一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法及试剂盒与流程

1.本发明属于激素检测技术领域，具体地，涉及一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法及试剂盒。


背景技术：

2.醛固酮是最重要的盐皮质激素类固醇激素，在维持血管内体积和电解质平衡方面发挥重要作用。最近的研究发现醛固酮在其他方面也有着不容忽视的调节作用，如在上皮钠通道的表达、炎症、代谢综合征和高血压、胰岛素抵抗、心血管和肾纤维化等疾病。醛固酮的测定可用于心血管疾病、肝硬化、肾脏疾病(肾上腺偶发瘤、肾上腺癌、艾迪生病、先天性肾上腺增生、肾动脉狭窄和肾小管通道病等)、胰岛素抵抗和糖尿病等疾病的调查。醛固酮的准确测定对于原发性醛固酮增多症的筛查、诊断和亚型分类至关重要。原发性醛固酮增多症是一种严重且经常被漏诊的继发性高血压，主要由产生醛固酮的腺瘤或由双侧肾上腺增生引起的特发性醛固酮增多症引起，原发性醛固酮增多症患病率在3～32％之间，并且醛固酮分泌过高伴随着严重的心、脑等靶器官损伤，因此，原发性醛固酮增多症的早期识别至关重要，这依赖于醛固酮的准确测定。
3.血浆类固醇测定是肾上腺疾病临床评估的主要工具之一，血浆中游离醛固酮的含量很低，浓度在pmol/l级别，因此需要高灵敏的醛固酮测定方法。传统上，醛固酮的测定方法主要为放射免疫测定法和自动化化学发光免疫测定法，前处理方法较为简单但方法特异性不足，因为免疫测定容易受到交叉反应物(如其他类固醇激素及结构类似物)或其他干扰物质的干扰，容易造成检测结果的假阳性或假阴性，准确度和精密度较差，同时存在醛固酮竞争性免疫测定之间的方法依赖性偏差问题而导致不同免疫法的测定结果无法直接对比等问题，不利于临床实验的长期追踪以及相互比对。
4.目前关于体内测定游离醛固酮的文献报道较少，通常测定总醛固酮，一般采用气相色谱-质谱法或液相色谱-串联质谱法，其中气相色谱-质谱法方法在分析之前需要经过费时费力的衍生化前处理步骤。中国专利申请公布号cn113049697a，发明名称为“同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒”，公开了的方法包括样品前处理步骤和进样检测步骤，其中，样品前处理包括如下步骤：向血液样本中加入孵育缓冲液，孵育设定时间后，加入ph值调节剂，净化后，得处理液，将处理液氮气吹干，后采用流动相复溶，得待测液；所述ph值调节剂为甲酸、氨水或乙酸铵；采用液相色谱串联质谱方法进行检测。该方案优化前处理过程，采用10～100mm的乙酸铵为ph值调节剂，降低其在待测溶液中的质子化解离，提高其在spe处理中的回收率，提高了物质的检测灵敏度，但依然仅能对总醛固酮进行检测。
5.游离醛固酮更能代表体内具有生物活性醛固酮水平，醛固酮由肾上腺上皮细胞分泌，主要以蛋白结合态醛固酮和游离态醛固酮存在于血浆中，其中血浆游离态醛固酮的比例在25～40％之间，因此，要求分析方法的灵敏度极高。


技术实现要素：

6.1、要解决的问题
7.针对现有高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中醛固酮时，所需样品量大(≥500μl)，特异性不足，检出限难以突破导致的血浆中游离醛固酮检测领域处于空白的技术问题，本技术提供一种测定血浆中游离醛固酮含量的试剂盒，仅需300μl血浆即可对血浆中游离醛固酮进行检测。本技术还提供了一种检测血浆中游离醛固酮含量的方法，依次使用超滤法分离，液液萃取法提取，再通过高效液相色谱串联质谱检测，可使定量下限达到0.05pg/ml，测试结果的准确度和精密度较好，操作快速简便。
8.2、技术方案
9.为达到上述目的，提供的技术方案为：
10.本发明的一种测定血浆中游离醛固酮含量的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：校准品溶液；质控品溶液；内标准品溶液；替代基质；活化剂；缓冲液；萃取剂；流动相。
11.优选的，所述流动相为流动相溶剂包。
12.进一步的，所述校准品溶液和质控品溶液均为醛固酮溶于替代基质中；所述校准曲线工作液的浓度为0.2～5000pg/ml；所述质控品工作液的浓度范围为5～200ng/ml；所述内标准品溶液为氘代醛固酮溶于替代基质中，浓度为1ng/ml；所述替代基质为纯水、甲醇或乙腈中的一种或几种。
13.优选的，所述校准品溶液设置八个浓度梯度，为0.2、2、20、100、250、500、2500、5000pg/ml；所述质控品溶液设置三个浓度梯度，为5、50、200pg/ml。
14.优选的，所述替代基质为50％的甲醇水溶液。
15.进一步的，所述流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为0～0.5mm氟化铵水溶液，所述流动相b为甲醇溶液。
16.进一步的，所述萃取剂为甲基叔丁基醚、正己烷或乙酸乙酯中的一种或几种。
17.进一步的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液或碳酸盐缓冲液中的一种或几种；ph为7.4。
18.一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法，使用所述的试剂盒，包括以下步骤：
19.分别将校准曲线工作液和质控品工作液加入空白基质中，制备校准曲线样品和质控品样品；
20.分别将血浆样品、校准曲线样品和质控品样品超滤后，经液液萃取的步骤，制备上清液；
21.取上清液氮吹，用30～50％甲醇水溶液复溶后，进行高效液相色谱串联质谱测定，得到游离醛固酮的含量。
22.优选的，使用edta或肝素钠收集管采集患者血浆样本。
23.进一步的，所述高效液相色谱条件为：进样器温度：4～15℃；柱温：40～50℃；洗脱梯度如下：
[0024][0025]
所述流动相a：0～0.5mm氟化铵水溶液；
[0026]
所述流动相b：甲醇溶液。
[0027]
进一步的，所述质谱条件为：多反应监测参数如下：
[0028][0029]
扫描模式：多反应离子监测；电离模式：负离子模式；电喷雾毛细管电压：-2.5kv；锥孔气流速：150l/hr；锥孔电压：30v；离子源温度：150℃；脱溶剂气流速：800l/hr；脱溶剂温度：550℃。
[0030]
进一步的，所述超滤条件为分别在300～900μl缓冲液中加入300μl血浆样品、校准曲线样品或质控品，于37℃，2000g离心1小时。
[0031]
进一步的，所述萃取参数为取500μl超滤后的溶液加入30μl内标和800μl萃取液，涡旋3min，于4℃，12000g离心2min。
[0032]
优选的，离心后取上层液体，氮吹干后加入100μl的30％甲醇溶液复溶，涡旋1min，取90μl加入96孔板，待上机检测。
[0033]
3、有益效果
[0034]
采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
[0035]
(1)本发明的一种测定血浆中游离醛固酮含量的试剂盒，包括校准曲线溶液；质控品溶液；内标准品溶液；缓冲液；活化剂；萃取剂。样品不需要衍生化处理，相比现有技术，运用超滤和液液萃取的前处理方法结合超高效液相色谱串联质谱能快速简便准确的检测出人体血浆中含量极低的游离醛固酮。所需的样品体积仅为300μl，使用超滤分离游离的醛固酮，相比平衡透析操作更简便且耗时短，利用液液萃取对分析物的快速富集和提纯，操作简便。
[0036]
(2)本发明的一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法，将血浆样品超滤后，经液液萃取制备上清液，取上清液进行高效液相色谱串联质谱测定。经前处理后，通过色谱条件和质谱方法的优化，将分析析时间缩短至2.30min，增加分析的线性范围，提高分析的灵敏度，可达到0.05pg/ml的定量下限，测试结果的准确度和精密度较好。该技术可以用来检测病人血浆中游离醛固酮的含量来筛查醛固酮异常引起的相关疾病，通过超滤测定高生理活性的血浆游离醛固酮，更能反映体内的醛固酮生物效应，更为有效辅助临床诊断。方法的检出限(s/n≥3)和定量限(s/n≥10)分别为0.01pg/ml和0.05pg/ml，灵敏度高。样品在0.2～5000pg/ml的浓度范围内有良好的线性关系，相关系数r2》0.99，符合分析要求。采用加标回收的方法来评估正确度和回收率，加标回收率均在可接受范围(96.8
±
7.4％)内，符合分析要求。采用5、50、200pg/ml三种低、中、高浓度的质控品，6次重复进样来评估对批内精密度，
测试5天来评估批间精密度，批内和批间精密度变异系数分别为4.6％和6.1％，均小于15％，符合分析要求。对处理后样品的重复进样考察在8℃进样盘放置24小时，室温放置24小时，冻融三次，在-80℃储存14天的稳定性。结果显示偏差在
±
15％以内，变异系数小于15％，结果符合要求。该方法样品制备简单，分析速度快、线性范围广、灵敏度高、重现性好、特异性高，可以适用于检测人体血浆中游离醛固酮的含量用于临床的医疗诊断。
4、附图说明
[0037]
图1是0.2～5000pg/ml标准品的校准曲线；
[0038]
图2是实施例4中醛固酮的色谱图。
5、具体实施方式
[0039]
为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。
[0040]
实施例1
[0041]
本实施例的一种测定血浆中游离醛固酮含量的试剂盒，所述试剂盒包括以下组份：
[0042]
表1检测血浆中游离醛固酮含量的试剂盒的组份
[0043][0044][0045]
本实施例中，其中，检测前，先将校准曲线溶液用替代基质稀释到0.2、2、20、100、250、500、2500、5000的八个浓度梯度；所述质控品溶液用替代基质稀释到5、50、200pg/ml三个浓度梯度。本实施例的试剂盒，采集的血浆样品不需要衍生化处理，且样品体积仅需300μl，利用液液萃取对分析物的快速富集和提纯，使用超滤分离游离的醛固酮，相比平衡透析操作更简便且耗时短，操作简便。校准曲线溶液，质控品溶液采用高浓度封装，便于规模化生产，节约成本。
[0046]
实施例2
[0047]
本实施例的一种测定血浆中游离醛固酮含量的试剂盒，基本同实施例1，所不同的是，校准曲线工作液、质控样品工作液和内标的浓度及梯度。
[0048]
表2检测血浆中游离醛固酮含量的试剂盒的组份
[0049][0050]
本实施例的试剂盒，校准曲线溶液内含0.2、2、20、100、250、500、2500、5000的八个浓度梯度；质控品溶液内含5、50、200pg/ml三个浓度梯度。检测前无需再进行稀释，操作更加简便，节约检测时间，适用于日检测量较多的大型医院等使用场景。
[0051]
实施例3
[0052]
本实施例的一种测定血浆中游离醛固酮含量的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，不含流动相，增加流动相缓冲盐组分。
[0053][0054][0055]
本实施例的试剂盒，由于不含流动相，包装简洁，成本低，适用于需要远距离运输的的场景。
[0056]
实施例4
[0057]
本实施例的一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法，使用实施例1～实施例3的试剂盒，包括如下步骤：
[0058]
1.实验材料
[0059]
1.1试剂
[0060]
如实施例1～3的试剂盒组分。
[0061]
1.2主要仪器设备和耗材
[0062]
lc-ms/ms：waters acquity超高效液相色谱系统和waters xevo tqs串联质谱；色谱柱：acquitybeh c18(2.1
×
50mm 1.7μm)(waters)；漩涡混合器(vortex-genie 2,scientific industries,inc.)；台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；md200系列氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)。
[0063]
2.溶液及试剂的配制
[0064]
2.1储备液、工作液和质控样品的配置
[0065]
采用替代基质配制校准曲线和质控样品，最终校准曲线浓度梯度为0.2、2、20、100、250、500、2500、5000pg/ml；质控样品浓度为5、50、200pg/ml；内标准品浓度为1ng/ml。质控品用于考察方法的精密度、准确度、提取回收率，以及稳定性。
[0066]
2.2流动相和其它溶液的配制
[0067]
流动相a——0.5mm氟化铵水溶液；
[0068]
流动相b——甲醇溶液；
[0069]
30％甲醇溶液：将300ml甲醇与700ml水混合。
[0070]
3.样品的制备
[0071]
使用edta或肝素钠收集管采集患者血浆样本，600μl hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液加入300μl血浆样品/标准曲线/质控品，转移到超滤管中，在37℃，2000g的条件下离心1小时。取出500μl超滤液加入30μl内标溶液，加入800μl甲基叔丁基醚溶液进行液液萃取，涡旋3min，于4℃，12000rpm离心2min，取上层液体，氮吹干后加入100μl的30％甲醇水溶液复溶，涡旋1min，取90μl加入96孔板，待上机检测。
[0072]
4.仪器条件
[0073]
4.1液相条件
[0074]
本实施例选用acquitybeh c18(2.1mm
×
50mm 1.7μm)(waters)色谱柱，以同时含0.5mm氟化铵水溶液(a)和甲醇(b)为流动相，洗脱梯度见表1，流速0.40ml/min，分析时间为2.30min。
[0075]
进样器温度：8℃
[0076]
柱温：50℃
[0077]
运行时间：2.30min
[0078]
洗脱梯度：
[0079]
表1流动相的洗脱梯度
[0080][0081]
4.2质谱条件
[0082]
扫描模式：多反应离子监测；
[0083]
电离模式：负离子模式；
[0084]
电喷雾毛细管电压：-2.5kv；
[0085]
锥孔电压：30v；
[0086]
锥孔气流速：150l/hr
[0087]
离子源温度：150℃；
[0088]
脱溶剂温度：550℃5
[0089]
脱溶剂气流速：800l/hr。
[0090]
表2多反应监测参数
[0091][0092]
5.数据处理
[0093]
由masslynx软件采集分析物和内标的色谱图和积分处理，校正曲线以1/x2为加权系，用校准曲线样品中分析物的峰面积和内标的峰面积的比值对校正标样中分析物的浓度进行线性回归，得到游离醛固酮的浓度。0.2～5000pg/ml标准品的校准曲线如图1。
[0094]
6.结果与讨论
[0095]
本方法建立了一种uplc-ms/ms测试血浆中游离醛固酮的含量，在300μl的样品用量上依次采用超滤法和液液萃取来提取分析物。
[0096]
方法的检出限(s/n》3)和定量限(s/n》10)分别为0.01pg/ml和0.05pg/ml，灵敏度高。
[0097]
样品在0.2～5000pg/ml的浓度范围内有良好的线性关系，相关系数r2》0.99，符合分析要求。
[0098]
采用加标回收的方法来评估正确度和回收率，加标回收率均在可接受范围(96.8
±
7.4％)内，符合分析要求。
[0099]
采用5、50、200pg/ml三种低、中、高浓度的质控样6次重复进样来评估对批内精密度，测试5天来评估批间精密度，批内和批间精密度变异系数分别为4.6％和6.1％，均小于15％，符合分析要求。
[0100]
对处理后样品的重复进样考察在8℃进样盘放置24小时，室温放置24小时，冻融三次，在-80℃储存14天的稳定性。结果显示偏差在
±
15％以内，变异系数小于15％，结果符合要求。
[0101]
综上所述，该方法样品制备简单，分析速度快、线性范围广、灵敏度高、重现性好、特异性高，可以适用于检测人体血浆中游离醛固酮的含量用于临床的医疗诊断。
[0102]
实施例5
[0103]
本实施例的一种测定血浆中游离醛固酮含量的试剂盒，基本同实施例1～3，所不同的是，萃取剂更改为正己烷/乙酸乙酯(3:2,v/v)，采用实施例4的方法，其中，萃取液由甲基叔丁基醚更换为正己烷/乙酸乙酯(3:2,v/v)，其余相同，萃取回收率为90.12
±
3.54％，萃取回收率略低于相同体积的甲基叔丁基醚的(95.36
±
2.13％)。
[0104]
实施例6
[0105]
本实施例的一种测定血浆中游离醛固酮含量的试剂盒，基本同实施例1～2，所不同的是，没有流动相溶剂包，且在实施例4方法的基础上变更流动相a不加氟化铵，为纯水溶液，其余相同，对比实施例4中0.5mm氟化铵水溶液，2pg/ml的醛固酮标准品的信噪比下降了30％，峰面积下降了24％。
[0106]
准确测定血浆中的游离醛固酮，需要将其与血浆蛋白结合的醛固酮分离开，常用的方法为平衡透析法和超滤法，原理均是利用结合态和游离态分子的大小差进行膜截留分离，其中超滤法的耗时较短，效率更高。鉴于以上所述对游离醛固酮的分离提取、快速检测以及高灵敏度和高特异性的分析需求，本技术提供一种样品制备简单、无需衍生化处理、检
出限低、重现性好的血浆中游离醛固酮检测方法。利用waters uplc
–
xevo tqs ms系统，本技术简单、高灵敏且精确的血浆中游离醛固酮的含量。
[0107]
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。