中药制剂中雷公藤甲素含量的测定方法与流程

1.本发明涉及中药分析技术领域，特别涉及中药制剂中雷公藤甲素含量的测 定方法。


背景技术：

2.类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,ra)是一种慢性进行性的自身免疫性 疾病，也是国际公认的重大疑难疾病。ra给病人带来的痛苦和经济消耗比癌症 更甚。现代医学治疗ra已经逐渐演变为：使用“症状缓解类药物”和生物制剂 以减轻炎性反应控制疾病进程。然而价格昂贵、生物制剂难以普及、副作用严 重影响患者依从性等因素限制了西药类的治疗手段。同时ra临床治疗的难点 是疾病造成的骨质损伤致残。许多“症状改善药”如nsaids、激素等，或仅改 善症状而对骨质损伤无明显作用，或其本身还可导致骨丢失造成骨损伤。
3.中医理论指导下的辨证论治，因人而异的个体化治疗方案在ra的逐渐应用 广泛，对比单独的西药治疗方式，中药具有独特的整体用药思维，在保证疗效 的条件下，副反应发生率相对更低。ra在中医中属于“尪痹”，治需祛风散寒、 通络。
4.昆仙胶囊(国药准字z20060267)是由昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸杞 子四味中药制备而成的治疗类风湿性关节炎中药制剂，具有补肾通络、祛风除 湿的功效，主治类风湿关节炎属风湿痹阻兼肾虚证。组方中的君药昆明山海棠 为卫矛科植物昆明山海棠tripterygium hypoglaucum(levl.)hutch的干燥根，是 雷公藤属植物，具有祛风除湿、续筋接骨、祛瘀通络的作用，民间常用于治疗 类风湿性关节炎。其水煎液毒性较雷公藤弱，但仍具有一定的生殖毒性，将其 与淫羊藿、枸杞子、菟丝子配伍使用后，发现其生殖毒性显著降低，且淫羊藿 具有祛风湿、强精补肾的作用，枸杞子、菟丝子具有补肾养血、强筋健骨的作 用，与昆明山海棠配伍起到减毒增效的效果。不仅能够显著减轻类风湿患者的 症状，而且不存在同类药的严重肝、肾毒副作用。昆仙胶囊上市后受到了广泛 的信赖和好评，具有良好的临床疗效和市场前景。
5.目前公认二萜内酯及生物碱是雷公藤属植物治疗痹病的主要有效成分，也 是主要毒性成分，二萜内酯在昆明山海棠中最主要是雷公藤甲素。雷公藤甲素 具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等活性成分，是雷公藤类制剂中主要药效成分， 但同时对心、肝、肾、脾、胸腺、骨髓、生殖系统有一定程度的毒性，雷公藤 甲素的治疗浓度和毒性浓度的剂量极为接近。目前昆仙胶囊的药品标准收录于 《国家食品药品监督管理局国家药品标准》中，为了控制昆仙胶囊中毒/效成分 的有效安全平衡点，规定了雷公藤甲素的上下限，含量限度为17.5～32.5μg/粒， 如此狭窄“含量窗口”需要更加精确稳定的雷公藤甲素的测定方法进行重点监 测。同时复杂不稳定的雷公藤甲素的含量测定方法也成为了制约昆仙胶囊的产 能及稳定性的瓶颈，因此，亟需建立一种可靠稳定的雷公藤甲素含量的测定方 法。
6.目前，在《国家食品药品监督管理局国家药品标准》中，有昆仙胶囊雷公 藤甲素的含量测定方法及含量限度。但是原局颁标准方法在雷公藤甲素含量的 测定的样品前处理
中，采用硅胶-氧化铝柱进行分离纯化，伴有工序繁琐、溶剂 消耗大的问题。具体地：
①
溶剂消耗量大，不利于环境和实验人员的安全。每 测定一个样品需消耗1,2-二氯乙烷溶液140ml，目前1,2-二氯乙烷被列入2b类 致癌物清单中，所引起的职业中毒事件时有发生，在批量生产中对样品进行大 量样品测定会对实验人员的安全构成一定的威胁；
②
处理工序复杂、时间长， 处理一次样品花费近两天的时间；
③
雷公藤甲素在昆仙胶囊中为微量成分(10 ppm)，复杂的操作流程对实验人员的熟练度要求极高，操作容易失误造成含量 测定不准确，含量测定的rsd值在4～7％之间，波动较大。
7.此外，还有介绍对昆仙胶囊中雷公藤甲素采用薄层色谱和高效液相色谱法 定性定量分析的方法。然而，这种方法同样存在溶剂使用量大、溶剂有害易污 染、测定结果不稳定等问题。具体为：
①
溶剂消耗量大，每测定一个样品，需 消耗甲醇300ml，石油醚约120ml，不适用于实际大批量生产中批次样品的大 量检测活动；
②
操作流程复杂，需将甲醇提取液在经过二氯甲烷萃取后，再经 过硅胶柱洗脱进行分离纯化，操作流程的复杂容易造成成分损失，因此用该方 法测定的昆仙胶囊含量为5.928～13.255μg/粒，为原局颁标准方法的测定含量的 23-53％，测定的含量偏低。
③
使用溶剂有毒，二氯甲烷属于2a类致癌物并被 列入有毒有害水污染物名录，长期使用会对实验人员的健康存在一定损害，也 会有环境污染的隐患。
④
采用高效液相色谱-紫外检测器进行测定，色谱图中成 分较多，且目标峰峰高较低，附近有其他成分色谱峰，在积分时容易存在干扰， 如图1所示。
8.此外，还有介绍昆明山海棠中雷公藤甲素的测定方法。该方法存在溶剂消 耗大、操作复杂、测定时间长等问题。具体为：
①
溶剂用量大，每测定一个样 品，需要消耗100ml甲醇，丙酮100ml；
②
操作过程复杂，该方法使用100ml 甲醇超声提取后，蒸干，残渣使用甲醇：丙酮＝2:1的溶剂进行溶解，上样至氧 化铝层析柱中，使用100ml丙酮洗脱，蒸干，残渣使用5ml甲醇溶解，在液 相色谱中进行测定，该方法操作复杂，耗时至少1天。
③
测定存在干扰，该方 法使用220nm波长进行测定，色谱图中有较多色谱峰，目标峰左右两边有其他 成分，如图2所示，容易有干扰。该方法主要用于测定昆明山海棠药材中的雷 公藤甲素含量，并非应用于复方制剂。
9.此外，还有介绍从生物样品中测定雷公藤甲素等毒性物质的方法。然而该 方法从生物样品中分离毒性物质，生物样品中主要为蛋白质，前处理应用固相 小柱去除生物样品中的蛋白等杂质，使用大型质谱进行检测，检测成本高。其 检测方法主要应用于鉴定生物样品、体外样品及可疑物的痕量检测，仅用于定 性判断，无法用于中药复方制剂的含量测定。


技术实现要素：

10.基于此，本发明提供一种中药制剂中雷公藤甲素含量的测定方法，应用溶 剂安全，前处理方法简单，能够排除中药制剂中大极性成分及小极性成分(例 如黄酮类成分)的干扰，而且测定结果稳定，在原局颁标准方法的测定含量的 79％～105％之间，平均值为90％，符合毒/效成分精准控制的原则。
11.技术方案为：
12.一种中药制剂中雷公藤甲素含量的测定方法，包括以下步骤：
13.取雷公藤甲素标准品，配制标准溶液；
14.将待测中药制剂样品浸于70℃～90℃的水中，然后加入乙酸乙酯，超声提取， 收集有机相，向所述有机相中加入碱液萃取，去除水相，制备待测溶液；
15.对所述标准溶液和所述待测溶液进行高效液相色谱联用质谱检测；
16.所述质谱条件包括：扫描模式为单离子监测扫描；
17.所述待测中药制剂样品的制备原料包括昆明山海棠、淫羊藿、菟丝子和枸 杞子。
18.在其中一个实施例中，所述中药制剂为昆仙胶囊。可以理解地，所述待测 中药制剂样品为昆仙胶囊内容物。
19.在其中一个实施例中，所述质谱条件还包括：质谱检测器为单四极杆质谱 检测器或三重四极杆质谱检测器，采用电喷雾(esi)离子源，正离子检测，检 测离子为m/z361.16。
20.可选地，所述质谱检测器为单四极杆质谱检测器，离子源温度(probe)为 600℃
±
60℃，毛细管电压0.9kv
±
0.1kv，锥孔电压15v
±
1.5v。
21.可选地，所述质谱检测器为三重四极杆质谱检测器，干燥器(n2)温度350℃
ꢀ±
10℃，干燥器(n2)流量10.00l/min
±
2l/min，电喷雾电压900v
±
100v， fragmentor为0v，毛细管电压0.9kv
±
0.1kv。
22.优选地，质谱检测器为单四极杆质谱检测器。使用sir(单离子监测)扫描 模式，将扫描和记录整个质荷比(m/z)，在比较了本发明方法与原局颁标准方法 中的昆仙胶囊含量测定结果后发现，qda(单四极杆质谱)方法测定15批次昆 仙胶囊中雷公藤甲素含量为原局颁标准方法的测定含量的79％～105％之间，平 均值为90％，因此可以完全适用于昆仙胶囊的含量测定。同时单四极杆质谱还 具有专属性强、准确度高(rsd＝4.86％)、重复性好(rsd＝2.70％)和12h内 稳定性好(rsd＝1.46％)的优势，在可以获得同样高质量的质谱数据的同时， 操作方便、空间需求小、价格及维护成本低的优势，可以更广泛的进行实际应 用。
23.若在没有qda检测器的情况下，也可使用qqq-ms(三重四级杆质谱)的 sim(单离子监测)扫描模式，同样可收集到稳定的目标离子信息。
24.在其中一个实施例中，所述待测中药制剂样品浸于70℃～90℃的水中的时间 为3min～20min。优选地，所述待测中药制剂样品浸于70℃～90℃的水中的时间 为5min～10min。
25.在其中一个实施例中，所述超声提取的时间大于等于45min。
26.在其中一个实施例中，所述70℃～90℃的水与乙酸乙酯的体积比为1:(4～6)， 每0.4g所述待测中药制剂样品，加入大于等于25ml的所述乙酸乙酯。
27.相比于原局颁标准方法中每个样品需消耗1,2-二氯乙烷溶液140ml、有些 方案中每测定一个样品需消耗甲醇300ml和石油醚120ml或有些方案大量使 用甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷等有毒、易污染的试剂。本发明中通过对比研究， 发现了先用水去除大极性干扰物的情况下，每测定一个样品，可以只需要有机 试剂乙酸乙酯25ml，不但大大减少了有机试剂的用量，降低了检测工作中的风 险，而且替代了现有的二氯甲烷、三氯甲烷等有毒、易污染的试剂，对实验人 员和环境的安全性也有大的提升。
28.在其中一个实施例中，加入碱液萃取的次数为1次～2次。
29.在其中一个实施例中，所述碱液为氢氧化钠水溶液，每0.4g所述待测中药 制剂样品，每次加入10ml～30ml所述氢氧化钠水溶液萃取，所述氢氧化钠水溶 液的质量分数为
2％～4％。
30.在其中一个实施例中，所述去除水相后，还包括加水继续萃取的步骤。
31.在加入碱液萃取后，加入水萃取，其目的是为了除去残留的碱。具体地， 如果碱液为氢氧化钠水溶液，钠离子残留会对质谱的离子源产生影响，会影响 样品在质谱内的电离效率。
32.在其中一个实施例中，所述色谱条件包括：柱温为35℃
±
5℃，流速为 0.4ml
·
min-1
±
0.2ml
·
min-1
，流动相a为甲醇，流动相b为甲酸水溶液，梯度洗 脱。
33.在其中一个实施例中，所述梯度洗脱具体为：
34.0min～5min，所述流动相a的体积分数由10％升高至46％，所述流动相b 的体积分数由90％降低至54％；
35.5min～10min，所述流动相a的体积分数由46％升高至51％，所述流动相b 的体积分数由54％降低至49％。
36.与传统方案相比，本发明具有以下有益效果：
37.1、本发明的中药制剂的制备原料包括淫羊藿、枸杞子等，含有大量的极性 成分及黄酮类成分，对昆明山海棠中的雷公藤甲素测定造成了干扰，存在复方 干扰情况，针对这一问题，本发明在前期预实验中直接采取甲醇、乙醇进行成 分提取，发现其加样回收率仅为52％～66％，分析其原因可能是在质谱测定中， 甲醇、乙醇提取出的极性成分对雷公藤甲素的电离效率影响较大，因此本发明 在样品前处理中首先加入水，将样品浸于70℃～90℃水浴中放置，去除大极性成 分的干扰；其次，本发明通过对比研究发现，在经过水浴中放置后，二氯甲烷 提取效率过低，乙酸乙酯提取效果比三氯甲烷稍高，考虑到三氯甲烷属于致癌、 易制毒、易污染类溶剂，而且乙酸乙酯在萃取过程中更便于操作和获取，且毒 性较小，本发明选择乙酸乙酯作为提取溶剂更符合应用需求；最后，在乙酸乙 酯提取液中加入碱液萃取，可有效除去乙酸乙酯提取液中的大量小极性黄酮类 成分的干扰，纯化目标成分。上述前处理方法，使大、小极性干扰成分去除更 为干净，且采用乙酸乙酯替代了现有的二氯甲烷、三氯甲烷等有毒、易污染的 试剂，不需要大量消耗致癌物溶剂，降低了检测工作中的风险，而且对实验人 员和环境的安全性也有大的提升。而且，简化了中药制剂样品的前处理过程， 也避免了拌样与上柱等谨慎操作处理，避免了复杂的操作流程造成成分损失的 困扰，还缩短了检测时间，原局颁标准方法需要两天的前处理时间，本发明的 前处理过程仅需要半天。
38.2、本发明经分析发现，紫外检测器的检测波长接近可见光(220nm)，易受 溶剂的影响，只能在特定时间段内固定流动相比例洗脱进行测定。而且紫外检 测器是检测成分对紫外光的吸收度，而在中药制剂中常有相似极性的成分在同 一保留时间出峰，会对检测造成干扰，如出现肩峰。相比于采用紫外检测器， 质谱检测器在检测本发明中药制剂的效果更优，质谱可以捕捉相应成分分子量 的信号，色谱峰整体干净，可以有效排除其它成分的干扰，减少前处理纯化的 复杂性，检测结果稳定。而且，质谱的检测限比紫外检测器低，雷公藤甲素在 中药制剂中属于微量毒/效物质，使用灵敏度更高的质谱可以有效实现毒/效成分 精准控制的原则。本发明经过对比原局颁标准方法、传统大型质谱(例如三重 四极杆质谱qqq-ms)方法、qda方法后发现，在大型质谱通用的mrm模式 下检测出的雷公藤甲素的含量仅为在原局颁标准方法的测定含量的50％左右(3 批样品)，远低于目前标准规定含量
限度(17.5～32.5μg/粒)，推测其可能的原因 为雷公藤甲素自身裂解规律受限，子离子定量模式下测定不准确。改用大型质 谱的sim模式后，与在qda的sir中检测含量基本一致，均为原局颁标准方法 的测定含量的80％左右(2批样品)，因此本发明选择扫描模式为sim或sir。 在sir模式(qda)或sim模式(qqq-ms)下只捕捉相应分子量的信号，色 谱峰整体干净，无干扰，且一般情况下流动相比例变动对色谱峰影响不大，因 此可在梯度比例洗脱时进行测定。
39.本发明测定方法比目前现有的检测手法具有高精密度、高准确性、简单方 便的优势，并且具有广泛的适用性。
附图说明
40.图1为一种传统方法的昆仙胶囊含量测定色谱图；
41.图2为一种传统方法的昆明山海棠雷公藤甲素含量测定色谱图；
42.图3为本发明一个实施例的昆仙胶囊中雷公藤甲素专属性色谱图；
43.图4为本发明一个实施例的雷公藤甲素标准曲线图。
具体实施方式
44.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不 同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方 式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
45.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术 领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术 语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
46.术语
47.除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
48.本发明中，所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个 或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有 的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多 个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
49.本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有
”ꢀ
或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如 无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
50.本发明中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并 不构成对本发明保护范围的限制。
51.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技 术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
52.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
53.本发明中，涉及到百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相 混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
54.本发明中，涉及到百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度， 指添加
成分在添加该成分后的体系中的占比。
55.本发明中，涉及到温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许 在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围 内进行波动。
56.本发明中，涉及到质量，不仅仅是指实际质量，还包括了测量误差范围内 的质量。例如每0.4g所述待测中药制剂样品，包括了0.4g测量误差范围的全部 质量。
57.(1)目前雷公藤甲素含量测定方法的样品前处理多采用二氯甲烷或三氯甲 烷进行提取，二氯甲烷、三氯甲烷均属致癌物并被列入有毒有害水污染物名录， 长期使用会对实验人员的健康存在一定损害，也会有环境污染的隐患，因此无 法在实际中应用于中药制剂(例如昆仙胶囊)大批量生产过程中的质量控制， 需要寻求同等提取效率，但更为环保健康的提取方法和提取试剂。(2)目前雷 公藤甲素含量测定方法的样品前处理多采用硅胶/硅胶-氧化铝柱进行柱分离纯 化，往往伴有工序繁琐、溶剂消耗大的问题。此外昆仙胶囊中雷公藤甲素为微 量成分(10ppm)，也存在因操作复杂导致的含量测定波动较大等问题，不能实 现毒/效成分的精准控制，需要对样品前处理过程进行简化，尽量减少因人为操 作造成的目标成分损失。(3)对于雷公藤属药材中雷公藤甲素检测的方法通常 采用高效液相紫外检测器进行检测，本发明经过分析认为，紫外检测器是检测 成分对紫外的吸收，检测波长接近可见光(220nm)，易受到溶剂影响，同时在 中药制剂的测定中常有相似极性的成分在同一保留时间出峰，会对检测造成干 扰，需要开发可行的质谱法检测方法。(4)本发明经过对比研究发现，在三重 四级杆大型质谱通用的mrm模式下，用于检测昆仙胶囊中雷公藤甲素(10ppm) 的含量远低于目前局颁标准中规定的含量限度(17.5～32.5μg/粒)，分析其可能的 原因为离子在经过大型质谱四级杆中强度衰减，含量有损失。说明适用于生物 样品中痕量检测(10ppt)的大型质谱通用的mrm模式并不适用于昆仙胶囊中 雷公藤甲素的测定，需要开发能收集到全面稳定质谱信息的质谱方法。
58.实验材料
59.1.1实验仪器
60.waters acquity arc hplc液相系统，waters acquity qda检测器均来自美 国沃特世科技有限公司；安捷伦1200lc高效液相仪，安捷伦6410b三重四级 杆质谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；xpr 0.26/a百万分之一电子天平(瑞 士梅特勒-托利多公司)、sartorius bs110s万分之一电子天平、tgl-15b离心 机(上海安亭科学仪器厂)、milli-q reference纯水机(法国millipore)、sb-5200dt超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
61.1.2实验试剂与药品
62.雷公藤甲素标准品(批号：111567-202005，中国食品药品检定研究院，纯 度99.6％)，色谱级甲醇(德国merck)、超纯水、色谱级甲酸(纯度》98％， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，其余试剂为分析纯。
63.昆仙胶囊样品及昆仙胶囊(昆明山海棠阴性)样品全部来自广州白云山陈 李济药厂有限公司。
64.2研究内容
65.2.1昆仙胶囊中雷公藤甲素qda检测方法
66.样品处理：取昆仙胶囊内容物约0.4g，精密称定，置50ml锥形瓶中，加 入纯水5ml，
80℃水浴5min，量取乙酸乙酯25ml，超声提取45min，转移 至离心管中，6000r/min离心10分钟，将全部乙酸乙酯层(有机相)转移至分 液漏斗中(尽量吸取全部乙酸乙酯层，可含少量水层)，加入20ml质量分数 为3％的naoh水溶液，摇匀萃取，静置分层，去除水相，此步骤重复2次，去 除水相后加入20ml纯水摇匀萃取，静置分层，将全部乙酸乙酯层收集至150ml 圆底烧瓶，65℃水浴减压干燥，甲醇定容至5ml容量瓶，0.22μm微孔滤膜过 滤后取2μl注入高效液相-单四级杆质谱联用仪(hplc-qda)中进行含量测定。
67.标准溶液的配置：精密称取雷公藤甲素标准品4mg，置于25ml容量瓶中， 加入甲醇充分溶解并稀释至刻度作为储备液，储存于4℃冰箱中。
68.液相条件：采用waters acquity arc hplc液相系统，waters acquity qda 检测器，waters xselect hss t3(3.0
×
150mm，2.5μm)色谱柱，柱温35℃， 进样量为2μl，流速0.4ml
·
min-1
，以甲醇(a)-体积分数为0.1％的甲酸水(b) 作为流动相进行梯度洗脱，具体梯度见表1。
69.质谱条件：采用电喷雾离子源(esi源)，离子源温度(probe)为600℃； 正离子检测，单离子监测(sir)扫描模式；毛细管电压0.9kv，锥孔电压15v， 以m/z 361.16(雷公藤甲素)为测定离子。
70.计算方法：
71.c表示雷公藤甲素测得浓度(μg/ml)；w表示称样量(g)；每一粒昆仙 胶囊的质量为0.3g。
72.表1 流动相梯度洗脱比例
[0073][0074]
2.2样品前处理方法考察
[0075]
2.2.1提取试剂考察
[0076]
由于中药制剂处方成分复杂，对于目标成分雷公藤甲素干扰较大，本研究 前期预实验中直接采取甲醇、乙醇对雷公藤甲素进行提取，发现其加样回收试 验的回收率仅为52％-66％，分析其原因可能是质谱测定中，甲醇、乙醇提取出 的极性成分对雷公藤甲素的电离效率影响较大，因此本发明在样品提取前，采 用5ml纯水，80℃水浴5min去除极性成分的干扰。
[0077]
为选出最佳的提取溶剂，分别对三氯甲烷、二氯甲烷和乙酸乙酯进行考察， 取昆仙胶囊内容物(批号：k31013)0.4g，每组平行制备2份，精密称定，按
ꢀ“
2.1”项下制备供试品并进样分析。实验结果见表2。结果表明，对于雷公藤 甲素的提取，二氯甲烷提取效率过低，乙酸乙酯提取效果比三氯甲烷稍高，且 乙酸乙酯毒性较小，此外，乙酸乙酯提取离心后，乙酸乙酯层与粉末沉淀完全 隔离，转移操作方便，不会因吸取到其他样品粉末而造成误差。因此选择乙酸 乙酯作为提取溶剂。
[0078]
表2 溶剂选择实验结果
[0079][0080][0081]
2.2.2料液比考察
[0082]
为确定提取料液比，取昆仙胶囊内容物(批号：k31013)0.4g，精密称定， 置于50或150ml锥形瓶中，分别加入纯水2、5、8、10、15ml，80℃水浴 5min，分别精密加入提取溶剂乙酸乙酯10、25、40、50、75ml(保持水与乙 酸乙酯的体积不变)，每组平行制备2份，按“2.1”项下制备供试品并进样分 析。实验结果见表3。实验结果表明，当纯水的使用量为5ml、乙酸乙酯使用量 为25ml时，所测得雷公藤甲素含量最高，参照同一比例增加水和乙酸乙酯使 用量并未显著增加样品的测定浓度，因此，当取样量为0.4g，加入5ml水和25 ml乙酸乙酯时提取效果最佳。
[0083]
表3 料液比实验结果
[0084][0085]
2.2.3超声处理时间考察
[0086]
取昆仙胶囊内容物(批号：k31013)0.4g，精密称定，置于50ml锥形瓶 中，加入纯水
5ml，80℃水浴5min，精密加入乙酸乙酯25ml，分别超声提 取15、30、45、60、75min，每组平行制备2份，按“2.1”项下制备供试品并 进样分析。实验结果见表4。实验结果表明，随着提取时间的增加，提取含量越 高，30min以下对目标成分含量提取效率低，当超声时间大于45分钟后，延长 超声时间并未对样品含量产生较大变化，因此，应选择超声45分钟作为前处理 的最优提取时间。
[0087]
表4 超声处理时间实验结果
[0088][0089]
2.2.4萃取体积单因素考察
[0090]
样品处理：取昆仙胶囊内容物(批号：k31013)0.4g，精密称定，置于50 ml锥形瓶中，加入纯水5ml，80℃水浴5min，精密加入乙酸乙酯25ml， 超声提取45min，转移至离心管中，6000r/min离心10分钟，将乙酸乙酯层(有 机相)转移至分液漏斗中(可含少量水层)，分别加入10、20、30、50ml质 量分数为3％的naoh水溶液，摇匀萃取，静置分层，去除水相，此步骤重复2 次，再加入20ml纯水摇匀萃取，静置分层，将全部乙酸乙酯层全部转移至蒸 发皿中，65℃水浴减压干燥，甲醇定容至5ml容量瓶，每组平行制备2份， 按“2.1”项下进样分析。实验结果见表5。从实验结果可知，当萃取体积在10～30 ml范围内，萃取体积对样品甲素含量影响并不显著，当萃取体积为20ml时， 样品所测得的甲素含量最高，因此选择20ml质量分数为3％的naoh水溶液作 为前处理萃取操作最佳体积。
[0091]
表5 3％naoh萃取体积实验结果
[0092][0093]
2.2.5萃取次数单因素考察
[0094]
样品处理：取昆仙胶囊内容物(批号：k31013)0.4g，精密称定，置于50 ml锥形瓶中，加入纯水5ml，80℃水浴5min，精密加入乙酸乙酯25ml， 超声提取45min，转移至离心管中，6000r/min离心10分钟，将乙酸乙酯层(有 机相)转移至分液漏斗中(可含少量水层)，加入20ml质量分数为3％的naoh 水溶液，摇匀萃取，静置分层，去除下层水相，此步骤重复1、2、3次，去除 水相，再加入20ml纯水摇匀萃取，静置分层，将全部乙酸乙酯层全部转移至 蒸发皿中，65℃水浴减压干燥，甲醇定容至5ml容量瓶，每组平行制备2份， 按“2.1”项下进样分析。实验结果见表6。由结果可知，萃取1次与萃取2次 对甲素含量影响不大，萃取3次后样品含量显著降低，提示萃取次数大于2次， 容易在操作过程中造成损失。萃取1次后，样品溶液颜色较深，萃取2次后， 样品溶液基本无颜色，表明虽然对样品含量测定结果影响不大，但萃取1次并 未能完全去除样品中干扰成分，因此选择2次作为萃取次数最为合适。
[0095]
表6 萃取次数实验结果
[0096][0097]
2.3质谱检测器和监测模式考察
[0098]
2.3.1三重四级杆质谱(mrm模式)对3个批次昆仙胶囊内容物雷公藤甲 素含量进行测定
[0099]
取3个不同批次(k31012，k31013，l31001)昆仙胶囊内容物0.4g，每个 批次3份，精密称定，置50ml锥形瓶中，以下列三种方法进行测定：
[0100]
(1)按“2.1”项下制备供试品并用qda进行检测，记录平均含量；
[0101]
(2)取同一样品按局颁标准含量测定方法制备供试品并用紫外检测器检 测，具体如下：记录平均含量；
[0102]
取3个批次昆仙胶囊，倾出内容物，研细(过8号筛)，精密称取细粉0.7g， 置100ml锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(300w，40khz) 15分钟，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，密塞，静置过夜。 精密吸取上清液25ml于蒸发皿中，置60℃水浴蒸至约3ml，加入硅胶(柱层 析用，200～300目)-中性氧化铝(柱层析用，200～300目)(1:1)2.5g，拌匀，60℃水浴上蒸发甲醇，同时研细，充分蒸干甲醇，干法上硅胶(规格同前述)
‑ꢀ
中性氧化铝(规格同前述)(1:1)2.5g的混合柱(内径2cm)。用1,2-二氯乙 烷70ml洗脱，弃去洗脱液，继用含1.5％乙醇的1,2-二氯乙烷70ml洗脱，收集 洗脱液，60℃减压回收溶剂至干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至 刻度，摇匀，滤过，即得。取10μl注入agilent 1200高效液相色谱仪进行检 测，采用agilent zorbax eclipse xdb-c18(4.6
×
250mm，5μm)色谱柱；流动 相甲醇-5％异丙醇的水溶液，检测波长为220nm，流速为0.8ml/min，柱温为30℃， 洗脱梯度0～25min，20％甲醇；25～30min，20～95％甲醇；30～50min，5％甲醇。
[0103]
(3)同一样品再经安捷伦1200lc高效液相仪/6410b三重四级杆质谱仪按 如下方法进行测定，记录平均含量。
[0104]
液相条件：采用agilent proshell hph(2.1
×
100mm，2.7μm)色谱柱，流 速0.35ml/min，进样量2μl。使用乙腈(a)-体积分数为0.1％的甲酸水(b) 作为流动相，梯度洗脱，具体梯度见表7：
[0105]
表7 流动相梯度洗脱比例
[0106][0107]
质谱条件：离子源为电喷雾(esi)离子源，正离子电离模式，干燥器(n2) 温度350
℃，干燥器(n2)流量10.00l/min，电喷雾电压4000v，扫描模式为 多反应监测(mrm)扫描模式，结果见表8。
[0108]
表8 雷公藤甲素质谱分析参数
[0109][0110]
注：“*代表定量离子对，子离子为43.1时，峰响应高，但色谱分离效果较差。
[0111]
3批昆仙胶囊中雷公藤甲素含量如表9所示，同一样品在三重四级杆质谱 mrm模式下检测出的含量约为在原局颁标准方法的测定含量的49-58％，推测 由于雷公藤甲素离子在经过三重四级杆质谱后，强度变弱，无法实现完全定量。
[0112]
表9 3个批次昆仙胶囊在不同测定方法下的含量测定结果
[0113][0114]
2.3.2三重四级杆质谱(sim模式)对2个批次昆仙胶囊内容物雷公藤甲素 含量进行测定结果对比
[0115]
取2个不同批次(k31014，l31002)昆仙胶囊内容物0.4g，每个批次3份， 精密称定，分别置50ml锥形瓶中，以下列三种方法进行测定：
[0116]
(1)按“2.1”项下制备供试品并用qda进行检测，记录平均含量；
[0117]
(2)按局颁标准含量测定方法制备供试品并用紫外检测器检测，记录平均 含量；
[0118]
(3)同一样品再经安捷伦1200lc高效液相仪/6470b三重四级杆质谱仪按 如下方法进行测定，记录平均含量。
[0119]
液相条件：同“2.5.1”项下。
[0120]
质谱条件：离子源为电喷雾(esi)离子源，正离子电离模式，干燥器(n2) 温度350℃，干燥器(n2)流量10.00l/min，电喷雾电压900v，ms2扫描模 式单离子监测(sim)扫描模式，fragmentor为0v，毛细管电压0.9kv，检测 离子为m/z 361.16。
[0121]
2批昆仙胶囊中雷公藤甲素含量如表10所示，同一样品在三重四级杆质谱 sim模式下检测出的含量与在qda中检测含量基本一致，均为原标准方法测定 结果的80％左右，因此可以说明子离子定量不适用于雷公藤甲素的含量测定， sim模式更为适合，但是三重四级杆等大型质谱的优势在于子离子定量模式， 若仅仅只是采用单离子扫描模式，选择单四级杆质谱会有更好的实际应用意义。
[0122]
表10 2个批次昆仙胶囊在三重四级杆质谱sim模式下的含量测定结果
[0123][0124]
2.4昆仙胶囊qda检测方法方法学考察
[0125]
2.4.1专属性研究
[0126]
处理方法：取昆仙胶囊(批号：k31013)、昆仙胶囊(昆明山海棠阴性) 内容物各2份0.4g，精密称定，置于50ml锥形瓶中，另取1个锥形瓶不加任 何样品，作为空白对照。全部样品均按“2.1”项下制备供试品并进样分析，再 将“2.1”项下的雷公藤甲素标准品储备液进样分析，记录谱图，如图3所示。
[0127]
从图3可知，在雷公藤甲素色谱峰相应位置上，昆仙胶囊色谱图中出现与 雷公藤甲素标准品色谱图中保留时间一致(tr＝9.39min)的色谱峰，无昆明山 海棠的阴性样品对测定无干扰。表明该测定方法专属性强。
[0128]
2.4.2标准曲线的制定
[0129]
取雷公藤甲素标准品储备液，加入甲醇分别稀释成0.1375、0.55、2.2、4.4、 8.8、17.6μg
·
ml-1
的标准品溶液，0.22μm微孔滤膜过滤后，取2μl注入液相色 谱仪中进行测定，对相应的色谱峰进行积分并计算标准曲线，标准曲线如图4。 以标准品浓度x(μg
·
ml-1
)为横坐标，以峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，求 得雷公藤甲素回归方程为y＝1.93
×
106x+8.76
×
105(r2＝0.998)。结果表明，雷公 藤甲素的浓度在0.1375～17.6000μg
·
ml-1
之间与峰面积值呈现良好的线性关系。
[0130]
2.4.3准确度实验
[0131]
样品处理：取昆仙胶囊颗粒(批号：k31013)内容物约0.4g，分别以当前 取样含量的1:0.5,1:1,1:1.5的比例加入标准品(标准品浓度分别为13.81、27.62、 55.24μg/ml)，全部样品均按“2.1”项下制备供试品并进样分析，记录峰面积， 计算雷公藤甲素含量，每个重复3次。计算平均回收率及rsd值。9次测定实 验结果如表11。由于雷公藤甲素为微量成分，根据2020版《中国药典》规定， 待测成分含量为10μg/g(10ppm)，回收率限度在80％～115％，即实验结果可 达到要求。
[0132]
表11 昆仙胶囊加样回收实验结果
[0133]
[0134][0135]
2.4.4精密度实验
[0136]
取制备雷公藤甲素标准品(8.8μg/ml)，按“2.1”项下色谱条件进样分析， 连续测定6次，记录峰面积，计算rsd值。结果如表12。rsd《2％，结果表 明仪器精密度良好。
[0137]
表12 精密度实验结果
[0138][0139]
2.4.5重复性实验
[0140]
样品处理：取昆仙胶囊(批号：k31013)内容物0.4g，按“2.1”项下制备 6份供试品并进样分析，记录峰面积，计算各雷公藤甲素含量及rsd值。结果 见表13。根据2020版《中国药典》规定，待测成分含量为10μg/g(ppm)，重 复性(同一个人操作)rsd值可接受范围为6％，本实验结果重复性为2.7％， 表明雷公藤甲素含量测定方法重复性好。
[0141]
表13 昆仙胶囊重复性实验结果
[0142][0143][0144]
2.4.6稳定性实验
[0145]
取雷公藤甲素标准品(8.8μg/ml)，按“2.1”项下条件进样分析，在0、2、4、 8、12、24h分别进样测定，共6次，记录峰面积，计算rsd值。取昆仙胶囊(批 号：k31013)内容物约0.4g共2份，精密称定“2.1”项下制备供试品并进样分析， 在0、2、4、8、12h分别进样测定，共6次，记录峰面积，计算rsd值。结果 见表14。结果表明，在12h内，雷公藤甲素标准品计算rsd为1.10％，昆仙胶 囊供试品计算rsd值为1.46％，结果rsd《2％。表明12h内标准品和供试品稳 定性良好。
[0146]
表14 昆仙胶囊稳定性实验结果
[0147][0148]
2.5昆仙胶囊qda含量测定方法的应用
[0149]
2.5.1 qda检测方法对3个批次昆仙胶囊内容物雷公藤甲素含量进行测定
[0150]
取3个不同批次昆仙胶囊(l31001、l31002、l31003)内容物0.4g，每个 批次3份，精密称定，置50ml锥形瓶中，按“2.1”项下制备供试品并进样分 析，记录峰面积，计算雷公藤甲素含量及rsd值。结果见表15，平均含量在18.70～22.24μg/粒之间，rsd值均小于2％，表明测定方法可稳定用于多批次昆 仙胶囊中雷公藤甲素含量的测定。
[0151]
表15 3个批次昆仙胶囊含量测定结果
[0152][0153]
2.5.2使用不同的含量测定方法对15个批次昆仙胶囊进行含量测定结果比 较
[0154]
取15批昆仙胶囊，分别采用方法1和方法2对其中的雷公藤甲素含量进行 测定，每批样品测定两次，记录测定含量平均值，结果见表16。结果显示，方 法1(qda测定方法)测定雷公藤甲素含量为方法2(原局颁标准方法)含量的 79％～105％之间，方法1测定值平均为方法2测定值的90％。
[0155]
方法1(qda测定方法)：取15个批次昆仙胶囊内容物0.4g，每个批次2 份，精密称定，按“2.1”项下制备供试品并进样分析，记录峰面积，计算雷公藤 甲素含量。
[0156]
方法2(原局颁标准方法)：同“2.3.1”项下方法(2)。
[0157]
表16 不同方法测定15个批次昆仙胶囊中雷公藤甲素含量
[0158][0159][0160]
3结果分析
[0161]
3.1样品前处理方法的优化
[0162]
由于中药制剂处方存在复方干扰情况，对于目标成分雷公藤甲素干扰较大。 首先，本发明在前期预实验中直接采取甲醇、乙醇进行成分提取，发现其加样 回收试验的回收率仅为52％～66％，分析其原因可能是在质谱测定中，甲醇、乙 醇提取出的极性成分对雷公藤甲素的电离效率影响较大，因此本发明在样品提 取前，首先加入水，于70℃～90℃水浴中放置，去除大极性成分的干扰。
[0163]
对于中药制剂中雷公藤甲素的提取和纯化，首先，本发明分别考察了二氯 甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯的提取效率，结果发现，经过水浴放置后二氯甲烷 提取效率过低，乙酸乙酯提取效果比三氯甲烷稍高。考虑到三氯甲烷属于2b类 致癌物并被列入有毒有害水污染物名录，受到《易制毒化学品管理条例》约束 由公安部门管制，获取难度大，长期使用会对实验人员的健康存在一定损害， 也会有环境污染的隐患，实验过程中由于其密度偏大，也存在离心后有机相处 于粉末沉淀与水相中间，在转移的过程中不利于操作；而乙酸乙酯提取效果比 三氯甲烷稍高，毒性较小，且离心后乙酸乙酯有机相与粉末沉淀完全隔离，转 移操作方便，不会因吸取到其他样品粉末而造成误差，因此选择乙酸乙酯作为 提取溶剂。其次，通过考察料液比，发现当取样量为0.4g，70℃～90℃的水与乙 酸乙酯的体积比为1:(4～6)，加入25ml乙酸乙酯时提取效果最佳；还分别考 察了15、30、45、60、75min的超声提取时间后的提取效果，发现当超声时间 大于45分钟后，延长超声时间并未对样品含量产生较大变化，因此，选择超声 45分钟作为前处理的最优提取时间；为了有效去除小极性
黄酮类成分，本发明 考察了碱液在不同的萃取体积(10、20、30、50ml)和不同萃取次数(1、2、 3次)的效果，结果发现，采用质量分数为3％的naoh水溶液20ml萃取2 次，可以有效除去小极性黄酮类成分的干扰。
[0164]
3.2质谱条件的选择
[0165]
针对质谱检测器的选择，本发明分别考察了三重四级杆质谱大型质谱 (qqq-ms)和qda单四级杆质谱测定昆仙胶囊中雷公藤甲素的含量，并与原 局颁标准方法的测定含量相对比，结果显示，同一样品在三重四级杆质谱mrm 模式下检测出的含量约为在原局颁标准方法的测定含量的49-58％，推测其可能 的原因为雷公藤甲素的裂解规律受限，子离子定量模式下测定不准确。在三重 四级杆质谱sim模式下检测出的含量与在qda中检测含量基本一致，均为原局 颁标准方法的测定含量的80％左右，因此可以说明子离子定量不适用于中药制 剂中雷公藤甲素的含量测定，sim模式更为适合，但是三重四级杆等大型质谱 的优势在于子离子定量模式，若仅仅只是采用单离子扫描模式，选择单四级杆 质谱会有更好的实际应用意义。
[0166]
3.3含量测定结果分析
[0167]
由于雷公藤甲素为微量成分，根据2020版《中国药典》分析方法验证指导 原则中规定，待测成分含量为10μg/g(10ppm)，回收率限度在80％～115％， 重复性(同一个人操作)rsd值可接受范围为6％。在本发明中qda测定方法 中，雷公藤甲素的浓度在0.1375～17.6000μg
·
ml-1
之间与峰面积值呈现良好的线 性关系(r2＝0.998)，加样回收率为89.55％(rsd＝4.86％)，实验结果重复性为 2.7％，表明qda方法测定昆仙胶囊中雷公藤甲素准确性和重复性强，在12h内 昆仙胶囊中雷公藤甲素稳定(rsd＝1.46％)。
[0168]
通过对比qda测定方法与原局颁标准方法对15批昆仙胶囊进行含量测定， 结果显示，qda测定方法测定雷公藤甲素含量为原局颁标准方法测定含量的 79％～105％之间，平均值为90％。因此可以直接用于昆仙胶囊的质量控制。
[0169]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对 上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技 术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0170]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。