一种乙酰半胱氨酸的检测方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种药物的测定方法，特别涉及一种乙酰半胱氨酸的检测方法。


背景技术：

2.乙酰半胱氨酸(acetylcysteine)为黏液溶解剂，为人体含有的内源性物质，具有较强的黏痰溶解作用。其分子中所含的巯基能使痰液中糖蛋白多肽链中的二硫键断裂，从而降低痰液的黏滞性，并使痰液化而易咳出。本品还能使脓性痰液中的dna纤维断裂，因此不仅能溶解白色黏痰，也能溶解脓性痰。对于一般祛痰药无效的患者，使用本品仍可有效。其化学名称2-乙酰氨基-3-巯基丙酸，分子式：c5h9no3s，分子量：163.19，其化学结构式为：
[0003][0004]
作为药物，适用于大量粘痰阻塞引起的呼吸困难，如手术后的咯痰困难、急性和慢性支气管炎、支气管扩张、肺结核、肺炎、肺气肿等引起的痰液粘稠、咯痰困难、痰阻气管等。本品尚可用于对乙酰氨基酚中毒的解毒。
[0005]
此外国内外诸多研究表明，乙酰半胱氨酸作为一个含有巯基的化合物，其本身还作为抗氧化剂，具有干扰自由基生成，清除已生成的自由基，调节细胞的代谢活性，预防dna的损伤，调整基因的表达和信号转导系统弄，抗细胞凋亡，抗血管生成，抑制恶性肿瘤发展和抑制新生物的生成和转移，在临床和实验中得到了广泛的应用。在呼吸系统方面，乙酰半胱氨酸对急性肺损伤具有保护作用，可抑制中性粒细胞与血管内皮细胞上某些粘附因子和细胞间粘附分子的过度表达；对急性呼吸窘迫综合征(ards)具有保护作用，据研究调查发现，医院ards的发病率超过10％；在心血管系统发面，乙酰半胱氨酸对于急性心肌缺血在灌注具有保护作用，能够与溶栓药一起联合使用，治疗急性心肌梗死，对于挽救病人生命具有极为重要的作用；在神经系统方面，乙酰半胱氨酸能够阻断细胞凋亡，抑制自由基形成，对于阿尔兹海默症，中风，帕金森病的治疗具有积极意义；此外，乙酰半胱氨酸在艾滋病方面能够增加cd4+淋巴细胞的数量，延缓艾滋病人在神经系统方面的病变具有治疗作用。
[0006]
由于乙酰半胱氨酸为人体内源性物质，且具有抗氧化性，极不稳定，对准确定量血浆中的乙酰半胱氨酸提出了巨大的挑战，因此需要建立一个具有快速、准确、可靠，同时具有高灵敏度、高选择性的方法。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供一种乙酰半胱氨酸的检测方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
[0008]
本发明提供的一种乙酰半胱氨酸的检测方法，为一种液质联用测定血浆中乙酰半氨酸浓度的方法，血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，包括以下步骤：
[0009]
s1、血浆样品预处理；
[0010]
s2、试样测定：取测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中乙酰半胱氨酸和内标乙酰半胱氨酸-d3的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的乙酰半胱氨酸浓度；
[0011]
其中：所述色谱条件如下：
[0012]
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
[0013]
流动相a：水/甲酸＝100/0.1(v/v)；
[0014]
流动相b：甲醇/甲酸＝100/0.1(v/v)；
[0015]
洗液：乙腈/水＝50/50(v/v)；
[0016]
自动进样器温度为4℃；
[0017]
梯度洗脱；
[0018]
流速：0.4ml/min；
[0019]
进样量为5μl；
[0020]
分析时间为3min。
[0021]
其中：待测物选择血浆。血浆是临床试验最常用的临床样品，易获得，且能准确地反映药物在体内的情况。
[0022]
液质联用兼具色谱的高分力度和质谱的高专属性、高灵敏度的特点，进而实现快速、准确地对样品中的乙酰半胱氨酸定量测试研究；内标物乙酰半胱氨酸-d3的应用能够减少操作误差对测定结果的影响，进一步提高检测方法的准确度和精密度。
[0023]
在某些实施方案中，步骤s1的具体步骤为：
[0024]
以k2edta为抗凝剂，以乙酰半胱氨酸-d3为内标；
[0025]
于96深孔板中精密加入40μl的血浆样品，混匀后加入40μl的内标乙酰半胱氨酸-d3溶液，混匀后加入40μl新鲜配置的1
w/v
％dtt溶液混合，混合均匀后加入200μl100％甲醇于96深孔板中，涡旋混合10min；
[0026]
于4℃以3000rpm离心10min.，取上层清液100μl至装有100μl水的96深孔板中，涡旋混匀，于4℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测。
[0027]
在某些实施方案中，步骤s2液相色谱测定过程中，色谱柱选自gl sciences inc.,inertsustain aq-c18hp，3μm，柱规格为50
×
2.1mm，色谱柱温为40℃。
[0028]
在某些实施方案中，步骤s2中梯度洗脱程序为：
[0029]
总时间(min)流动相a(％)流动相b(％)09281.2085151.210100
2.0001002.019283.00928
[0030]
其中：本发明中采用梯度洗脱，能够使得所述方法具有更高的灵敏度和分离度。
[0031]
在某些实施方案中，步骤s2质谱测定条件为：
[0032]
离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为4500v，加热块温度为400℃，喷雾气流量为3l/min，加热气流量为10l/min，接口温度伟300℃，q1pre偏差电压分别为-17ev的乙酰半胱氨酸和乙酰半胱氨酸-d3；
[0033]
碰撞电压分别为-13ev的乙酰半胱氨酸和乙酰半胱氨酸-d3；
[0034]
q1pre偏差电压分别为-18ev的乙酰半胱氨酸和乙酰半胱氨酸-d3；
[0035]
正离子方式检测；
[0036]
扫描方式为多重反应检测。
[0037]
在某些实施方案中，步骤s2质谱测定条件为：
[0038]
用于定量分析的离子反应分别为：
[0039]
m/z164.0
→
m/122.0，其为乙酰半胱氨酸；和
[0040]
m/z167.0
→
m/z123.0，其为乙酰半胱氨酸-d3。
[0041]
其中：选自离子对进行定量分析，能够提高测试的专属性和灵敏度。
[0042]
在某些实施方案中，步骤s2中试样测定步骤为：
[0043]
采用内标法，以乙酰半胱氨酸和内标乙酰半胱氨酸-d3的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的乙酰半胱氨酸的浓度。
[0044]
其中：本发明中采用内标法，可以减少样品预处理过程中造成的操作误差，测定结果更加准确。
[0045]
在某些实施方案中，取5μl标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的乙酰半胱氨酸和内标乙酰半胱氨酸-d3的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的乙酰半胱氨酸的浓度。
[0046]
在某些实施方案中，标准样品的制备方法为：
[0047]
取190μl替代血浆10份置于1.5ml离心管中，以储备液的形式添加10μl浓度分别为200ng/ml、400ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、8000ng/ml、30000ng/ml、80000ng/ml、100000ng/ml的乙酰半胱氨酸溶液至最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本中，混匀后分别向最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本、零浓度样本加入40μl的内标乙酰半胱氨酸-d3溶液，向空白样本中加入40μl的体积比为5％dtt甲醇水溶液，混匀后分别向10份样本中加入200μl的甲醇于96深孔板中，涡旋混合1min，于4℃以3000rpm离心10min，分别取上层清液100μl至装有100μl水的96深孔板中，涡旋混匀，于4℃以3000rpm离心5min后作为10份标准样品待检测。
[0048]
在某些实施方案中，所述替代血浆的制备方法为：使用磷酸盐缓冲溶液稀释血浆100倍而制得。
[0049]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0050]
(1)预处理方法简便，采用蛋白质沉淀法，适用于常规测定；
[0051]
(2)乙酰半胱氨酸稳定性差，在溶液和血浆中都极易被氧化，在实验中加入二硫苏糖醇(dtt)来保护巯基，维持样品的稳定性，提高样品检测的重现性和准确性；
[0052]
(3)专属性强：在本实验所采用的色谱条件下，乙酰半胱氨酸保留时间为1.00min左右，内标乙酰半胱氨酸-d3保留时间在1.00min左右。乙酰半胱氨酸和内标乙酰半胱氨酸-d3的峰型良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；
[0053]
(4)灵敏度高：血浆最低定量限为10ng/ml，能准确测定血浆中乙酰半胱氨酸的浓度，灵敏度高，特异性强；
[0054]
(5)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为乙酰半胱氨酸的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为10～5000ng/ml，批内和批间精密度rsd约小于
±
15％。
附图说明
[0055]
图1是hplc-ms/ms法测得的乙酰半胱氨酸在人血浆中的标准曲线；
[0056]
图2是人空白血浆的hplc-ms/ms图；
[0057]
图3是人空白替代血浆的hplc-ms/ms图；
[0058]
图4是人空白替代血浆加入乙酰半胱氨酸和乙酰氨半胱氨酸-d3的hplc-ms/ms图。
具体实施方式
[0059]
下面通过实施方式对本发明进行进一步详细的说明。
[0060]
实施例1实验材料与分析设备
[0061]
乙酰半胱氨酸(分析物)：zz standards或相同、更高等级的标准品；
[0062]
乙酰半胱氨酸-d3(内标)：tlc pharmaceutical standards或相同、更高等级的标准品。
[0063]
使用试剂见下表1：
[0064]
表1试剂明细
[0065]
试剂名称级别制造商乙腈hplcfisher甲醇hplcfisher醋酸铵hplcfisher甲酸lc/ms阿拉丁二硫苏糖醇分析纯碧云天磷酸盐缓冲溶液(10x)无gibco
[0066]
注：亦可使用相同级别或更高级别的试剂。
[0067]
使用分析设备见下表2：
[0068]
表2使用设备明细
[0069]
组件种类制造商binary pump(二元泵)ac pumpshimadzudegasser(脱气器)degassershimadzucolumn oven(恒温柱箱)ac column ovenshimadzu
autosampler(自动取样器)ac autosamplershimadzusample rack(样本架)rack changershimadzumass spectrometer(质谱仪)8060shimadzudata processor(数据处理器)lab solution(software)shimadzu
[0070]
相同的lc1ms/ms系统亦可被使用。
[0071]
实施例2液相条件
[0072]
1、液相色谱条件
[0073]
色谱柱：gl sciences inc.,inertsustain aq-c18hp，3μm，柱规格为50
×
2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相a：水/甲酸体积比为100/0.1；流动相b：甲醇/甲醇体积比为100/0.1；洗液：乙腈/水的体积比为50/50；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.4ml/min，进样量为5μl，分析时间为3min；
[0074]
表3梯度洗脱程序
[0075][0076][0077]
2、质谱条件
[0078]
离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为4500v，加热块温度为400℃，喷雾气流量为3l/min，加热气流量为10l/min，接口温度伟300℃，q1pre偏差电压分别为-17ev的乙酰半胱氨酸和乙酰半胱氨酸-d3；碰撞电压分别为-13ev的乙酰半胱氨酸和乙酰半胱氨酸-d3；q1pre偏差电压分别为-18ev的乙酰半胱氨酸和乙酰半胱氨酸-d3；正离子方式检测；扫描方式为多重反应检测；用于定量分析的离子反应分别为：m/z164.0
→
m/122.0，其为乙酰半胱氨酸；和m/z167.0
→
m/z123.0，其为乙酰半胱氨酸-d3。
[0079]
实施例3试验过程
[0080]
1、乙酰半胱氨酸标准溶液的配制
[0081]
乙酰半胱氨酸标准溶液的配制：精密称取乙酰半胱氨酸(分析物)4.000mg，置于2ml容量瓶中，加入含有5％dtt的50％乙腈水溶解并定容至刻度，摇匀，既得4mg/ml的乙酰半胱氨酸储备液，再以体积比为5％dtt的50％乙腈水溶液溶依次稀释配制乙酰半胱氨酸标准溶液，具体稀释浓度见下表4：
[0082]
表4乙酰半胱氨酸标准溶液配制浓度
[0083][0084][0085]
乙酰半胱氨酸标准溶液于不使用时储存于塑料容器及冰箱(-80℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。
[0086]
2、乙酰半胱氨酸-d3内标标准溶液的配制
[0087]
乙酰半胱氨酸-d3内标标准溶液的配制：精密称取乙酰半胱氨酸-d3(内标)1.000mg，置于5ml容量瓶中，加入含有5％dtt的50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，摇匀，既得0.2mg/ml的乙酰半胱氨酸-d3储备液，再以体积为5％dtt的50％甲醇水溶液稀释配制成浓度为300ng/ml的乙酰半胱氨酸-d3内标溶液，具体稀释浓度见下表5：
[0088]
表5乙酰半胱氨酸-d3标准溶液配制浓度
[0089]
来源溶液(ng/ml)来源溶液体积(μl)溶剂体积(μl)最终浓度(ng/ml)2000001010002000200000150100000300
[0090]
乙酰半胱氨酸-d3内标标准溶液于不使用时储存于塑料容器及冰箱(-80℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。
[0091]
3、线性试验
[0092]
将空白血浆于室温环境放入水浴解冻；转移190μl的空白血浆10份至96深孔板中(每一个标准曲线样本、空白样本-00及零浓度样本-0)，依下表6所列，分别精密加入不同浓度的乙酰半胱氨酸标准溶液10μl或稀释溶液配制每一个样本并混匀，配成不同浓度的含药血浆，按“血浆样品预处理”操作。计算乙酰半胱氨酸峰面积as和内标乙酰半胱氨酸-d3峰面积ai的比值y(y＝as/ai)，以峰面积比值y对血药浓度x作回归计算，结果见图1和表7。以平均比值y对血药浓度x做回归计算，得回归方程y＝2.73053x-0.000653766,相关系数(r)为0.9991585，拟合度(r2)为0.9983181。权重系数w＝1/x2，按该方法测得的乙酰半胱氨酸的血药浓度的最低定量限为：10ng/ml。
[0093]
表6乙酰半胱氨酸标准曲线配制浓度
[0094][0095][0096]
b：分析物的稀释溶液：含有5％dtt的50％乙腈溶液
[0097]
表7 hplc-ms/ms法测得的乙酰半胱氨酸在人血浆中的标准曲线(n＝12)
[0098]
[0099][0100]
4、准确度和精密度
[0101]
将空白血浆于室温环境放入水浴解冻；转移适当体积的空白血浆至适当的容器并添加乙酰半胱氨酸标准溶液制备5种不同浓度的含药血浆质控样品(lloq qc、lqc、gmqc、mqc、hqc)及一条随行标准曲线，按“血浆样品预处理”操作，质控样品制备如下表8所示。每天做一批及一条随行标准曲线，连续做3天，共三批，第一批、第二批、第三批和第四批每个浓度分别做6份样品，计算乙酰半胱氨酸峰面积as和内标乙酰半胱氨酸-d3峰面积ai的比值y，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，由实测浓度计算批内于批间精密度，实测浓度与加入浓度的比值即为准确度，结果见表9。乙酰半胱氨酸血浆样品批间、批内精密度、准确度小于
±
15％符合要求。
[0102]
表8质控样品配制浓度
[0103][0104]
依每一分析批所需，分装足够的体积至已标示的样本瓶瓶中并储存于理论温度-80℃。体积可视需要依比例增加或减少。
[0105]
表9hplc-ms/ms法测定血浆中乙酰半胱氨酸的批内、批间精度和准确度
[0106]
[0107][0108]
[0109][0110]
5、干扰性
[0111]
由于不存在不含有乙酰半胱氨酸的空白血浆，故使用磷酸盐缓冲溶液(1x)稀释血浆100倍作为替代血浆。6个不同空白血浆样品分别来源不同健康人体，将6个不同空白血浆样品稀释100倍后于同一分析批依样本制备步骤制备及分析，来评价不同空白血浆对乙酰半胱氨酸分析物及内标乙酰半胱氨酸-d3的干扰。
[0112]
6个不同来源空白健康人体血浆样本制备分析后，在符合乙酰半胱氨酸保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的乙酰半胱氨酸响应的20.0％，结果见表10。结果表明该分析方法对乙酰半胱氨酸的分析具有专属性。
[0113]
6个不同来源空白健康人体血浆样本制备分析后，在符合内标保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的内标响应的5.0％，见附录中的标10。结果表明该分析方法对内标的分析具有选择性。
[0114]
表10 6个不同来源空白健康人体血浆对乙酰半胱氨酸和乙酰半胱氨酸-d3分析物的干扰性数据对比表
[0115][0116]
从表10中可以看出，不同人体的空白血浆对乙酰半胱氨酸和乙酰半胱氨酸-d3的检测结果没有造成干扰。因此，该方法可以用于检测不同人体血浆中的乙酰半胱氨酸浓度。
[0117]
6、人血浆样品检测
[0118]
(1)取的人替代空白血浆，于96深孔板中精密加入60μl的替代空白血浆样品，加入40μl的5％dtt的50％甲醇水溶液，混匀后加入200μl的乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于4℃以3000rpm离心10min，取上层清液100μl至装有100μl水的96深孔板中，涡旋混匀，于4℃以3000rpm离心5min后取5μl样品进行lc-ms/ms分析，结果如图2所示。
[0119]
(2)取的人替代空白血浆，于96深孔板中精密加入60μl的替代空白血浆样品，加入40μl的内标溶液，混匀后加入200μl的乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于4℃以3000rpm离心10min，取上层清液100μl至装有100μl水的96深孔板中，涡旋混匀，于4℃以3000rpm离心5min后取5μl样品进行lc-ms/ms分析，结果如图3所示。
[0120]
(3)取的人替代空白血浆配制成lloq浓度(10ng/ml)，于96深孔板中精密加入60μl的样品，加入40μl的内标溶液，混匀后加入200μl的乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于4℃以3000rpm离心10min，取上层清液100μl至装有100μl水的96深孔板中，涡旋混匀，于4℃以3000rpm离心5min后取5μl样品进行lc-ms/ms分析，结果如图4所示。
[0121]
综上所述：本发明提供了一种预处理方法简便的血浆中乙酰半胱氨酸浓度的测定方法，采用蛋白质沉淀法，适用于常规测定；同时，在本实验所采用的色谱条件下，乙酰半胱氨酸保留时间为1.00min左右，内标乙酰半胱氨酸-d3保留时间在1.03min左右，乙酰半胱氨酸芬和内标乙酰半胱氨酸-d3的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中乙酰半胱氨酸的浓度，灵敏度较高，血浆最低定量限为10ng/ml；同时，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为乙酰半胱氨酸的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围10～5000ng/ml，批内和批间精密度rsd约小于
±
15％。
[0122]
以上表述仅为本发明的优选方式，应当指出，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应视为发明的保护范围之内。