基于纳米金颗粒（AuNPs）适配体偶联比色和人工智能算法检测母乳中的阿莫西林

基于纳米金颗粒（aunps）适配体偶联比色和人工智能算法检测母乳中的阿莫西林
技术领域
1.本发明涉及一种基于纳米金颗粒(aunps)适配体显色法联合智能手机检测母乳中残留阿莫西林的方法。


背景技术：

2.母乳是一种重要的婴儿所需的天然食物。母乳内含有丰富的糖类、蛋白质、脂肪以及各种微量元素和天然抗体，这对婴儿的生长发育起着至关紧要的作用。母乳不仅仅能为婴儿提供营养物质和能量，母乳中的各种有效物质更是能为离开母体的婴儿提供一层天然的“保护罩”。进入21世纪以来，抗生素滥用已成为全世界面临的难题，其带来的后果已经严重危及人们的生命健康。抗生素耐药已经在临床中引起高度重视，随着近年来抗生素使用种类和用量的增多，产生耐药的抗生素种类和耐药性也在逐渐增加。由于婴儿群体的特殊性，哺乳期母亲接受抗生素治疗从而导致母乳中抗生素的存在尤其值得人们注意。母乳中的抗生素会对母乳微生物群和婴儿肠道的正常菌群产生影响，且已有实验证明，哺乳动物生命早期使用抗生素会增强其对过敏性哮喘的易感性。为了尽量避免婴儿过早接触抗生素而增加产生抗生素耐药的可能性，推广一种对母乳中抗生素含量的检测方法已迫在眉睫。近年来，一些检测抗生素残留的方法已经出现，如荧光法、酶联免疫吸附实验、电化学分析、高效液相色谱法等方法，这些方法虽然灵敏度较高，但大都存在操作复杂、价格高昂等缺点。阿莫西林是目前最常使用的抗生素药物之一，对于母乳中的阿莫西林含量，目前还尚鲜有人研究且没有一种方便快捷的检测方法。
3.纳米金颗粒(aunps)由于其化学和生物特性而备受关注，当纳米金颗粒在溶液中呈分散状态时为深紫红色，聚集时则呈蓝紫色，这一特性使得人们将其作为研究的一种重要工具。适配体(apt)是通过指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,selex)过程选择的特定单链寡核苷酸，与抗体等传统识别分子相比，适配体具有合成简单、易修饰、化学稳定性好、柔韧性高等特点。利用aunps制作比色适配传感器因其制备容易、操作简单而逐渐受到人们的欢迎，当存在靶标药物时，在比色传感器的作用下，溶液颜色会发生相应改变。
4.受上述工作启发，在本研究中，通过图像采集设备对溶液颜色进行采集，将采集的图象传输至智能手机并分析图像rgb值，可实现对药物浓度定量检测的目标。


技术实现要素：

5.目的是建立一种基于纳米金颗粒(aunps)适配体显色法联合智能手机检测母乳中的阿莫西林的方法。
6.具体技术方案如下：
7.一种基于纳米金颗粒(aunps)适配体显色法联合智能手机检测母乳中的阿莫西林的方法，其制备过程包括以下步骤：
8.(1)、纳米金颗粒(aunps)的制备将所有需用到的器皿以王水浸润约1小时以上，再将王水倒入回收烧瓶中，以大量超纯水(18.2mωcm，25℃)将器皿冲洗干净并烘干。称取0.0824g氯金酸粉末，溶解于200ml超纯水中，混合均匀形成1mmol/l氯金酸溶液，称取0.2282g柠檬酸三钠粉末，溶解于20ml 超纯水中，混合均匀形成38.8mmol/l柠檬酸三钠溶液。将装有氯金酸溶液的锥形瓶置于电磁搅拌加热器上，开启电磁加热搅拌器加热并搅拌，加热至溶液沸腾。保持氯金酸溶液在剧烈沸腾与均匀搅拌下，将20ml 柠檬酸三钠溶液快速加入锥形瓶，反应溶液从淡黄色迅速变为黑色，然后转变为深酒红色。持续搅拌加热至溶液沸腾至少20分钟后，关闭加热电源，再继续搅拌冷却15分钟。样品冷却后，将其转移至干净的深色样品瓶中置于4℃冰箱保存以备后续使用。
9.(2)、适配体制备将装有hplc纯化的适配体的ep管以4000rpm离心5分钟，在此ep管中加入超纯水配制成100μmol/l的溶液。
10.(3)、纳米金颗粒(aunps)与适配体偶联将上述制备的适配体溶液稀释至100nmol/l，加入与适配体溶液体积比为2:1的aunps溶液，振荡混匀15秒，室温孵育15分钟。
11.(4)、药物溶液与aunps适配体偶联溶液反应在96孔板中加入100μlaunps适配体偶联溶液，再分别加入100μl各浓度阿莫西林溶液，振荡混匀10分钟后，加入盐溶液。
12.(5)、结果检测将96孔板放置于扫描仪上，经扫描后得到颜色变化图片结果，将图像传输至智能手机并分析图像的rgb值变化。
13.(6)、对母乳样本进行检测。
14.所述步骤(1)中所有用于制备aunps的器皿都需经王水浸泡1个小时以上，以去除所有可能有影响的离子，再用大量超纯水彻底冲洗干净并烘干，需保证在制备过程中所使用的器皿和溶液不被污染。
15.所述步骤(1)中纳米金颗粒(aunps)直径约为18-25nm，浓度为17nmol/l，纳米金颗粒分散时在 520nm左右处有最高吸收峰，聚集时在620nm处左右有最高吸收峰。
16.所述步骤(2)中的适配体均采用hplc方式纯化。
17.所述步骤(2)中的适配体序列为5
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ttagttggggttcagttgg-3’。
18.所述步骤(2)中加入装有适配体粉末的ep管中的超纯水为55μl，制备成100μmol/l的溶液。
19.所述步骤(3)中用超纯水将适配体溶液稀释为100nmol/l。
20.所述步骤(3)的反应液中，aunps浓度为11.3nmol/l，适配体浓度为33.3nmol/l。
21.所述步骤(3)中适配体对纳米金颗粒的保护作用可用
22.所述步骤(4)中药物溶液用超纯水配制。
23.所述步骤(4)中盐溶液为氯化钠溶液。
24.所述步骤(4)中加入的盐溶液浓度为500mmol/l。
25.所述步骤(4)中反应液成分包括aunps、适配体、阿莫西林、氯化钠。
26.所述步骤(5)中扫描仪品牌为canon，dpi值设置为1200。
27.所述步骤(6)中对母乳样本检测前需加三氯乙酸对母乳进行前处理以去除蛋白和脂质。
28.本发明基于纳米金颗粒(aunps)适配体显色法，利用适配体特异性结合靶标的特性，使用纳米金颗粒，当没有适配体存在时，纳米金颗粒遇到高浓度的盐溶液会产生聚集，
颜色从深酒红色变为蓝紫色；当有适配体通过范德华力与纳米金颗粒结合时，会对纳米金颗粒产生保护作用防止其遇盐聚集，当溶液中存在阿莫西林时，不同浓度的阿莫西林会与适配体产生不同程度的结合，导致适配体对纳米金颗粒的保护作用产生不同程度的减弱，纳米金颗粒会重新产生聚集；不同浓度的阿莫西林引起纳米金颗粒聚集的程度不同，从而产生不同的颜色变化，通过采集颜色变化图像并传输至智能手机，智能手机分析图像的rgb值变化，可实现阿莫西林的快速检测。
29.本发明利用适配体和纳米金颗粒偶联对母乳中的阿莫西林进行检测，使得最后溶液的颜色发生改变，采集颜色变化图像，图像结果的分析运用智能手机进行处理。
30.与现有技术相比，本方法的优点在于：
31.(1)利用适配体特异性识别母乳中的阿莫西林。与抗体相比，适配体合成简单、易修饰、化学稳定性好、柔韧性高，可在较短时间内与靶标结合。
32.(2)利用纳米金颗粒与适配体偶联，母乳中阿莫西林的浓度通过纳米金聚集所产生的颜色变化来展现，具有灵敏度高、特异性好、肉眼可观察等优点。
33.(3)颜色变化通过图像采集设备收集，运用智能手机对数据进行处理，与传统方法相比，具有数据包容性更高、误差更小、准确性更高等优点。
34.(4)本发明可快速简便测出母乳中阿莫西林的浓度，与其他检测方法相比，具有成本低廉、操作简单、安全等优点。
附图说明
35.图1为基于纳米金颗粒(aunps)适配体显色法联合智能手机检测母乳中的阿莫西林的方法示意图；
36.图2为纳米金颗粒分散和聚集状态的光谱扫描结果。
37.图3为不同浓度适配体对纳米金颗粒的保护作用。
38.图4加入不同浓度阿莫西林水溶液后溶液的颜色变化。
具体实施方式
39.下面通过具体实施例结合附图对本发明作进一步阐述。
40.实施例1基于纳米金颗粒(aunps)适配体显色法联合智能手机检测母乳中的阿莫西林
41.一种基于纳米金颗粒(aunps)适配体显色法联合智能手机检测母乳中的阿莫西林的方法，具体步骤如图1所示：
42.1、纳米金颗粒(aunps)的制备：
43.(1)实验前准备
44.多次实验证明，制备纳米金颗粒过程中，所用的器皿清洁程度至关重要。若器皿不够干净，含有其他杂质，会干扰纳米金颗粒的合成。所以将所有需用到的器皿以王水浸润约1小时以上，再将王水倒入回收烧瓶中，以大量超纯水(18.2mωcm，25℃)将器皿冲洗干净并烘干。
45.(2)具体制备步骤
46.称取0.0824g氯金酸粉末，溶解于200ml超纯水中，混合均匀形成1mmol/l氯金酸溶
液，称取0.2282g 柠檬酸三钠粉末，溶解于20ml超纯水中，混合均匀形成38.8mmol/l柠檬酸三钠溶液。将装有氯金酸溶液的锥形瓶置于电磁搅拌加热器上，开启电磁加热搅拌器加热并搅拌，加热至溶液沸腾。保持氯金酸溶液在剧烈沸腾与均匀搅拌下，将20ml柠檬酸三钠溶液快速加入锥形瓶，反应溶液从淡黄色迅速变为黑色，然后转变为深酒红色。持续搅拌加热至溶液沸腾至少20分钟后，关闭加热电源，再继续搅拌冷却15分钟。样品冷却后，将其转移至干净的深色样品瓶中置于4℃冰箱保存以备后续使用。如图2所示，纳米金颗粒分散时在520nm左右处有最高吸收峰，聚集时在620nm处左右有最高吸收峰。
47.2、阿莫西林适配体的制备：
48.(1)本发明所述的阿莫西林适配体序列为5
’‑
ttagttggggttcagttgg-3’，将装有hplc纯化的适配体的ep管以4000rpm离心5分钟，在此ep管中加入超纯水配制成100μmol/l的溶液。
49.(2)纳米金颗粒分散时在520nm左右处有最高吸收峰，聚集时在620nm处左右有最高吸收峰，适配体对纳米金颗粒的保护作用可用a620/a520表示。如图3所示，各浓度适配体对纳米金保护作用也不同。
50.3、药物溶液与aunps适配体偶联溶液反应：
51.(1)分别配制0、100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200、102400nmol/l 的阿莫西林溶液。
52.(2)在96孔板中加入100μlaunps-适配体偶联溶液，再分别加入100μl各浓度阿莫西林溶液，振荡混匀10分钟后，加入盐溶液。
53.4、结果检测：
54.将96孔板放置于扫描仪上，经扫描后得到颜色变化图片结果。如图4所示，不同浓度阿莫西林水溶液反应的颜色也不同。
55.5、母乳样本的检测。
56.对母乳样本检测前需加三氯乙酸对母乳进行前处理以去除蛋白和脂质后，将处理后的样本加到aunps
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适配体偶联溶液中，再加入盐溶液，观察颜色变化。