离子体质谱联用(icp
‑
ms)对标准硒形态溶液和待测提取提取液进行测定；icp
‑
ms在分析检测硒形态时具有灵敏度高、选择性好等优点，以及具有多元素和同位素同时检测的能力,但是硒离子化效率相对较低，并且氩的二聚物ar2对检测硒存在着严重的离子干扰，因此采用cct 碰撞池技术消除离子干扰；
7.(3)采用归一化法对样品中硒代胱氨酸(secys2)、硒代蛋氨酸(semet)、甲基硒代半胱氨酸(mesecys)、亚硒酸根(seo
32
‑
)以及硒酸根(seo
42
‑
)五种硒形态进行定量分析。归一化法相较其他方法的优点是：简便、准确、定量结果与进样量重复性无关(在色谱柱不超载的范围内)、操作条件略有变化时对结果影响较小，并且可以对未知物质进行定量分析。
8.进一步地，其中步骤(1)中，所述铵盐选自柠檬酸二铵、磷酸氢二胺和柠檬酸铵中的一种，优选为柠檬酸铵。
9.进一步地，其中步骤(1)中，所述色谱纯甲醇为经过
‑
20℃冷冻的色谱纯甲醇，以保证其物理及化学性质的稳定下最节省实验成本。
10.进一步地，其中步骤(1)中，所述流动相中甲醇的体积浓度为2
‑
10％，优选为 2％，这样优选后有利于达到完全分离五种硒形态的效果。
11.进一步地，其中步骤(1)中，所述流动相中铵盐溶液的浓度为2
‑
10mmol/l，优选为6mmol/l，这样优选后有利于达到完全分离五种硒形态的效果。
12.进一步地，其中步骤(1)中，所述流动相的ph值为5
‑
6，优选为5.7，这样优选后有利
于达到完全分离五种硒形态的效果。
13.进一步地，其中步骤(1)中，所述超声脱气的时间为15
±
5min。
14.进一步地，其中步骤(2)中，所述标准硒形态溶液包括硒代胱氨酸(secys2)、硒代蛋氨酸(semet)、甲基硒代半胱氨酸(mesecys)、亚硒酸根(seo
32
‑
) 以及硒酸根(seo
42
‑
)五种硒形态标准样品储备液，其中每种硒形态标准样品储备液的浓度为1000mg/ml(以硒计)。
15.进一步地，其中步骤(3)具体包括：根据hplc
‑
icp
‑
ms联用检测样品中各组分的量与其峰面积成正比的特性，且样品中所有组分都能产生信号得到相应的色谱峰，由各组分保留时间可知其对应形态，由此可以用归一化公式(1)计算各组分的含量：
[0016][0017]
其中：设试样分组共n，各组含量分别为m1，m2，
……
，m
n
。
[0018]
进一步地，其中步骤(3)中，使用归一化法对样品进行定量分析时，所有标准样品配置需以硒计算浓度，并且满足所有硒形态成分都洗脱并且在检测器有响应且所有硒形态成分相同硒浓度的情况下峰面积相同。
[0019]
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0020]
本发明通过hplc
‑
icp
‑
ms联用技术，采用归一化法对样品进行定量分析，能分别检测出植物中硒代胱氨酸(secys2)、甲基硒代半胱氨酸(semecy)、硒代蛋氨酸(semet)、亚硒酸根(seo
32
‑
)以及硒酸根(seo
42
‑
)五种硒形态及各含量。方法简单快捷，流动相配制简便，分析结果准确可靠。相比于现有的光谱法、质谱法和色谱法等对元素形态的选择性更好，稳定性更强。
附图说明
[0021]
图1为本发明不采用cct碰撞池技术的se元素标准曲线；
[0022]
图2为本发明采用cct碰撞池技术的se元素标准曲线。
具体实施方式
[0023]
下面结合说明书附图对本发明进行进一步说明。
[0024]
以下材料或试剂，除非特别说明，均为市售。
[0025]
本发明的实施例提供了一种利用高效液相电感耦合等离子体质谱测定硒形态的方法，包括以下步骤：
[0026]
(1)流动相制备：称取柠檬酸二铵、磷酸氢二胺或柠檬酸铵并加入超纯水，用玻璃棒搅拌均匀；加入冷冻(
‑
20℃)色谱纯甲醇(2％)后，使用10wt％的稀盐酸调节ph值至5.7；使用0.22μm滤膜对流动相进行抽滤，之后将制备好的流动相超声脱气15min；分别用柠檬酸二铵、磷酸氢二铵与柠檬酸铵配置流动相对样品硒形态进行色谱分析，由得出的各形态保留时间和峰面积可知，用磷酸氢二铵与柠檬酸二铵配置的流动相均无法有效分离五种形态，影响实验结果，而柠檬酸铵作流动相盐可使五种形态分离完全。
[0027]
(2)利用高效液相色谱
‑
电感耦合等离子体质谱联用对标准硒形态溶液和待测提取液进行测定，并且采用cct碰撞池技术消除离子干扰(见图1、图2)，
[0028]
cct碰撞池技术具体的操作步骤如下(以7％氢+93％氦混合气为例)。
[0029]
①
打开he气钢瓶(要求其纯度>99.999％)调气压至0.1mpa。
[0030]
②
在instrument
→
configurations中选择标准模式，调出一组参数。
[0031]
③
按正常模式点燃等离子体，进入operate状态。
[0032]
④
将进样毛细管插入1ppb调节液中，检查标准条件下的信号情况，如灵敏度，rsd等。
[0033]
⑤
在instrument
→
tune
‑
add gas中打开cct1的气体，调流量至7ml/min，等待约10min。
[0034]
⑥
将进样毛细管插入1ppb in溶液中。
[0035]
⑦
在instrument
→
configurations
→
选择√cctch1,然后在下面的选框内打√的位置重新打√。
[0036]
⑧
调节碰撞气流量和仪器参数，使在纯水中ar(80)的计数小于200，同时in 的灵敏度大于20000/ppb。
[0037]
⑨
编辑分析方法，选择数据库为default cct。
[0038]
⑩
分析样品。
[0039]
由图1和图2对比可知，采用cct碰撞池技术标准曲线的拟合系数为 0.999583，明显高于未采用的拟合系数0.986383，说明采用cct碰撞池技术时基本无其余离子干扰，测量值更加准确；所述标准硒形态溶液包括硒代胱氨酸 (secys2)、硒代蛋氨酸(semet)、甲基硒代半胱氨酸(mesecys)、亚硒酸根(seo
32
‑
)以及硒酸根(seo
42
‑
)五种硒形态标准样品储备液，其中每种硒形态标准样品储备液的浓度为1000mg/ml(以硒计)。配制后
‑
20℃保存，上机检测前配制5种硒形态混合标准溶液，并将混标逐级稀释至100μg/kg；
[0040]
(3)采用归一化法对样品中硒代胱氨酸(secys2)、硒代蛋氨酸(semet)、甲基硒代半胱氨酸(mesecys)、亚硒酸根(seo
32
‑
)以及硒酸根(seo
42
‑
)五种硒形态进行定量分析。根据hplc
‑
icp
‑
ms联用检测样品中各组分的量与其峰面积成正比的特性，且样品中所有组分都能产生信号得到相应的色谱峰，由各组分保留时间可知其对应形态，用如下归一化公式计算各组分的含量。设试样分组共n，各组含量分别为m1，m2，
……
，m
n
，则i种组分的百分含量为：
[0041][0042]
根据hplc
‑
icp
‑
ms(高效液相色谱仪(hplc，日本岛津lc
‑
20a)，x series 2型icp
‑
ms(thermofisher)作为hplc的在线监测装置，搭建hplc
‑
icp
‑
ms 联用检测系统)联用分别检测样品1(茶叶)、样品2(水稻叶)及样品3(糙米)，得出各形态的峰面积，见表1；之后将样品1
‑
3的峰面积分别带入公式(1)，则分别得到样品1
‑
3各形态的百分含量，见表1。
[0043]
表1
[0044][0045]
以下通过具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0046]
实施例1流动相的盐浓度对比
[0047]
表2不同浓度的流动相盐下五种形态的保留时间
[0048]
配置柠檬酸铵含量分别为2mmol/l、6mmol/l、10mmol/l三种流动相(三种流动相除柠檬酸铵浓度外无其他变量)，按照仪器说明书分别用三种流动相对 100μg/kg(每种形态标准液的浓度)的硒形态混合标准溶液进行测定，得出每种形态的保留时间并分析。
[0049][0050]
由表2结果可知，当柠檬酸铵的浓度为2mmol/l时，亚硒酸根保留时间增加，导致与硒代蛋氨酸保留时间叠加而无法分离；而当柠檬酸铵浓度为10mmol/l 时，亚硒酸根保留时间减小，导致与甲基硒代半胱氨酸保留时间重合而无法分离；因此选用浓度为6mmol/l的柠檬酸铵配置流动相。
[0051]
实施例2流动相的ph值对比
[0052]
配置ph值分别为5.5、5.7、5.9的三种流动相(三种流动相除ph值外无其他变量)，按照仪器说明书分别用三种流动相对100μg/kg(每种形态标准液的浓度)的硒形态混合标准溶液进行测定，得出每种形态的保留时间并分析。
[0053]
表3流动相在不同ph值下五种形态的保留时间
[0054][0055]
由表3结果可得，亚硒酸根和硒酸根的保留时间对流动相ph值的变化极为敏感，ph越大其保留时间会越小。当ph值为5.5时，虽然该流动相7min就可以洗脱所待测形态，但是亚硒酸根和甲基硒代半胱氨酸却无法进行分离；而当 ph值为5.9时，亚硒酸根和硒代蛋氨酸出峰重叠，无法对待测样品进行分离，并且硒酸根的保留时间已经超过10min。因此，流动相ph为5.7时为最佳条件， 5种待测硒形态可在10min之内全部洗脱并且保留时间无重叠。
[0056]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。