精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法与流程

1.本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.男性不育是指育龄夫妇，未避孕性生活，由于男方因素导致女方在一年内未自然受孕。临床上，普遍应用精液常规检测参数评价男性生育能力。虽然精液常规检测很有意义，但也存在着局限性。为了弥补精液常规检测的不足，人们陆续寻找到一些更有价值的指标，精子顶体酶就是其中的一项。人们发现精子顶体酶与精子浓度、活力、正常形态率等密切相关，对男性不育的诊断与治疗有着重要的应用价值，精子顶体酶阳性率低和活性低是造成男性不育的主要原因。因此，精子顶体酶的检测意义重大。
3.化学发光免疫分析法，其具有灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其样本需求量少等。化学发光免疫测试试剂盒相比传统的检测方法，抗原、抗体的结合是在相似的液体条件下进行，反应更加迅速灵敏；另一方面，化学发光免疫测定试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度。基于此本发明提供一种精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
6.本发明提供一种精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒，包括：r1、r2和r3试剂；
7.所述r1试剂为链霉亲和素带有tosyl官能团磁颗粒；
8.所述r2试剂为化学发光标记物标记的精子顶体酶抗体；
9.所述r3试剂为偶联标记物标记的精子顶体酶抗体。
10.在上述技术方案中，所述r1试剂的质量比是0.02％～1％。
11.在上述技术方案中，所述r2试剂中，精子顶体酶抗体与化学发光标记物的标记比例是1:3～20；缓冲液为100～500mm bistris，0.3～1.0m锌化合物，精子顶体酶抗体终浓度为0.1～1μg/ml。
12.在上述技术方案中，所述r3试剂中，精子顶体酶抗体与偶联标记物的标记比例是1:5～20；缓冲液为100～500mm bistris，0.3～1.0m锌化合物，精子顶体酶抗体终浓度为0.2～3μg/ml。
13.在上述技术方案中，所述r1试剂中，磁颗粒的粒径是4～6μm。
14.在上述技术方案中，所述r2试剂中，化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或者三联吡啶钌。
15.在上述技术方案中，所述r3试剂中，偶联标记物为生物素或者抗原。
16.在上述技术方案中，所述锌化合物为硫酸锌、氯化锌或者硫代硫酸锌。
17.在上述技术方案中，所述化学发光免疫检测试剂盒还包括精子顶体酶校准品，所述精子顶体酶校准品浓度为0.0pg/ml、2.0pg/ml、5.0pg/ml、10.0pg/ml、20.0pg/ml、50.0pg/ml和100.0pg/ml的精子顶体酶蛋白溶液。
18.本发明还提供一种精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
19.步骤1、r1试剂的制备
20.取浓度是100mg/ml的链霉亲和素带有tosyl官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒；重复清洗3次后在100～500mmbistris，ph6～8的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的r1试剂；
21.步骤2、r2试剂的制备
22.将500μg精子顶体酶抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后按照精子顶体酶抗体与化学发光标记物的标记比例是1:3～20加入化学发光标记物的dmf溶液，经过封闭、纯化步骤后得到精子顶体酶化学发光标记物抗体；将精子顶体酶化学发光标记物抗体浓溶液用100～500mm bistris、0.3～1.0m锌化合物，ph6～8的缓冲液配制成抗体终浓度为0.1
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2μg/ml的r2试剂；
23.步骤3、r3试剂的制备
24.取500μg精子顶体酶抗体，将ph6.5的tris缓冲液透析纯化后，按照精子顶体酶抗体与偶联标记物的标记比例是1:5～20加入偶联标记物，经过封闭、纯化步骤后得到偶联标记物标记的精子顶体酶抗体；将偶联标记物标记的精子顶体酶抗体浓溶液用100～500mm bistris、0.3～1.0m锌化合物，ph6～8的缓冲液配制成抗体终浓度为0.2
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3μg/ml的r3试剂；
25.将r1、r2和r3试剂组装成成品试剂即精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒。这种精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒用于检测精子顶体酶时，利用全自动化学发光免疫分析仪对精子顶体酶校准品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；然后根据需求测试临床样本，根据样本的光量子数计算精子顶体酶的浓度。
26.本发明的有益效果是：
27.本发明的精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成对精子顶体酶的检测。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，缩短了临床检测所需的时间。这种化学发光免疫分析试剂盒的检测精度较高。
附图说明
28.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
29.图1为实施例4得到的标准曲线图，横坐标为校准品浓度，纵坐标为试剂反应的光量子数，其拟合度达0.9900。
具体实施方式
30.为了使本发明的优点、目的和方法更加详实易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了诸多细节以便于理解，但本发明可以以不同于描述的其他方式来实施。
31.本发明提供一种精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒，包括：r1、r2和r3试剂；所述r1试剂为链霉亲和素带有tosyl官能团磁颗粒；所述r2试剂为化学发光标记物标记的精子顶体酶抗体；所述r3试剂为偶联标记物标记的精子顶体酶抗体。
32.优选的，所述r1试剂链霉亲和素带有tosyl官能团磁颗粒的质量比是0.02％～1％，进一步优选将链霉亲和素带有tosyl官能团磁颗粒于缓冲溶液中配制成磁珠浓度为0.072％。
33.优选的，所述r2试剂化学发光标记物标记的精子顶体酶抗体中，精子顶体酶抗体与化学发光标记物的标记比例是1:3～20，进一步优选标记比例是1:5；缓冲液为100～500mm bistris，0.3～1.0m锌化合物，精子顶体酶抗体终浓度为0.1～1μg/ml；进一步优选，缓冲液为100mm bistris，0.3～1.0m氯化锌，抗体终浓度为0.5μg/ml。
34.优选的，所述r3试剂偶联标记物标记的精子顶体酶抗体中，精子顶体酶抗体与偶联标记物的标记比例是1:5～20，进一步优选为精子顶体酶抗体与偶联标记物的标记比例是1:10；缓冲液为100～500mm bistris，0.3～1.0m锌化合物，精子顶体酶抗体终浓度为0.2～3μg/ml；进一步优选缓冲液为100mm bistris，0.3～1.0m氯化锌，精子顶体酶抗体终浓度为1.5μg/ml。
35.优选的，所述r1试剂链霉亲和素带有tosyl官能团磁颗粒的磁颗粒的粒径是4～6μm，进一步优选粒径是6μm。
36.本发明所述化学发光免疫检测试剂盒还包括精子顶体酶校准品，精子顶体酶校准品浓度为0.0pg/ml、2.0pg/ml、5.0pg/ml、10.0pg/ml、20.0pg/ml、50.0pg/ml和100.0pg/ml的精子顶体酶蛋白溶液。
37.这种精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒用于检测精子顶体酶时，利用全自动化学发光免疫分析仪对精子顶体酶校准品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；然后根据需求测试临床样本，根据样本的光量子数计算精子顶体酶的浓度。
38.使用本发明化学发光免疫检测试剂盒检测精子顶体酶具有如下优点：
39.1、选择吖啶酯等为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本。
40.2、采用链霉亲和素磁珠与生物素标记的抗体可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。
41.3、精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守。
42.4、吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽。
43.5、试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。
44.6、样本保存时间更长。
45.本发明的化学发光免疫检测试剂盒在准确度方面可以替代市面上的胶体金检测试剂盒，为客户提供更加快速、准确的测量数据。
46.实施例1:精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒的制备：
47.r1试剂的制备：取浓度是100mg/ml的链霉亲和素带有tosyl官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在200mm bistris，ph6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的r1试剂。
48.r2试剂的制备：将500μg精子顶体酶抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的dmf溶液，经过封闭、纯化等步骤后得到精子顶体酶化学发光标记物抗体。将精子顶体酶化学发光标记物抗体浓溶液用200mm bistris、0.3m氯化锌，ph6.5的缓冲液配制成抗体终浓度为0.1μg/ml的r2试剂，其中精子顶体酶抗体与化学发光标记物的标记比例是1:3。
49.r3试剂的制备：取500μg精子顶体酶抗体，将ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素sulfo
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nhs
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lc
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biotin，经过封闭、纯化等步骤后得到精子顶体酶偶联标记物抗体。将精子顶体酶偶联标记物抗体浓溶液用200mm bistris、0.3m氯化锌，ph6.5的缓冲液配制成抗体终浓度为0.2μg/ml的r3试剂，其中精子顶体酶抗体与偶联标记物的标记比例是1:20。
50.实施例2：精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒的制备
51.r1试剂的制备：取浓度是100mg/ml的链霉亲和素带有tosyl官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在100mm bistris，ph7的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的r1试剂。
52.r2试剂的制备：将500μg精子顶体酶抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的dmf溶液，经过封闭、纯化等步骤后得到精子顶体酶化学发光标记物抗体。将精子顶体酶化学发光标记物抗体浓溶液用100mm bistris、1.0m氯化锌，ph7的缓冲液配制成抗体终浓度为1μg/ml的r2试剂，其中精子顶体酶抗体与化学发光标记物的标记比例是1:5。
53.r3试剂的制备：取500μg精子顶体酶抗体，将ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素sulfo
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nhs
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lc
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biotin，经过封闭、纯化等步骤后得到精子顶体酶偶联标记物抗体。将精子顶体酶偶联标记物抗体浓溶液用100mm bistris、1.0m氯化锌，ph7的缓冲液配制成抗体终浓度为2μg/ml的r3试剂，其中精子顶体酶抗体与偶联标记物的标记比例是1:10。
54.实施例3：精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒的制备
55.r1试剂的制备：取浓度是100mg/ml的链霉亲和素带有tosyl官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在500mm bistris、0.05％吐温
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20、0.1％proclin300，ph7.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的r1试剂。
56.r2试剂的制备：将500μg精子顶体酶抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的dmf溶液，经过封闭、纯化等步骤后得到精子顶体酶化学发光标记物抗体。将精子顶体酶化学发光标记物抗体浓溶液用500mm bistris、0.5m氯化锌，ph8的缓冲液配制成抗体终浓度为0.5μg/ml的r2试剂，其中精子顶体酶抗体与化学发光标记物的标记比例是1:10。
57.r3试剂的制备：取500μg精子顶体酶抗体，将ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素sulfo
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nhs
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lc
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biotin，经过封闭、纯化等步骤后得到精子顶体酶偶联标记物抗体。将精子顶体酶偶联标记物抗体浓溶液用500mm bistris、0.5m氯化锌，ph8的缓冲液配制成抗体终浓度为1.5μg/ml的r3试剂，其中精子顶体酶抗体与偶联标记物的标记比例是1:5。
58.实施例4：精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒的制备
59.r1试剂的制备：取浓度是100mg/ml的链霉亲和素带有tosyl官能团磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在200mmbistris，ph6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的r1试剂。
60.r2试剂的制备：将500μg精子顶体酶抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的dmf溶液，经过封闭、纯化等步骤后得到精子顶体酶化学发光标记物抗体。将精子顶体酶化学发光标记物抗体浓溶液用200mm bistris，ph6.5的缓冲液配制成抗体终浓度为0.1μg/ml的r2试剂，其中精子顶体酶抗体与化学发光标记物的标记比例是1:20。
61.r3试剂的制备：取500μg精子顶体酶抗体，将ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素sulfo
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nhs
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lc
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biotin，经过封闭、纯化等步骤后得到精子顶体酶偶联标记物抗体。将精子顶体酶偶联标记物抗体浓溶液用200mm bistris，ph6.5的缓冲液配制成抗体终浓度为0.2μg/ml的r3试剂，其中精子顶体酶抗体与偶联标记物的标记比例是1:5。
62.实施例5：精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒性能评价
63.对实施例1组装成的试剂盒进行线性的检测：将校准品浓度为0.0pg/ml、2.0pg/ml、5.0pg/ml、10.0pg/ml、20.0pg/ml、50.0pg/ml和100.0pg/ml与光量子数作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9999。
64.浓度光量子数01102.07795.0282410.0920820.02690850.0114457100.0289183
65.分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值加两倍标准差，带入零值校准品及相邻的校准所成直线所得即为灵敏度；计算精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.80pg/ml。
[0066][0067]
实施例6：精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒性能评价
[0068]
对实施例2组装成的试剂盒进行线性的检测：将校准品浓度为0.0pg/ml、2.0pg/ml、5.0pg/ml、10.0pg/ml、20.0pg/ml、50.0pg/ml和100.0pg/ml与光量子数作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9997，线性范围为0.5～100pg/ml。
[0069]
浓度光量子数01022.08055.0265210.0936620.02632750.0115569100.0288564
[0070]
分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值加两倍标准差，带入零值校准品及相邻的校准所成直线所得即为灵敏度；计算精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.51pg/ml。
[0071][0072]
实施例7：精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒性能评价
[0073]
对实施例3组装成的试剂盒进行线性的检测：将校准品浓度为0.0pg/ml、2.0pg/ml、5.0pg/ml、10.0pg/ml、20.0pg/ml、50.0pg/ml和100.0pg/ml与光量子数作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9993，线性范围为0.5～100pg/ml。
[0074][0075][0076]
分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值加两倍标准差，带入零值校准品及相邻的校准所成直线所得即为灵敏度；计算精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.20pg/ml。
[0077][0078]
实施例8：精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒性能评价
[0079]
对实施例4组装成的试剂盒进行线性的检测：将校准品浓度为0.0pg/ml、2.0pg/ml、5.0pg/ml、10.0pg/ml、20.0pg/ml、50.0pg/ml和100.0pg/ml与光量子数作标准曲线(参见图1)，得到线性相关系数r＝0.9983，线性范围为0.5～100pg/ml。
[0080]
浓度光量子数02362.010365.0294910.0998720.02752150.0122697100.0277456
[0081]
分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值加两倍标准差，带入零值校准品及相邻的校准所成直线所得即为灵敏度；计算精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.20pg/ml。
[0082][0083]
实施例9：精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒效期实时稳定性验证
[0084]
取以上实施例1～4组装成的试剂盒，每四个月测试一次相同三支冻干的样本，验证其实时稳定性。
[0085][0086]
从以上实施例1～3可以看出，对于添加了氯化锌的实施例测试校准品线性相关性和灵敏度更好；效期12个月实时稳定性也比没有添加氯化锌的实施例4更好：偏差均在
±
10％范围内，而没有添加氯化锌的实施例4偏差均在
±
15％以上。因此，氯化锌是本发明重要的组成成分，可以影响本发明试剂盒的效期稳定性。
[0087]
上述实施例中的化学发光标记物、偶联标记物、锌化合物还可以替换为前述限定的其他物质，也可以取得上述技术效果，这里不再一一举例。
[0088]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。