专利名称:毛细管电泳电化学发光检测美托洛尔和阿替洛尔的方法
技术领域：
本发明属于毛细管电泳电化学发光检测技术领域：
，具体涉及毛细管电泳电化学发光检测美托洛尔和阿替洛尔的方法。
背景技术：
美托洛尔和阿替洛尔属于β(1)-肾上腺受体抑制剂类药物，被广泛用于高血压、心绞痛、心律失常和心肌梗塞等心血管疾病的治疗。由于其具有镇静作用，在体育运动中也被用作兴奋剂。过量服用该类药物可导致心搏舒缓、低血压、支气管痉挛和低血糖症等。所以发展快速灵敏的检测该类药物的分析方法，在临床检验、兴奋剂控制和药代动力学研究等方面具有重要的意义。
目前对此类药物的检测主要用色谱-质谱联用的方法，此外还包括紫外-可见分光光度法、微分脉冲伏安法等等。色谱-质谱联用技术除了灵敏度高外同时还能提供被分析物的结构信息，是药物分析检测领域的一种重要方法。但是色谱-质谱需要的仪器设备构造精细，仪器费用较高。毛细管电泳具有试剂和样品消耗量小，高效、快速的分离能力等优点，适用于各种离子以及中性物质的分离，是近几年发展最快的分离分析手段。Ru(bpy)32+电化学发光检测是一种高灵敏度的检测方法，已被广泛用于氨基酸、蛋白质、DNA和有机胺类物质的分析检测。毛细管电泳电化学发光检测联用技术所需仪器造价低，操作简单，分离分析能力强。
发明内容本发明的目的是提供毛细管电泳电化学发光检测美托洛尔和阿替洛尔的方法。具体涉及一种毛细管电泳电化学发光分析检测美托洛尔和阿替洛尔的方法。
本方法所用仪器装置为内径25μm未涂层融硅毛细管；直径500μmPt盘工作电极，Ag/AgCl参比电极(饱和KCl溶液)，Pt丝辅助电极；MPI-A型毛细管电冰电化学发光检测仪。
所用试剂为Ru(bpy)3Cl2·6H2O，NaH2PO4，Na2HPO4，H3PO4，NaOH，美托洛尔和阿替洛尔标准品；所用试剂均为分析纯；所有溶液均用二次水配制，配制好的溶液在使用之前均经0.22μm滤膜过滤。
对美托洛尔和阿替洛尔的分析检测分为以下几个步骤1)、为了保证检测的灵敏度及分析结果的重现性，需对毛细管及工作电极做以下处理(1)、毛细管在第一次使用前，用0.1mol/L NaOH溶液冲洗过夜；在操作过程中，每天用0.1mol/L NaOH溶液冲洗过夜，再分别用二次水和缓冲液冲洗毛细管柱2-10min，最后在分离条件下平衡2-10min；(2)、直径500μm Pt盘工作电极在操作前在1.0mol/L H2SO4溶液中，在-0.2-1.5V(vs.Ag/AgCl)电位范围内循环扫，直到得到Pt电极的特征循环伏安曲线。操作过程中将工作电极在检测池缓冲溶液中循环扫描10-20周，扫描电位范围为0-1.35V，以清除电极表面污染物，活化工作电极；2)、缓冲溶液的配制(1)、pH＜5.0的缓冲溶液的配制方法是先配制浓度为10-50mmol/L的NaH2PO4溶液和浓度为1.0mol/L的H3PO4溶液，然后用1.0mol/L的H3PO4溶液调节至pH＜5.0；(2)、5.0≤pH≤9.0的缓冲溶液的配制方法是先分别配制浓度为10-100mmol/L的NaH2PO4和Na2HPO4溶液，将同浓度的二者混合，即可得到5.0≤pH≤9.0的缓冲溶液；(3)、pH＞9.0的缓冲溶液的配制方法是先配制浓度为10-100mmol/L的Na2HPO4溶液和浓度为1.0mol/L的NaOH溶液，然后用1.0mol/L的NaOH溶液调节至pH＞9.0；3)、美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液的配制及其静态实验美托洛尔和阿替洛尔储备液的浓度均为1.0mmol/L，储备液在4℃冰箱中避光保存；
美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液的静态实验以100mmol/L，pH7.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液作为背景电解质，扫描区间是0-1.35V，记录稳定时的循环伏安(CV)曲线和电化学发光(ECL)曲线；然后在含0.4mmol/L美托洛尔和阿替洛尔的背景电解质中循环扫描，扫描区间同样为0-1.35V，记录稳定时的CV曲线和ECL曲线；将美托洛尔和阿替洛尔的CV曲线和ECL曲线与背景电解质的对比，以确定美托洛尔和阿替洛尔是否具有增强Ru(bpy)32+电化学发光活性。
4)、CE-ECL检测美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液的检测条件，并在此条件下进行线性范围和检测限的考察选择恒电位操作方式，在1.0-1.3V之间变化检测电位；2-10s，10-15kV之间变化进样时间及进样高压；10-20kV之间变化分离高压；10.0-50.0mmol/L之间变化NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液浓度，5.0-10.0之间变化NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液pH值；检测池中NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液固定为100mmol/L，pH值在5.0-10.0之间变化；检测池中Ru(bpy)32+的浓度在1.0-10.0mmol/L范围内变化；光电倍增管高压为600-900V。
综合灵敏度、峰形、重现性等方面确定灵敏度高、峰形对称无明显峰展宽以及重现性好的检测条件为最佳条件，最佳检测条件是检测电位1.15V；进样时间8s，进样高压10kV；分离高压15kV；NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液浓度10.0mmol/L(pH8.5)；5mM Ru(bpy)32+和100mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH8.5)加入到检测池中；光电倍增管高压为800V。
在最佳检测条件下，美托洛尔和阿替洛尔标准品的检测限分别是5.0×10-9mol/L和7.5×10-8mol/L，线性范围分别是5×10-8-1.0×10-5mol/L和7.5×10-8-1.0×10-6mol/L。
5)、美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液分离条件的考察进样时间在1-10s之间变化，10.0-50.0mmol/L之间变化NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液浓度，2.0-5.0之间变化NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液pH值。
以美托洛尔和阿替洛尔达到基线分离时的条件为最佳分离条件，最佳分离条件为10kV电动进样2s；10.0mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液，pH3.0。
6)、空白尿样及含美托洛尔和阿替洛尔标准品的加标尿样的制备过程取健康人的尿液，经0.22μm滤膜过滤，之后用二次水稀释10-20倍，作为空白尿样；将等体积的美托洛尔和阿替洛尔储备液加入空白尿样中配成含美托洛尔和阿替洛尔标准品浓度均为1.0×10-7-1.0×10-5mol/L的加标尿样；7)、空白尿样及含美托洛尔和阿替洛尔标准品的加标尿样的检测在5)中所得的最佳分离检测条件下，获得空白尿样及含美托洛尔和阿替洛尔标准品的加标尿样的电泳图谱。
本发明所涉及的美托洛尔和阿替洛尔的检测方法同其他分析方法比较有如下特点1.成本低，操作简单。毛细管电泳电化学发光检测只需要一根毛细管，一台高压电源，一台恒电位仪，一台发光检测仪和一些实验室常用的化学试剂即可完成分析任务；同质谱检测方法相比，操作更简单，仪器成本也更低。
2.灵敏度高，线性范围宽。本方法对美托洛尔和阿替洛尔的检测下限分别为5.0×10-9mol/L和7.5×10-8mol/L，比最常用的紫外检测方法检测限低2个数量级，与液相色谱-质谱联用方法的检测结果相当。线性范围分别为5×10-8-1.0×10-5mol/L和7.5×10-8-1.0×10-6mol/L。
本发明首次将毛细管电泳电化学发光检测技术应用于美托洛尔和阿替洛尔的检测。采用传统的三电极体系，以Pt盘电极为工作电极，铂丝为对极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液使用NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液。
图1是美托洛尔和阿替洛尔标准品在最佳检测条件下的电泳图谱。其中A是阿替洛尔(AT)，B是美托洛尔(ME)，AT和ME的浓度均为5.0×10-6mol/L。
图2是美托洛尔和阿替洛尔标准品在最佳分离条件下的电泳图谱，标准品溶液中AT和ME浓度均为2.5×10-6mol/L。
图3是美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液加标的尿样的电泳谱图。其中A是空白尿样，B是美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液加标的尿样，加标尿样中AT和ME的浓度均为2.5×10-6mol/L。
具体实施方式以下实施例用毛细管电泳电化学发光检测装置。工作电极是直径500μm Pt盘电极，辅助电极是铂丝电极，参比电极是Ag/AgCl(饱和KCl溶液)电极。毛细管柱内径25μm，毛细管柱出口端对准工作电极表面，采用柱端检测模式。
实施例1美托洛尔和阿替洛尔标准品的检测对美托洛尔和阿替洛尔标准品的检测，所用仪器如前所述，检测步骤如下1.美托洛尔和阿替洛尔标准溶液的配制美托洛尔和阿替洛尔储备液浓度为1.0mmol/L。储备液在4℃冰箱中避光保存。
2.10.0mmol/L，pH8.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液的配制先配制浓度为10.0mmol/L的NaH2PO4溶液和浓度为10.0mmol/L的Na2HPO4溶液，然后将两者混合，并调节至pH8.5。
3.100.0mmol/L，pH8.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液的配制先配制浓度为100.0mmol/L的NaH2PO4溶液和浓度为100.0mmol/L的Na2HPO4溶液，然后将两者混合，调节pH值到8.5。
4.美托洛尔和阿替洛尔标准品的检测在检测电位1.15V；电泳缓冲溶液浓度10.0mmol/L，pH8.5；进样时间8s，进样电压10kV；分离高压15kV；5mM Ru(bpy)32+和100mMNaH2PO4-Na2HPO4(pH8.5)加入到检测池中；光电倍增管高压为800V。在该最佳条件下，7min内美托洛尔和阿替洛尔可分别得到检测，同时在最佳检测条件下，美托洛尔和阿替洛尔标准品的检测限分别是5.0×10-9mol/L和7.5×10-8mol/L，线性范围分别是5×10-8-1.0×10-5mol/L和7.5×10-8-1.0×10-6mol/L。美托洛尔和阿替洛尔标准品的电泳图谱如图1所示。
在实验过程中，为保证获得较高的信号响应和较好的检测重现性，需对毛细管和工作电极进行适当的处理。
毛细管的处理方法是毛细管在第一次使用前，用0.1mol/L NaOH溶液冲洗过夜。在实验过程中，每天用0.1mol/L NaOH溶液冲洗过夜，再分别用二次水和电泳缓冲液冲洗毛细管柱5min，然后再分离条件下平衡毛细管柱10min。
工作电极的处理方法是500μm Pt盘工作电极在使用前在1.0mol/LH2SO4溶液中，在-0.2-1.5V电位范围内循环扫，直到得到Pt电极的特征循环伏安曲线。实验过程中将工作电极在检测池缓冲溶液中循环扫描10-20周，扫描区间是0-1.35V，以清除电极表面污染物，活化工作电极表面。
实施例2美托洛尔和阿替洛尔标准品的同时分离检测对美托洛尔和阿替洛尔标准品的同时分离检测，所用仪器如前所述，分离检测步骤如下1.美托洛尔和阿替洛尔标准溶液的配制美托洛尔和阿替洛尔储备液浓度为1.0mmol/L。储备液在4℃冰箱中避光保存。
2.10.0mmol/L，pH3.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液的配制先配制浓度为10.0mmol/L的NaH2PO4溶液和浓度为1.0mmol/L的H3PO4溶液，然后用H3PO4溶液调节至pH3.0。
3.100.0mmol/L，pH8.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液的配制先配制浓度为100.0mmol/L的NaH2PO4溶液和浓度为100.0mmol/L的Na2HPO4溶液，然后将两者混合，调节pH值到8.5。
4.美托洛尔和阿替洛尔标准品的同时分离检测在检测电位1.15V；电泳缓冲溶液浓度10.0mmol/L，pH3.0；进样时间2s，进样电压10kV；分离高压15kV，5mM Ru(bpy)32+和100mMNaH2PO4-Na2HPO4(pH8.5)加入到检测池中；光电倍增管高压为800V。在该最佳条件下，20min以内美托洛尔和阿替洛尔可同时得到分离检测(图2)。
在实验过程中，为保证获得较高的信号响应和较好的检测重现性，需对毛细管和工作电极进行适当的处理。
毛细管的处理方法是毛细管在第一次使用前，用0.1mol/L NaOH溶液冲洗过夜。在实验过程中，每天用0.1mol/L NaOH溶液冲洗过夜，再分别用二次水和电泳缓冲液冲洗毛细管柱5min，然后再分离条件下平衡毛细管柱10min。
工作电极的处理方法是500μm Pt盘工作电极在使用前在1.0mol/LH2SO4溶液中，在-0.2-1.5V电位范围内循环扫，直到得到Pt电极的特征循环伏安曲线。实验过程中将工作电极在检测池缓冲溶液中循环扫描10-20周，扫描区间是0-1.35V，以清除电极表面污染物，活化工作电极表面。
实施例3尿样中美托洛尔和阿替洛尔的分离检测对尿样中美托洛尔和阿替洛尔的分离检测，所用仪器如前所述，分离检测步骤如下1.10.0mmol/L，pH3.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液的配制先配制浓度为10.0mmol/L的NaH2PO4溶液和浓度为1.0mmol/L的H3PO4溶液，然后用H3PO4溶液调节至pH3.0。
2.100.0mmol/L，pH8.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液的配制先配制浓度为100.0mmol/L的NaH2PO4溶液和浓度为100.0mmol/L的Na2HPO4溶液，然后将两者混合，调节pH值到8.5。
3.空白尿样及美托洛尔和阿替洛尔标准品加标尿样的制备过程是取健康人的尿液，经0.22μm滤膜过滤，用二次水稀释20倍，作为空白尿样；将美托洛尔和阿替洛尔标准品储备液加入空白尿样中制成含美托洛尔和阿替洛尔浓度均为2.5×10-6mol/L的加标尿样。
3.空白尿样及美托洛尔和阿替洛尔标准品加标尿样的分离检测在检测电位1.15V；NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液浓度为10.0mmol/L，pH3.0；进样时间2s，进样电压10kV；分离高压15kV；5mMRu(bpy)32+和100mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH8.5)加入到检测池中，光电倍增管高压为800V。在该最佳分离检测条件下，获得空白尿样及美托洛尔和阿替洛尔标准品加标尿样的电泳图谱(图3)。
在实验过程中，为保证获得较高的信号响应和较好的检测重现性，需对毛细管和工作电极进行适当的处理。尿样中含有的蛋白质等成分经稀释后对分离检测的影响很小，所以不需要特别的处理方法。
毛细管的处理方法是毛细管在第一次使用前，用0.1mol/L NaOH溶液冲洗过夜。在实验过程中，每天用0.1mol/L NaOH溶液冲洗过夜，再分别用二次水和电泳缓冲液冲洗毛细管柱5min，然后再分离条件下平衡毛细管柱10min。
工作电极的处理方法是500μm Pt盘工作电极在使用前在1.0mol/LH2SO4溶液中，在-0.2-1.5V电位范围内循环扫，直到得到Pt电极的特征循环伏安曲线。实验过程中将工作电极在检测池缓冲溶液中循环扫描10-20周，扫描区间是0-1.35V，以清除电极表面污染物，活化工作电极表面。
权利要求
1.毛细管电泳电化学发光检测美托洛尔和阿替洛尔的方法，其检测步骤和条件如下所用仪器装置为内径25μm未涂层融硅毛细管；直径500μm Pt盘工作电极，Ag/AgCl参比电极(饱和KCl溶液)，Pt丝辅助电极；MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪；所用试剂为Ru(bpy)3Cl2·6H2O，NaH2PO4，Na2HPO4，H3PO4，NaOH，美托洛尔和阿替洛尔标准品；所用试剂均为分析纯；所有溶液均用二次水配制，配制好的溶液在使用之前均经0.22μm滤膜过滤；1)、对毛细管及工作电极做以下处理(1)、毛细管在第一次使用前，用0.1mol/L NaOH溶液冲洗过夜；在操作过程中，每天用0.1mol/L NaOH溶液冲洗过夜，再分别用二次水和缓冲液冲洗毛细管柱2-10min，最后在分离条件下平衡2-10min；(2)、直径500μm Pt盘工作电极在操作前在1.0mol/L H2SO4溶液中，在-0.2-1.5V(vs.Ag/AgCl)电位范围内循环扫，直到得到Pt电极的特征循环伏安曲线，操作过程中将工作电极在检测池缓冲溶液中循环扫描10-20周，扫描电位范围为0-1.35V，以清除电极表面污染物，活化工作电极；2)、缓冲溶液的配制(1)、pH＜5.0的缓冲溶液的配制方法是先配制浓度为10-50mmol/L的NaH2PO4溶液和浓度为1.0mol/L的H3PO4溶液，然后用1.0mol/L的H3PO4溶液调节至pH＜5.0；(2)、5.0≤pH≤9.0的缓冲溶液的配制方法是先分别配制浓度为10-100mmol/L的NaH2PO4和Na2HPO4溶液，将同浓度的二者混合，即可得到5.0≤pH≤9.0的缓冲溶液；(3)、pH＞9.0的缓冲溶液的配制方法是先配制浓度为10-100mmol/L的Na2HPO4和浓度为1.0mol/L的NaOH溶液，然后用1.0mol/L的NaOH溶液调节至pH＞9.0；3)、美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液的配制及其静态实验美托洛尔和阿替洛尔储备液的浓度均为为1.0mmol/L，储备液在4℃冰箱中避光保存；美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液的静态实验以100mmol/L，pH 7.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液作为背景电解质，扫描电位范围为0-1.35V，记录稳定时的循环伏安(CV)曲线和电化学发光(ECL)曲线；然后在含0.4mmol/L美托洛尔和阿替洛尔的背景电解质中循环扫描，扫描区间同样为0-1.35V，记录稳定时的CV曲线和ECL曲线；将美托洛尔和阿替洛尔的CV曲线和ECL曲线与背景电解质的对比，以确定美托洛尔和阿替洛尔是否具有增强Ru(bpy)32+电化学发光活性；4)、CE-ECL检测美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液的检测条件，并在此条件下进行线性范围和检测限的考察选择恒电位操作方式，在1.0-1.3V之间变化检测电位；2-10s，10-15kV之间变化进样时间及进样高压；10-20kV之间变化分离高压；10.0-50.0mmol/L之间变化NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液浓度，5.0-10.0之间变化NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液pH值； 检测池中NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液固定为100mmol/L，pH值在5.0-10.0之间变化；检测池中Ru(bpy)32+的浓度在1.0-10.0mmol/L范围内变化；光电倍增管高压为600-900V；在获得的上述的检测条件下，在5×10-9-1.0×10-5mol/L浓度范围内考察美托洛尔的检测线性范围；在7.5×10-8-1.0×10-5mol/L浓度范围内考察阿替洛尔的检测线性范围，同时也考察了二者的检测下限；5)、美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液分离条件的考察进样时间在1-10s之间变化，10.0-50.0mmol/L之间变化NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液浓度，2.0-5.0之间变化NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液pH值；6)、空白尿样及含美托洛尔和阿替洛尔标准品的加标尿样的制备过程取健康人的尿液，经0.22μm滤膜过滤，之后用二次水稀释10-20倍，作为空白尿样；将等体积的美托洛尔和阿替洛尔储备液加入空白尿样中配成含美托洛尔和阿替洛尔标准品浓度均为1.0×10-7-1.0×10-5mol/L的加标尿样；7)、空白尿样及含美托洛尔和阿替洛尔标准品的加标尿样的检测在5)中所得的最佳分离检测条件下，获得空白尿样及含美托洛尔和阿替洛尔标准品的加标尿样的电泳图谱。
2.如权利要求
1中所述的一种美托洛尔和阿替洛尔的毛细管电泳电化学发光检测方法，其特征在于，所述的步骤4)中，检测的最佳条件是检测电位1.15V，进样时间8s，进样高压10kV，分离高压15kV，NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液浓度10.0mmol/L(pH8.5)，5mM Ru(bpy)32+和100mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH8.5)加入到检测池中，光电倍增管高压为800V。
3.如权利要求
1中所述的一种美托洛尔和阿替洛尔的毛细管电泳电化学发光检测方法，其特征在于，所述的步骤5)中，美托洛尔和阿替洛尔的最佳分离条件为10.0mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4电泳缓冲溶液(pH3.0)，10kV电动进样2s。
专利摘要
本发明涉及毛细管电泳电化学发光检测美托洛尔和阿替洛尔的方法，属于分析检测技术领域：
。采用毛细管电泳电化学发光检测联用装置，对美托洛尔和阿替洛尔的标准品溶液及其加标的尿样进行了直接进样分析。该方法的灵敏度高，操作简单。对美托洛尔和阿替洛尔标准品溶液检测的线性范围分别为5×10
文档编号G01N27/48GK1995983SQ200610173390
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月29日
发明者由天艳, 黄建设 申请人:中国科学院长春应用化学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan