一种青风藤特征图谱及含量测定方法与流程

1.本发明属于原料药的检测技术领域，尤其涉及一种青风藤药材的特征图谱及含量测定方法。


背景技术：

2.青风藤味苦、辛，性平，归肝脾经，被收录于2020版《中国药典》一部。青风藤具有祛风利湿、活血解毒的功能，临床上多用于治疗风湿性和类风湿性关节炎，强直性脊椎炎以及心律失常等。青风藤的主要有效成分为生物碱类成分，包括青藤碱、木兰花碱和蝙蝠葛碱等。其中的青藤碱是青风藤的指标性有效成分，具有广泛药理活性，包括镇痛、镇静、免疫抑制、降压、抗炎、抗心律失常等。


技术实现要素：

3.本发明目的在于提供一种青风藤特征图谱及含量测定方法。本发明采用的技术方案是：青风藤特征图谱测定及含量测定
4.照高效液相色谱法
5.1)对照品溶液制备
6.分别取青藤碱与木兰花碱对照品适量，精密称定，加入甲醇制成每1ml含对照品 0.5g的溶液，即得。
7.2)供试品溶液制备
8.取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇20ml，密塞，超声20分钟(功率200w，频率40khz)，滤过，并用70％乙醇 20ml冲洗滤渣，合并滤液与洗液，60℃回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至 20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心取上清液，即得。
9.3)色谱条件：
10.仪器：waters 2695液相色谱仪
11.色谱柱：xbrige c
18
(4.6
×
250mm,5μm)
12.柱温：25℃
13.流速：1.0ml/min
14.进样量：5μl
15.流动相：a(水相)：10mmol甲酸铵用氨水调节ph至10.0；b(有机相)：乙腈
[0016][0017]
供试品特征图谱(2-4)中呈现4个特征峰，2、5、8和21号色谱峰为共有峰，保留时间分别为3.36、9.73、16.76和44.41(单位：min)。
[0018]
使用对照品对青风藤液相色谱图中色谱峰进行指认，5号色谱峰为木兰花碱， 21号色谱峰为青藤碱；青风藤色谱指纹图谱相对保留时间rsd小于2.59％；分别以s19、s31和s65作为青风藤藤茎、根茎和根指纹图谱的参照图谱。
[0019]
按干燥品计算，青藤碱含量不少于0.80％，木兰花碱含量不少于0.40％。实验例1：
[0020]
1、仪器与软件：waters 2695高效液相色谱仪，配备2998型pda检测器(美国waters公司)，bgz-140型电热鼓风干燥箱(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)，wb400us型超声清洗机(上海望标仪器有限公司)，me55型电子天平(瑞士 metter-toledo)，tg16-ws型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)， jk-200db型jk-200db型数控超声波清洗器(安徽合肥金尼克机械制造有限公司)， milli-q型超纯水系统(美国millipore公司)。数据处理采用：本技术采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)生成青风藤的色谱指纹图谱；采用simca-p 14.1(umetric公司)对指纹图谱匹配数据进行降维并进行opls-da分析；使用 origin 2018(originlab公司)进行图形绘制。
[0021]
2、试剂及材料：青藤碱(批号：110774-201808)购自中国食品药品检定研究院，木兰花碱(批号：p23j11l119379)购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司，乙腈购自美国天地有限公司，氨水购自阿拉丁科技(中国)有限公司，甲酸铵购自上海易恩化学技术有限公司，纯净水由milli-q型超纯水系统制备。
[0022]
3.液相色谱样品制备条件考察
[0023]
1)提取方法及是否复溶
[0024]
现有技术中一般使用甲醇或70％乙醇提取青风藤，实验尝试使用甲醇与70％乙醇对青风藤进行提取，结果发现木兰花碱前置拖尾严重。后采用甲醇提取蒸干甲醇复溶、甲醇提取蒸干70％乙醇复溶与70％乙醇、70％乙醇提取蒸干甲醇复溶、 70％乙醇提取蒸干70％乙醇复溶。发现甲醇提取蒸干甲醇复溶与70％乙醇提取蒸干甲醇复溶木兰花碱未出现前置拖尾，色谱图如图1所示。如表1所示，70％乙醇提取蒸干甲醇复溶时木兰花碱分离度为2.15，大于1.5；甲醇提取蒸干甲醇复溶时木兰花碱分离度为1.06，小于1.5，两种提取方法结果并无其他差别。故选用70％乙醇提取蒸干甲醇复溶作为青风藤供试液的提取方法。
[0025]
表1提取溶剂考察结果表
[0026][0027]
2)提取溶剂百分比考察
[0028]
实验对提取溶剂(乙醇)的百分比进行了考察，分别取5份青风藤粉末(过三号药典筛)，每份约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入60％、70％、80％、90％和95％乙醇20ml，密塞，超声20分钟(功率200w，频率40khz)，滤过，并用60％、70％、80％、90％和95％乙醇20ml冲洗滤渣，合并滤液与洗液， 60℃回收至干，残渣加甲醇溶解，转移至20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心取上清液，即得。色谱图如图2所示，峰面积如表2所示。不同百分比乙醇提取的青风藤样品hplc色谱图并无明显区别，于是对青风藤样品hplc色谱图的峰面积进行对比，结果表明60％和70％乙醇提取青藤碱和木兰花碱峰面积差别不大，乙醇百分比为80％及更高浓度乙醇提取的青风藤样品，青藤碱和木兰花碱峰面积随乙醇百分比增大而明显减小，因60％乙醇不易蒸干，故选用70％作为提取溶剂。
[0029]
表2乙醇溶度考察结果
[0030][0031]
4、色谱条件考察
[0032]
1)波长选择
[0033]
对样品进行全波长扫描，青藤碱及木兰花碱在200nm-400nm波长范围内吸收如图3和图4所示，全波长扫描结果，考察了262nm、267nm、272nm和283nm 四个检测波长，结果表明262nm时色谱图峰形较好，综合考虑后，最终选择了测定青藤碱常用的262nm作为本发明的测检测波长。
[0034]
2)ph选择
[0035]
实验考察了9.0、9.5和10.0三个流动相ph，结果如表3所示，结果表明ph 为9.0与
10.0时色谱图均较好，但ph为9.0青藤碱与相邻的峰相距过近，当青藤碱含量高时易与邻近峰分离度下降，故选择ph为10.0。
[0036]
表3流动相ph考察结果
[0037][0038]
3)色谱柱柱温选择
[0039]
本发明考察了20℃、25℃与30℃三个色谱柱柱温。结果如表4所示，柱温为 30℃青藤碱未能基线分离，故不选用30℃作为本发明的色谱柱柱温，柱温为25℃木兰花碱分离度较柱温为20℃时木兰花碱分离度好，且柱温为25℃时青藤碱理论塔板数也大于柱温为20℃时青藤碱理论塔板数，故选择25℃作为本发明的色谱柱柱温。
[0040]
表4色谱柱柱温考察结果
[0041][0042]
4)进样量选择
[0043]
实验考察了5μl、10μl和15μl三个进样量，结果如表5所示，结果表明进样量为10μl与15μl时木兰花碱均未基线分离且前置拖尾较严重，故选择5μl 为进样量。
[0044]
表5进样量考察结果
[0045]
[0046][0047]
实验例2方法学研究
[0048]
1)加样回收率试验
[0049]
精密称取(已测定过含量)青风藤样品6份，每份0.25g，分别精密加入适量的对照品，按照实验例1的方法制备供试液，按实验例1的项下色谱条件进样，记录木兰花碱和青藤碱的峰面积，结果如表6表7所示，木兰花碱和青藤碱加样回收率分别为90.54％和96.44％，rsd分别为1.09％和1.02％。
[0050]
表6青藤碱加样回收率结果
[0051][0052][0053]
表7木兰花碱加样回收率
[0054][0055]
2)日内精密度试验
[0056]
取本品粉末0.5g，按照“1.2.2项下”方法制备供试液，按“1.2.3”项下色谱条件连续进样6次，结果如表8所示，结果表明青藤碱及木兰花碱保留时间的rsd小于0.1％，青藤碱及木兰花碱峰面积的rsd小于0.4％，表明仪器精密度良好。
[0057]
表8日内精密度结果
[0058][0059][0060]
3)稳定性试验
[0061]
取青风藤药材粉末0.5g，按照实验例1方法制备供试液，按实验例1项下色谱条件进样，分别于制备后0、2、4、8、13、24h按实验例1项下色谱条件进样，木兰花碱和青藤碱峰面积rsd分别为1.19％和1.73％，表明供试液在24h内稳定性良好，结如表9所示。
[0062]
表9稳定性结果
[0063][0064]
4)重复性试验
[0065]
取同一批青风藤药材粉末6份，按照实验例1方法制备供试液，按实验例1 项下色谱条件进样，记录木兰花碱和青藤碱峰面积，结果如表10所示，木兰花碱和青藤碱峰面积rsd分别为0.70％和0.71％，表明此方法重复性良好。
[0066]
表10重复性实验结果
[0067][0068][0069]
5、线性关系考察
[0070]
按实验例1项下方法制备对照品混合液，以甲醇依次稀释2、4、8、16、32、 64倍，按实验例1项下色谱方法进行测定，记录数据，以样品浓度为横坐标(x), 以峰面积为纵坐标(y),进行线性回归，得回归方程与标准曲线方程，结果见表 11、表12、图10、图11。
[0071]
表11青藤碱和木兰花碱线性及范围
[0072][0073]
表12青藤碱与命木兰花碱线性回归方程及相关系数
[0074][0075][0076]
实验例3指纹图谱相似度评价及共有成分确定
[0077]
选取74批不同产地及部位的青风藤药材，按照实验例1方法制备供试液，按实验例1项下色谱条件进样，记录74批青风藤药材色谱图，图5为空白、青藤碱与木兰花碱混标和青风藤样品的hplc色谱图。将青风藤藤茎和根茎的液相色谱图分别导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”进行分析。将s19作为青风藤的参照图谱，时间窗口设置为0.5，采用中位数生成对照图谱，其中2、5、8和21号色谱峰为共有峰，保留时间分别为3.36、9.73、16.76 和44.41(单位：min)，使用对照品对青风藤液相色谱图中色谱峰进行指认，结果表明5号色谱峰为木兰花碱，21号色谱峰为青藤碱，青风藤色谱指纹图谱相对保留时间rsd小于2.59％，说明74批青风藤样品色谱峰保留时间较稳定，74批青风藤样品色谱峰相对峰面积rsd差别较大，最高为135.46％，表明74批青风藤样品质量相差较大。为方便观察，分别以s19、s31和s65作为青风藤藤茎、根茎和根指纹图谱的参照图谱，做青风藤藤茎、根茎和根的指纹图谱(藤茎指纹图谱：图6；根茎指纹图谱：图7；根指纹图谱：图8)。
[0078]
青风藤指纹图谱示例
[0079]
根据显微鉴别可知陕西样品为青藤，其他产地样品为毛青藤，因要规定单一药材基源，所以只根据毛青藤生成青风藤指纹图谱。结果如图9所示。
[0080]
供试品特征图谱中呈现4个特征(共有)峰，保留时间分别为3.36、9.73、 16.76和44.41(单位：min)。
[0081]
实验例4线性关系考察
[0082]
按实验例1项下方法制备对照品混合液，以甲醇依次稀释2、4、8、16、32、 64倍，按实验例1项下色谱方法进行测定，记录数据，以样品浓度为横坐标(x), 以峰面积为纵坐标
(y),进行线性回归，得回归方程与标准曲线方程，结果见表 13、表14、图15。
[0083]
表13青藤碱和木兰花碱线性及范围
[0084][0085]
表14青藤碱与命木兰花碱线性回归方程及相关系数
[0086][0087]
实验例5化学计量学分析
[0088]
1)正交偏最小二乘判别分析(opls-da)
[0089]
opls-da是在偏最小二乘判别(pls-da)基础上发展出的算法，相对于 pls-da，opls-da将x变量中系统标量分为同y线性相关和同y正交的两部分，随正交变异组分的增加，可增加解释性并减少误差。
[0090]
为寻找能区别青风藤不同部位的质量差异性成分，将74批青风藤样品指纹图谱的匹配数据导入14.1版simca-p进行降维和opls-da分析。首先根据先验知识对青风藤藤茎、根茎和根3个不同部位进行分类，进行opls-da分析，并对不同部位青风藤的opls-da分析进行优化，当使用3个主成分时所得opls-da参数最好，结果如图12所示，从图中可知藤茎与根茎聚类趋势明显，根的内部质量差异较大，但也能聚为一类。此时不同部位青风藤的opls-da的分类变量y解释程度参数(r2y)为0.884，表明模型的解释能力好；模型预测参数(q2)为0.597，表明模型的预测能力较好。使用14.1版simca-p软件得到青风藤不同部位opls-da 的vip值条形图，结果如图13所示，以便找出影响青风藤不同部位的差异性成分。
[0091]
实验例6：不同产地青风藤的质量差异性
[0092]
为寻找能区别不同产地青风藤的质量差异性成分，将74批青风藤样品指纹图谱的匹配数据导入14.1版simca-p进行opls-da分析。首先根据先验知识将安徽、贵州、陕西、湖南和湖北的青风藤分为5类，进行opls-da分析，并对不同产地青风藤的opls-da分析进行优化，结果表明当使用4个主成分时所得opls-da参数最好，不同产地青风藤opls-da的三位散
点图如图14所示，从图中可知陕西、贵州和湖南的青风藤样品可以分别聚为一类，且组间差异较小，安徽与湖北的青风藤样品与其他产地青风藤样品分离趋势明显，但安徽与湖北的青风藤样品不能分别聚为一类，而是聚集为一类。此时不同部位青风藤的opls-da的分类变量y 解释程度参数(r2y)为0.678，表明模型的解释能力好；模型预测参数(q2)为 0.531，表明模型的预测能力较好。使用14.1版simca-p软件得到不同部位青风藤opls-da的vip值条形图，结果如图15所示，以便分析影响不同产地青风藤青风藤质量的差异性从成分。
[0093]
实验例7：指纹图谱相似度评价、共有成分确定及指纹图谱示例
[0094]
1、指标性成分选择
[0095]
由图13可知，青风藤不同部位opls-da分析的vip值大于1的共有峰有1个，保留时间为44.41min(21号色谱峰)；由图15可知，青风藤不同产地opls-da 分析的vip值大于1的共有峰有两个，保留时间为44.41min(21号色谱峰)和 9.73min(5号色谱峰)，经对照品比对保留时间为9.73min(5号色谱峰)的色谱峰为木兰花碱，保留时间为44.41min(20号色谱峰)的色谱峰为青藤碱。查阅文献及药典[1-4,16]可知青藤碱为青风藤的主要药效成分，木兰花碱具有广泛的药理作用，包括抗糖尿病，抗炎，神经心理药理作用[16]，可作为青风藤的治质量控制成分。因此选择青藤碱和木兰花碱作为青风藤的指标性成分。
[0096]
2)指纹图谱数据分析
[0097]
opls-da结果分析
[0098]
从不同部位青风藤opls-da的三维得分散点图图12中可知，青风藤藤茎、根茎与根能分别聚为一类，根的内部质量差异较大，但也能聚为一类，表明本发明方法可以区分青风藤的不同部位。
[0099]
从不同产地青风藤opls-da三维得分散点图14中可知，陕西、贵州和湖南的青风藤样品可以分别聚为一类，且组间差异较小，安徽与湖北的青风藤样品与其他产地青风藤样品分离趋势明显，但安徽与湖北的青风藤样品不能分别聚为一类，而是聚集为一类。对青风藤的采集地信息进行了分析，发现安徽与湖北青风藤采集地的纬度较为相近，安徽青风藤采集地的纬度为30
°
～36
°
，湖北青风藤采集地的纬度为27
°‑
30
°
，因此安徽与湖北青风藤品质较为相近的原因可能是青风藤产地纬度较为相近。
[0100]
实验例8青风藤含量测定
[0101]
1)青风藤含量测定结果
[0102]
按已确定液相色谱方法测定74批青风藤含量，74批青风藤木兰花碱及青藤碱含量测定结果如表13所示。
[0103]
表15 74批青风藤样品的木兰花碱和青藤碱含量测定结果
[0104]
[0105]
[0106][0107]
2)含量测定结果与结果分析
[0108]
使用本技术建立的青风藤含量测定方法对74批青风藤的青藤碱和木兰花碱进行含量测定。根据含量测定结果将不同产地及药用部位的青藤碱和木兰花碱分别作图，不同产地及药用部位青风藤的青藤碱含量如图16所示，不同产地及药用部位青风藤的木兰花碱含量如图17所示。由图16可知药用部位对青藤碱含量影响较大，青风藤根茎与根中的青藤碱含量较藤茎中青藤碱含量高，青藤碱是青风藤的主要有效成分，因此建议将根茎也作为青风藤药材的药用部位，出于可持续发展考虑，不建议将根作为青风藤的药用部位；由图17可知产地对木兰花碱含量影响较大，湖北的生长的青风藤中木兰花碱较其他产地高。
[0109]
3)青风藤青藤碱及木兰花碱含量限度制定
[0110]
根据显微鉴别可知陕西样品为青藤，其他产地样品为毛青藤，因要规定单一药材基源，所以只根据毛青藤样品计算含量限度。
[0111]
除去基源为青藤样品及药用部位为根的样品；以剩余样品指定青风藤的含量限度(含量限度计算公式如公式2-1所示)。青藤碱含量平均值为1.13％，青藤碱含量最小值为0.1％，最大值为2.76％，计算剩余青风藤样品中青藤碱含量限度为 0.86％，木兰花碱含量平均值为0.57％，木兰花碱含量最小值为0.23％，最大值为 1.58％，木兰花碱含量限度值为0.43％，最终规定青风藤中青藤碱含量不少于0.80％，木兰花碱含量不少于0.40％。
[0112]
单以青藤碱含量计算，51批青风藤中25批不合格，总样本数的42％，其中有藤茎15批、根茎5批；单以木兰花碱含量计算，51批青风藤中19批不合格，占总样本数的42％，其中有藤茎10批根茎9批；以青藤碱含量和木兰花碱计算，51 批青风藤中17批不合格，总样本数的55％，其中藤茎17批、根茎11批。具体信息如下表2-16所示。
[0113]
表16以不同指标计算青风藤不同药用部位样品的不合格样本数(总样本数为51)
[0114]
[0115]
公式2-1含量限度计算公式：
[0116]
其中μ为限度值；为平均值；t为单边t分布临界值；s为标准偏差；n为样本数；mu为
[0117]
本发明提供一种青风藤药材的特征图谱及含量测定方法。相比现有方法，本发明特征图谱及含量测定方法有利于准确反映青风藤药材的质量，适合推广用于企业中青风藤药材的的检测。
附图说明
[0118]
图1提取方法及是否复溶
[0119]
图2乙醇百分比考察
[0120]
图3青藤碱的全波长扫描
[0121]
图4木兰花碱全波长扫描
[0122]
图5空白、混标、青风藤样品hplc图(5:木兰花碱21:青藤碱)
[0123]
图6 30批青风藤藤茎的hplc指纹图谱(s1-s30)
[0124]
图7 34批青风藤根茎的hplc指纹图谱(s31-s64)
[0125]
图8 10批青风藤根的hplc指纹图谱(s65-s74)
[0126]
图9青风藤对照特征图谱(9.73：木兰花碱44.41：青藤碱)
[0127]
图10木兰花碱标准曲线
[0128]
图11青藤碱标准曲线
[0129]
图12不同部位的青风藤样品opls-da得分图
[0130]
图13不同部位的青风藤样品opls-da的vip图
[0131]
图14不同产地的青风藤样品opls-da得分图
[0132]
图15不同产地的青风藤样品opls-da的vip图
[0133]
图16 4批不同部位和产地青风藤中青藤碱含量
[0134]
图17 4批不同部位及产地青风藤中木兰花碱含量
具体实施方式
[0135]
实施例1：一种青风藤药材的特征指纹图谱检测方法：
[0136]
照高效液相色谱法
[0137]
2)对照品溶液制备
[0138]
分别取青藤碱与木兰花碱对照品适量，精密称定，加入甲醇制成每1ml含对照品 0.5g的溶液，即得。
[0139]
2)供试品溶液制备
[0140]
取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇20ml，密塞，超声20分钟(功率200w，频率40khz)，滤过，并用70％乙醇 20ml冲洗滤渣，合并滤液与洗液，60℃回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至 20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心取上清液，即得。
[0141]
3)色谱条件：
[0142]
仪器：waters 2695液相色谱仪
[0143]
色谱柱：xbrige c
18
(4.6
×
250mm,5μm)
[0144]
柱温：25℃
[0145]
流速：1.0ml/min
[0146]
进样量：5μl
[0147]
流动相：a(水相)：10mmol甲酸铵用氨水调节ph至10.0；b(有机相)：乙腈
[0148][0149][0150]
供试品特征图谱(2-4)中呈现4个特征峰，2、5、8和21号色谱峰为共有峰，保留时间分别为3.36、9.73、16.76和44.41(单位：min)。
[0151]
使用对照品对青风藤液相色谱图中色谱峰进行指认，5号色谱峰为木兰花碱， 21号色谱峰为青藤碱；青风藤色谱指纹图谱相对保留时间rsd小于2.59％；分别以s19、s31和s65作为青风藤藤茎、根茎和根指纹图谱的参照图谱。
[0152]
实施例2：一种青风藤药材的含量测定方法：
[0153]
照高效液相色谱法
[0154]
1)对照品溶液制备
[0155]
分别取青藤碱与木兰花碱对照品适量，精密称定，加入甲醇制成每1ml含对照品0.5g的溶液，即得。
[0156]
2)供试品溶液制备
[0157]
取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇20ml，密塞，超声20分钟(功率200w，频率40khz)，滤过，并用70％乙醇20ml冲洗滤渣，合并滤液与洗液，60℃回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心取上清液，即得。
[0158]
3)色谱条件：
[0159]
仪器：waters 2695液相色谱仪
[0160]
色谱柱：xbrige c
18
(4.6
×
250mm,5μm)
[0161]
柱温：25℃
[0162]
流速：1.0ml/min
[0163]
进样量：5μl
[0164]
流动相：a(水相)：10mmol甲酸铵用氨水调节ph至10.0；b(有机相)：乙腈
[0165]
按干燥品计算，青藤碱含量不少于0.80%，木兰花碱含量不少于0.40%。