专利名称：测量dna合成率的分析方法
技术领域：
本发明涉及非放射性示踪技术在测量DNA合成率中的应用。通过将一种或多种稳定同位素标记的前体提供给一种或多种DNA构成成分，然后测量从目标细胞中提取到的DNA中稳定同位素标记的量，从而确定DNA的合成率。
背景技术：
Markey和Abramson于1982年首先研制了化学反应偶联质谱(chemical reaction interface for mass spectrometry，CRIMS)，这是将质谱用作气相色谱中元素(碳)和同位素(14C)的选择性检测器的一种方式。Chace和Abramson进一步研制出划分稳定同位素范围的技术，并将该技术首次应用于药物代谢。CRIMS的原理是将色谱流出物导入微波动力反应池，在其中分子被破碎为元素。将反应气体连续导入微波诱导的等离子体，结果形成以包含在原始分子内的元素为特征的简单气体反应产物。传统的电子电离质谱用于检测反应产物中的元素或同位素。化学反应偶联质谱(CRIMS)已从一个概念发展成为可选择性、灵敏性和多样性技术，通过该技术可以监测代谢研究中的目标同位素或元素。CRIMS同时应用放射性同位素的监测，其中每种技术均能监测不依赖目标物质存在的化学结构的示踪物。通过CRIMS，完整分析物被分解为高温电子流形式的元素类型，并与反应气体原子相互作用形成一系列新的、小的多原子类型，这种类型的物质可以用传统质谱进行检测。一种特定的多原子类型的物质的存在标志着一种特定元素的存在，该多原子类型的丰度可以定量该元素，该多原子类型的同位素标记可以将该元素从内源物质中区分出来。通过消除作为示踪物的稳定同位素的已知天然丰度，即可以得到仅显示富含此种类物质的色谱图。CRIMS已经与气相和液相色谱相连接，而且进行了若干应用。
一些同位素代谢的分析方法是已知的。例如，美国专利4182656公开了利用13C-标记的底物检测生物活性物质存在的方法。该方法应用13C-标记的葡萄糖进行发酵，然后测量培养气体中13CO2和12CO2的比例，用来确定表明生物活性物质存在的13C16O2的比例是否已有增加。第10栏第45行显示气体导入质谱以确定CO2量的参考值。
美国专利4830010公开了诊断胃肠道功能紊乱的方法。该方法涉及利用同位素标记的脲的量。用一种或多种稳定同位素标记脲。检测患者的呼吸，确定是否存在同位素标记的二氧化碳或同位素标记的氨，它们是campylobacter pyloridis的水解产物。气体样品用质谱检测。
美国专利5559038公开了定量生物样品中氧化巯基氨基酸(具体为半胱氨酸亚磺酸和磺基丙氨酸)的方法。氧化巯基氨基酸衍生化后，利用稳定同位素作内标通过气相色谱/质谱检测。偏离正常水平的偏差表明神经精神功能紊乱。
化学文摘，95卷第7期，文摘号62629g公开了“同核偶联双自旋系统中的自旋，以(13C，2H)甘氨酸为例”。该文摘探讨了氨基酸和多肽的合成。J.Magn.Reson，1981，42卷。
化学文摘，90卷第17期，文摘号135950p公开了“利用稳定同位素标记的氨基酸，15N-甘氨酸研究躯体膈下迷走神经切除术和幽门成形术对鼠生态胃外科中氮平衡的影响”。
化学文摘，89卷第17期，文摘号147218y公开了用氘和/或碳-13部分标记的甘氨酸和两对脯氨酸合成环肽。
化学文摘，111卷第13期，文摘号111948v公开了利用化学离子化气相色谱/质谱监测选择离子，进行人尿中n-己酰甘氨酸、3-苯基丙酰甘氨酸和环庚基甘氨酸的稳定同位素稀释分析。Biomed.Environ.MassSpectrom《生物医学.环境.质谱》，1989，18卷18号7，p471-7。
化学文摘，111卷第11期，文摘号94305P公开了“与测量胞间15N-甘氨酸前体的丰度一样，利用稳定同位素例如15N马尿酸盐测定灌注鼠肝中载脂蛋白B的合成”。核酸测量中应用了同位素，同位素特定为甘氨酸。参见J.Lipid.Res.，30卷，No.6(1989)p.841-6。
化学文摘，87卷第1期，文摘号1970z公开了“稳定同位素法用于胸苷插入DNA的测定”。文摘公开所述同位素是一种治疗癌症的细胞生长稳定同位素。Henk，Henry d’A.；McReynolds，James H.；Anbar，Michael；细胞组织动力学，1977，10卷，No.2，p.111-19。Heck等将稳定同位素标记的前体提供给DNA，测量标记DNA的增加。他们没有使用任何全程前体，例如甘氨酸。他们没有做任何在线分离。他们用薄层色谱分离每种核酸，将每一纯化点进行MS分析。
Song和Abramson，三氟化氮化学反应偶联质谱中检测磷、氘、氯和硫的一种新的反应气体。美国质谱学会杂志，No.6，1995，pp.421-427。该出版物一般性公开化学反应偶联质谱(CRIMS)可以不使用放射性标记物研究代谢。
Slatkin等，稳定同位素，第三次国际会议记录。人小脑DNA中稳定碳同位素比率的尸检研究初步结果。该研究显示欧洲人和美国人/加拿大人小脑DNA中稳定碳同位素比率水平不一致。DNA被燃烧分离，在气相色谱上纯化CO2，然后用质谱测定。这项工作没有尝试通过将标记的前体提供给DNA，来改变DNA中同位素的比率，而正在测试对不同培养物提供不同的前体如何导致受体DNA中13C比率的不同。同时也对身体其它部分，例如蛋白质、卵壳碳水化合物等进行了类似测定。
Berthold等，完整的外源嘧啶(而不是嘌呤)核苷插入肝RNA的证据，国家科学院论文集，92卷，10123-10127页。该出版物报道螺旋藻在13C标记的环境中生长。将该螺旋藻喂给鼠。这些动物的肝脏分析显示，大量外源嘧啶插入肝脏核酸。几乎没有标记的嘌呤核苷插入肝脏核糖核酸(RNA)。检测是用气相色谱/质谱进行。
Strong等，生物化学杂志，260卷第7期，4月10日，1985，pp.4276-4281。质谱检测同位素标记实验的分析方法的新进展。该出版物公开了使用15NH4Cl和L-谷氨酸作为前体在嘧啶(尿嘧啶)全程生物合成途径研究中的应用。用质谱定量测定标记尿嘧啶。作者没有测定DNA合成率。
Macallan等提供了用稳定同位素和质谱测量DNA合成率的不同方法。Macallan等已经表明DNA合成率可以用稳定同位素前体和质谱测量。他们的方法在很多实质性方面与本发明人的方法存在显著不同。前体，[6，6-2H2]-葡萄糖，不象本方法插入核酸碱基，而是标记脱氧核糖成分。这样，DNA的每种构成成分都将被标记，因此不能提供任何内标。而且，葡萄糖是一种具有高血浓度的营养物质，与甘氨酸或任何组成DNA的核苷或碱基相比至少需要100倍以上的标记物质，才能达到同样的同位素丰度。第二个主要不同在于Macallan的方法使用气相色谱(GC)分离并导入DNA成分，而不是象本发明人那样使用高效液相色谱(HPLC)。使用GC，核苷必须经化学衍生化，这个程序导致检测标记DNA来源物质时质量存在16％的干扰。优选使用HPLC，这样可减小干扰，因为不需要衍生化。第三个不同在于Macallan用质谱检测了全部衍生化核酸，而本发明人使用的是CRIMS。通过这种操作，本发明在检测用来标记DNA来源的物质时仅存在1％的质量干扰。最后，通过使用CIRMS而不是Macallan的常规MS方法，本发明人能够确定也许比Macallan方法低1000倍的同位素丰度，因此使得该方法更适用于Macallan检查培养中的细胞、鼠肠上皮细胞、胸腺细胞、肝细胞，以及人的粒细胞。
本领域目前使用放射标记的氚代胸苷进行代谢诊断实验。因此，不使用放射性标记物进行灵敏的DNA合成检测和诊断检测在本领域中是必要的。本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种不使用放射性标记物，测定DNA合成的灵敏分析方法。发明概述在一个优选实施例中，本发明提供了一种检测DNA合成的分析方法，包括以下几步
(a)将用稳定同位素标记的DNA前体加入正在复制的DNA样品；(b)分离含有所述稳定同位素的所述DNA样品部分；(c)用同位素比率质谱测定新合成的DNA中稳定同位素标记的丰度，其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或通过生化代谢补救途径插入DNA，并合成到DNA的新链中。
在另一个实施例中，本发明提供了测定复制DNA中稳定同位素(氢、碳、氧和氮)丰度的方法，包括以下几步(a)将一种稳定同位素标记的DNA前体加入正在复制的DNA样品；(b)分离含有所述稳定同位素的所述复制DNA样品部分；(c)用化学反应偶联质谱测定新合成的DNA中稳定同位素标记的丰度，其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或通过生化代谢补救途径插入DNA，然后合成DNA的新链。
在另一个实施例中，本发明提供检测DNA合成的分析方法，包括以下几步(a)将稳定同位素标记的DNA前体加入正在复制的DNA样品；(b)分离或纯化含有所述稳定同位素的所述复制DNA样品；(c)燃烧步骤(b)的DNA用以产生稳定同位素标记的燃烧产物(例如CO2)，以此测定该产物的丰度；(d)用质谱测定新合成DNA中稳定同位素标记的丰度，其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或通过生化代谢补救途径插入DNA，然后合成DNA的新链。
本发明有利地提供了检测DNA合成的分析方法，包括以下几步(a)将稳定同位素标记的前体加入正在复制的DNA样品；(b)分离或纯化含有所述稳定同位素的所述复制DNA样品；(c)用任意方法降解步骤(b)的DNA；(d)色谱分析步骤(b)或(c)得到的DNA；(e)用质谱测定新合成的DNA中稳定同位素标记的丰度，其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或通过生化代谢补救途径插入DNA，然后合成DNA的新链。
再一个实施例提供了测定DNA合成的分析方法，包括以下几步(a)将稳定同位素标记的DNA前体加入DNA，其中所述标记的DNA前体不是标记所有四个DNA碱基；(b)分离或纯化含有所述稳定同位素的所述复制DNA样品；(c)降解步骤(b)的DNA；(d)用高效液相色谱分析降解后的DNA，其中所述色谱可以使用无标记的DNA构成成分作为标记DNA的内标；(e)用化学反应偶联质谱(CRIMS)测定DNA中稳定同位素标记的量；其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或通过生化代谢补救途径插入DNA，然后合成DNA的新链。
应用本发明的分析方法提供测定化疗药物有效性的方法，包括(a)将稳定同位素标记的前体提供给接受化疗患者的DNA，其中所述标记前体不是标记所有四个DNA碱基；(b)从所述接受化疗患者体内提取复制的DNA样品；(c)分离或纯化含有所述稳定同位素的所述复制DNA样品；(d)降解步骤(c)的DNA样品；(e)色谱(优选高效液相色谱)分析降解的DNA，其中所述色谱可以使用无标记的DNA构成成分作为标记DNA的内标；(f)用质谱测定DNA中稳定同位素标记的量，其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或通过生化代谢补救途径插入DNA，然后合成DNA的新链。
从接下来的详细描述和附图中，相关领域的技术人员将很容易理解本发明的上述及其它目的，其中仅仅简单地以实施本发明的最佳方式的举例说明的形式，显示和描述了本发明的优选实施例。因此很容易理解在不偏离本发明实质和范围的情况下，在相关技术领域内，可以改良本发明。
图1.表明本发明优选实施例中使用的色谱/质谱设备概貌。
图2.为具有Vestec Universal接触室的用于引入HPLC的CRI-MS探针的示意图。
图3(A-C)用HPLC/CRI-MS对未标记的色氨酸，接着对13C-标记的胞嘧啶的流动注射分析。图3A表示基本上除去所有自然发生的13C后的示踪物丰度，表明标记的胞嘧啶响应仅为8ng。图3B显示在m/z44色谱图上未标记的12C信号。图3C表示未标记的色氨酸(左边第5个峰)和标记胞嘧啶(右边第6个峰)的流动注射分析图(即直接或不通过色谱柱)。
图4(A-B).利用富含的15N和HPLC/CRI-MS来确定咖啡因的代谢模型。图标X＝黄嘌呤，U＝尿酸，数字指甲基的位置。咖啡因＝137X。图4A显示总碳，图4B显示富含的15N。
图5为装置体系的框图。
图6表示嘌呤中碳和氮原子的来源(Lehninger之后)(L2)。
图7表示从HEP G2细胞中提取到的DNA核苷的HPLC/CRI/IRMS色谱图。11.2分钟的洗脱峰是未知峰。m/z45的放大倍数是m/z44的100倍。
图8表示在连续用1-13C-甘氨酸同位素标记过程中，HEP G2细胞的DNA中dA和dG中13C的增长状况。未获得第5天dG的数据。符合等式δ13C(t)＝δ13C(ss)×(1-e-kt)。dA的相关系数为0.994，dG的相关系数为0.986。
图9表示标记甘氨酸一天脉冲之后，从HEP G2细胞提取到的DNA中dA和dG中13C的清除。数据符合等式δ13C(t)＝δ13C(0)×e-kt。第0天的点不适用于模拟等式。dA的相关系数为0.974，dG的相关系数为0.994。
图10表示HEP G2细胞在培养过程中的生长曲线。同样显示第2天到第12天符合对数生长。相关系数为0.958。
图11(A-B)显示培养的HEP G2细胞在生长过程中，3H-胸苷插入到DNA中(11A图)，和从DNA中清除(11B图)。曲线符合指数增长和衰减(见图8和9)。增长时的回归系数为0.997，衰减时的回归系数为0.998。
图12表示在进行的七种类型的实验中HEP G2各自加倍时间的概图。每个横杠代表符合指数生长的细胞数和从适当的非线性回归模拟得到的参数的标准偏差。发明详述本发明因此提供一种检测DNA合成的分析方法，包括以下步骤(a)将稳定同位素标记的DNA前体加入正在复制的DNA样品；(b)分离或纯化含有所述稳定同位素的所述复制DNA样品；(c)燃烧步骤(b)的DNA，产生稳定同位素标记的燃烧产物(例如CO2)，对其进行丰度测定；(d)用质谱测定新合成的DNA中稳定同位素标记的丰度，其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成或经生化代谢的补救途径插入DNA，合成DNA新链。分析中的稳定同位素可以为氢、氧、碳或氮的稳定同位素。
在优选实施例中，标记的DNA前体选自甘氨酸、腺苷、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶之一。DNA全程代谢途径、或者合成DNA的补救途径的任意前体均可以用于本发明。
在供选择的另一个实施例中，色谱类型为高效液相色谱，气相色谱或毛细管电泳。在最佳实施例中色谱装置与质谱连接。
本发明的分析方法中可以使用任何光谱仪。化学反应偶联质谱或同位素比率质谱提供最佳测量结果。
本发明的分析方法可以使用非放射性示踪技术，用于测定DNA合成率。将一种或多种稳定同位素标记的前体提供给一种或多种DNA构成成分，然后从目标细胞中提取DNA，测定其中稳定同位素标记的量，从而确定DNA合成。为实施该方法，加入一种或多种DNA某部分的合适的稳定同位素标记的前体(例如1-13C-甘氨酸或15N-标记的胸苷)，以确保合成的DNA含有稳定同位素。例如甘氨酸一位上的13C原子经嘌呤的全程生物合成途径插入其中，然后合成DNA新链，一种标记的碱基将用于测定补救途径。测定稳定同位素标记的DNA涉及质谱(MS)的应用。该技术可以根据使用的质谱(MS)的特殊类型，测定氢、碳、氧和氮的稳定同位素丰度，可以检测到百万分之一的过量同位素。
本发明方法的一个实施例中，标记的DNA前体是1-13C甘氨酸，合成DNA的嘌呤仅C5被标记，嘧啶没有被标记。或者DNA前体可以是任意胞嘧啶、腺苷、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和未标记的碱基，在测定合成的DNA中鸟苷或腺苷丰度的色谱中可以作为基线。
目前DNA还不能用MS准确测量，但是有很多方法可以使DNA适合这种测量。可以纯化DNA和/或燃烧DNA，由此产生可以测定丰度的CO2。或者可以完全降解DNA，例如降解为核苷酸、核苷或碱基，然后通过导入层析进行分析。
近来，高效液相色谱(HPLC)柱已经显示能够洗脱包含数千碱基对的DNA片段。限制性酶水解用于将基因组DNA降解到可以用于色谱分离的水平。另外，上述任何方法均可以用于测量DNA标记的逆转率。
当加入DNA的稳定同位素前体消失后，标记的DNA的丰度将按照正在合成或修补DNA的速率按一定比例降低。任何改变细胞分裂，或者改变DNA合成或修补的处理方式，都将显示标记DNA在消失速率上的变化。可以研究癌症，衰老和其它一些影响细胞增殖的疾病。这种分析方法具有广泛的应用价值。
可以用该方法测定影响细胞生长的病症或病症的治疗。可以用该方法测定DNA修复速率。因为无放射性，本方法可以用于体内，检测或诊断人类疾病及其治疗，而不必担心射线危害。该分析方法可以用于测定化疗药物对DNA合成的影响。
本发明优选使用HPLC和连续流动同位素比率质谱。组成部分为1.高效液相色谱(HPLC)；2.Vestec Universal HPLC/MS偶联；3.化学反应偶联(CRI)；4.同位素比率质谱系统(IRMS)。
通过毛细管气相色谱偶联传统质谱，CRIMS提供了CRI-MS广泛的应用范围；HPLC与CRI连接的最新进展使得这种研究成为可能。CRI的独特化学性质与传统的燃烧法相比改善了15N的验证准确性。这种类型的装置使应用同位素和IRMS的研究者可以分析更广泛的目标分子，包括完整的生物高分子。与HPLC/传统MS的研究相比，可以在极大程度地降低同位素丰度的情况下选择性检测13C和15N。另外，通过CRI-IRMS可以直接分析完整生物大分子的同位素数量。它极大程度地改善了需要14C作为示踪物或者需要层析分离繁复的水解序列，然后选择单体进行MS分析的生物系统的分析。化学反应偶联室本发明分析方法中优选使用的装置是微波动力化学反应偶联室(CRI)。该装置首先分解分析物，然后将它们重新构成其光谱允许选择性检测其中稳定同位素的有机小分子，该有机分子与起始分析物分子不同；特征在于不需要放射性。CRI的大多数应用涉及层析分离，然后用单一收集器、快速扫描质谱(MS)检测。同位素比率质谱同位素比率质谱(IRMS)安装的多部收集器能够检测比传统质谱可以检测到的数量级低的丰度。
通用偶联(universal interface，UI)基本上能够完全除去分析样品流中的HPLC溶剂。它能够独特地将HPLC引入CRI，甚至1/100,000的溶剂保留都将影响它的化学性质。这升高了IRMS中的CO2基线。在与Vestec公司合作中，本发明人研制了CRI-MS装置，它用高效液相色谱而不是以前介绍的气相色谱方法分离混合物。
这种装置引入一种新的分析概念，HPLC/CRI-IRMS用于诊断分析，尤其是具有生物学和药理学重要性的分析。用这种装置可以检测象脲和氨基酸一样简单的化合物中的稳定同位素，也可以检测象DNA一样复杂的化合物中的稳定同位素。
CRI提供了在使用气相色谱的IRMS装置中作为“标准”的燃烧系统的替代方法。CRI的优点是与CuO燃烧室和其它化学燃烧室的有限能力相比，氧化气体的应用基本上无限制；不进行氮的检测，因此避免CO和N2之间的干扰问题；具有改变化学性质的能力，从而可以监测广泛的同位素种类，例如18O或34S。
HPLC在生物化学领域的不断扩大的应用表明HPLC/IRMS装置主要的发展优势是可对不适合GC分析的物质协助进行代谢研究。除了HPLC可将需要分离样品引入的能力之外，通过流动注射(即，柱后直接导入溶剂流)以前纯化的样品，CRI偶联室适用于更加广泛的物质，尤其是完整的生物大分子。
该装置提供高度精确的同位素验证率，它将极大程度地降低大分子的分析时间，目前这些大分子在确定有多少特别的标记插入其中之前，必须降解为单体(或小的低聚物)，然后必须进一步纯化、分离和分析这些单体或低聚物。GC分析通常需要的碳衍生化前体的异常同位素特征的复杂性，在用HPLC进行的高精度的IRMS测量中将不存在。
通常，人体实验中最好使用稳定同位素，因为它们不存在放射性同位素的相关风险。因为不存在氮的放射性同位素，15N作为示踪物的应用意义尤其重大。与传统MS法相比，IRMS的检测限增强了，这使得它更容易适应人体和其它示踪物实验。生物系统的同位素比率测定生物系统的同位素比率质谱分支于本世纪三十年代末，Rittenberg曾作过早期的工作。一般地说，离线制备合适的样品，通常是通过在密封管中燃烧，转化成小的聚合原子种类例如CO2、N2、和H2O。将这种气体在控制条件下缓慢导入多收集器质谱，以便精确确定45/44(即(13C16O2+12C17O16O)/12C16O2)的比率。这种方法在下文将被称为“离线燃烧IRMS”。
IRMS的具体应用特性开始于1976年。Sano等(S1)首先描述了一种GC、燃烧室、和IRMS偶联在一起的装置。接下来的实例由Matthews和Hayes(M3)提供。他们没有使用多收集器IRMS，即获得13C和15N检测的高精确度和低丰度。通过这种方法，他们能够测定9nmol甲基辛酸盐中0.02 APE1的13C。(1原子过量百分率(A.P.E.)是未知的同位素比率减去标准同位素比率[IR(x)-IR(std)]乘以100，除以[1+IR(x)-IR(std)])。
比较而言，以后涉及的离线燃烧技术具有双进样口、双收集器的IRMS，虽然精确度提高了5倍，但是测量需要230nmol样品以适应这种测量。Matthews和Hayes报道他们的装置可以检测含10nmol碳的样品中0.2pmol的过量13C。对于氮，他们检测了血浆氨基酸，断定在100nmol氮中可以测出4pmol的过量15N。
1984年，Barrie等(B1)将气相色谱与多收集器稳定同位素比率质谱偶联，使用非常类似Matthews和Hayes方法的燃烧偶联法。通常，他们的结果与双进样口双收集器IRMS相比，在δ13C2为2的范围内，即0.2％的偏差。作者论述“我们将期望气相色谱/SIRA[稳定同位素比率分析仪]技术将需要标记的化合物的量至少降低10个百分点，并期望它可以对丰度太低而不能使用GC/MS/SIM[选择性离子监测器]分析的标记化合物进行新的研究”。(2符号δ(‰)表示未知和标准同位素比率之间的相对差δ＝[IR(x)-IR(std)]/IR(std)×1000。)有两种市售的GC/燃烧/IRMS装置，例如Finnegan MAT(F2，H3)符合这种设计思路。公开的数据显示该系统可以获得的精确度可与离线燃烧IRMS分析获得的精确度相媲美。
连续流动GC/同位素比率测量的概念已经清楚地定义和评价过。当GC和燃烧器与用电子增效器在质量峰和检测峰之间转换的单收集器质谱3偶联时，基本上实现了比直接用GC/MS记录选择离子的实验更好的性能。当与具有多Faraday收集器的质谱偶联时，GC/燃烧器/IRMS得到几乎与离线燃烧IRMS法同样好的结果，但基本上来自很少的分析材料。显然，通过在线GC和燃烧器就不需要纯化样品和IRMS检测之前处理样品。(3单收集器或“传统”质谱是指两个质量之间的跃迁、扫描、或检测是连续的而不是同步的任何装置。按照这个概念，大多数四极、磁扇区、离子捕获、以及时间流逝质谱都为单收集器。)在一个用IRMS进行的药理研究中，Nakagawa等(N1)在给Wistar鼠服用2-15N，1-13C-标记的安替比林(antipyrine)之后，用离线燃烧IRMS测量尿和血浆中的13C和15N。他们发现通过GC/MS/选择离子监测测量到的血液总标记浓度和标记安替比林的分浓度具有很好的相关性。他们也能够对尿进行质量平衡研究，这种操作可与放射性标记药物所进行的典型操作相媲美。
另一种IRMS技术是元素分析仪、GC、和IRMS相偶联。1985年(P2)首次实现对13C和15N成功的测定。通过这种联合，首先用填充柱GC分离了混合气体燃烧产物N2和CO2，然后流入双收集器IRMS。它对预分离或未分离材料证明是一种有效的系统，但不能持续与另一种分离装置(即GC或HPLC)连接，因为每种分析都需要花费几分钟的时间。CRI-MS的背景技术Markey和Abramson(M1，M2)研发出化学反应偶联在氦气条件下，将复合分子完全分解成其构成元素的微波动力装置。反应气体(例如氧气)的加入将产生能够反应起始分析物的元素组成的稳定的氧化产物，然后它们通过单收集器质谱检测。这一过程的一般特征可以用下面的模式图1说明(尽管过于简单化)
以字母ABCD表示的复合物分子的组成元素与过量反应气体X在氦气流中混合。在CRI-MS分析中，如果B是一种同位素或感兴趣的元素，它可以用任何MS通过BX的特征性质量得以监测。GC/CRI-MS装置的模式图参考C1显示于图1。毛细管气相色谱与化学反应偶联-质谱的组合(GC/CRI-MS)可以在分析物洗脱出来后，选择性检测分析物中稳定同位素标记的物质。如果分子BX被选择用来监测某一特殊同位素，比如说M+1，按照式1将产生仅显示富含BX的色谱图。
富含的BX＝M+1处的BX-M+1的天然丰度(认为是M处的BX)(式1)。这个等式扣除了BX中同位素的天然丰度的贡献，因此仅剩下BX的M+1示踪物的丰度升高。这就赋予CRI-MS选择性检测同位素的能力。
应用在IRMS操作中的CRI的重要化学性质是氧化。对于包含在以下有机分子中的组成元素，可以看到下面的反应产物[质量表明了多同位素种类的典型范围]C→CO2[m/z44，45，46]→CO [m/z28，29，30]N→N2 [m/z28，29，30]→NO [m/z30，31，32]→NO2 [m/z46，47，48]H→H2O[m/z18，19，20]分析物中的氧原子首先与反应气体中的氧气交换，在巨大的噪音中将不能检测到。来自碳的CO的存在不表示反应不完全，但表示，在温度为-4000°K的氦气流下，除CO+片段之外，CO2自身也不稳定。导入纯CO2显示基本上歧化为CO+1/2O2。观察到的CO通常与CO2的丰度类似。CRI不能允许超过需要量的过多的氧化材料破坏这种平衡，导致m/z44出现大量的碳。CRI中氮的化学性质尤其值得关注。如果O2是反应气体(即为模式图1的X)，观察到的主要类型是N2，以及大约10％的NO和1％的NO2。当SO2是反应气体时，NO至少与N2同样丰富，NO2仍然约为NO的1/10。而质谱观察的反应气体产物图谱显示，O2和SO2均产生大量O3，SO2产生SO3。推测这可能促使N2消耗形成NO。另一种N2和O2在等离子体中相对稳定的观点认为，当N2作为CRI的反应气体时，观察到有机氧主要是O2，而不是氮的氧化物。虽然我们不能完全评价它，N2作为分析17O和18O的方案中的反应气体应该是有用的。
到目前为止的工作已经明确肯定CRI-MS是一种灵敏、可选择和可靠的检测和定量生物系统中的同位素或元素的方法。各种CRI-MS实验已经成功地用于尿、血浆、组织提取物、离体培养的肝细胞、和不存在基质问题的细胞培养基的分析。
图1所示的装置首先安置一种热喷-雾化的氦气流，然后用氦气逆流除去残存蒸气(V1)。保留的溶剂不到106-108分之一。随后一个动量分离器(图2)将氦气流速从L/min降至mL/min，形成分析物颗粒极度“浓稠”地分布在氦气中为特征的样品流。因为不必移动区段，这种方式显示比其它HPLC/MS连接更为优良。UI的流出物应当为1-2mL/min的氮气流输送分析物，该条件适于CRI正常工作。到目前为止本发明人已经设计出有效地将HPLC、UI、和CRI与磁扇区MS(传统的四极MS)和IRMS相偶联的方法。
图2所示的设计图中，将CRI置于动量分离器和Vestec Model 201四极MS之间。本发明人已经得到多种分子的13C选择性同位素数据。图3显示未标记的色氨酸(左5峰)和标记的胞嘧啶(右6峰)的流动注射分析图(既直接或不过柱)。无标记的12C信号在m/z44色谱图中，基本上完全除去所有自然发生13C的示踪物丰度表明它仅对低至8ng的标记胞嘧啶响应。实施例1本发明用15N、13C标记的咖啡因(A2)进行了代谢研究。研究中，给狗口服50mg标记的咖啡因，取24小时尿样。尿未进行任何方式的纯化或提取，但仅用0.22μ的滤器过滤，然后注射到HPLC柱中。从中，我们获得m/z44的普通碳色谱图和富含13C和15N的色谱图。CRI-MS通过合理地监测质量44-45和30-31，能够同步监测13C和15N的丰度。如果与必须转换才能适应这两种示踪物的应用装置相比，该装置的应用更为容易，并能够适应某些存在两种混合示踪物提供信息的多标记实验。
咖啡因的代谢包括氧化为尿酸和脱甲基化为黄嘌呤。在“CRI-MS关闭” 操作模式下，用选择离子示踪物确定哪一个富含的CRI-MS峰属于哪一类代谢物；例如，二甲基黄嘌呤、单甲基尿酸等，然后用可靠的标准通过保留时间分辨同素异形体的定位，确定了如图4所示的代谢曲线；上图为总碳，下图为富含的15N。HPLC/CRI方案的结果非常优秀，因此现在应当迅速将应用范围从仅需要传统MS的应用推广到能够开发同位素比率质谱的独特优点的应用。实施例2本发明人使用IRMS评价天然来源分析物的同位素丰度的酶依赖性差异，其中稳定同位素用作示踪物。示踪物研究限定在不同生物来源分析物的δ13C范围内。对于氨基酸，该范围约为每mil(S3)±4。
HPLC/CRI-MS检测之后，需要HPLC而不是GC分析的分析物不适合直接进行质谱验证。对于高极性或不稳定分子，需要通过电子离子化或化学离子化进行衍生。热喷对这样一些分析物也许是有利的；其它类型的分析物也许需要快原子轰击(FAB)。FAB对生物聚合物也许有必要，然而更大一些的分析物应该用激光解吸附MS。
完整生物大分子的同位素分析在蛋白质、DNA等的反转和库大小研究中很有价值(例如A3，P1)。用13C，15N，或D高度标记(97％或更高)的藻类具有商业利用价值。通过分步沉淀和/或制备色谱，从中得到蛋白质、DNA、磷脂和碳水化合物。可以得到无标记的相同的藻类衍生物。用同位素稀释无标记大分子组分可以模拟部分标记这种聚合物的状况。不同尺寸的样品经较大的，具体地说为500μL的HPLC注射回路，以0.5mL/min溶剂泵注射入HPLC，输出不通过柱子直接传送到偶联室。通过这种方式，可以导入比用毛细管GC(观察到CRI的限度为100ng/sec)更多的物料。也可以使用具有较长输入时间的较大注射室。样品越多，检测限越低。参见分析化学，68卷，11期(1996)，利用气相色谱或液相色谱引入化学反应偶联的连续流动同位素比率质谱，Teffera，等，通过参考文献其全文插入此处。
下面是当分析完整大分子时，CRIMS性能的模型计算。例如，将白蛋白分子(MW 69,000，含有584个氨基酸，每个氨基酸含有平均0.7摩尔的N2)降解用于同位素分析。不标记时，用IRMS测得的N2的29/28质量比率为0.0073570(M3)。如果将一个色氨酸分子中的一个氮原子用15N标记1％的水平，则得到N2的同位素比率为0.013679。[计算时白蛋白具有583个氨基酸，每个氨基酸含有平均0.7摩尔的N2(天然丰度为0.0073570)加上色氨酸的一个未标记氮原子和一个标记氮原子(提供1摩尔N2，同位素比率为0.013678，即0.003678+0.01)，所得结果被产生的总氮-28相除(即583×0.7×0.9926421+1×0.98632)。]新比率等于0.0070 15N的A.P.E.，该值远低于以前CRI-MS的测量极限(2nmol氮的A.P.E.为0.059)(C2)，利用元素分析仪-IRMS连用很容易得到1μmol N2水平时0.0006 APE范围内的最小值(P3)。测量31/30NO的比率时，APE为0.0021。
因此，上述离线同位素标记实验是随着硬件应用的发展而发展。人们应该意识到它仅需要消耗2.5nmol白蛋白即可提供1μmol N2或2μmol NO。相比较而言，适当衍生的色氨酸的GC/标准-MS分析产生质量为375的主要离子片段，它的同位素峰在m/z376，其丰度约为30％。
对于可检测到的丰度水平，GC/MS结果具有高度精确性(即，当检测精度＜2％时，376/375比率将增加到30.63％)。实施例3在一个实验中，检测了用2H4-对乙酰氨基酚处理的仓鼠尿样。利用HPLC/CRI-MS检测了未脱结合的对乙酰氨基酚尿样，从而简化了代谢研究实验。对于CRI，结合特征并不重要，因为结合葡萄糖醛酸盐、硫酸盐、氨基酸、多肽、或磷酸盐的样品中的标记物是可以检测到的。实施例4该设计方案的一个实际应用例子涉及疫苗的合成。疫苗的合成方法已经成型，包括将两个大分子与己二酸二酰肼连接(C5)。结合反应的程度不能绝对地测量出来，因为目前应用的显色反应产生的产物，不同结构即具有不同的吸收度。为了符合FDA对反应过程的指导原则，需要绝对定量的方法。技术人员可以容易地得到15N二酰肼，因此测定生物大分子产物中15N的量，将能够准确地确定反应程度。完整疫苗分子量约为2×106道尔顿，因此它超出了所有质谱法的范围。既然多糖的每个组成单元都含有一个氮原子，模型计算显示以这种方式插入的15N恰好在CRIMS设备的测量范围内。实施例5本发明改善了稳定同位素的性能，因此可以减少放射性同位素的应用。质量平衡研究中使用了一个特殊的应用放射性同位素的“标准”方法。将标记物质加入某些生物系统，检测该系统组分的标记物含量。该典型的标记物为14C，无论标记物为何种化学形式，闪烁光谱都可以有效地计算标记物的数量。如果实验对象是动物，可以提取尿、胆汁、粪便、唾液等生物样品。如果实验对象是细胞系统，可以记录细胞提取物。本发明人评价了用于该目的的流动注射HPLC/CRI-IRMS系统。
概括地说，权利要求的分析方法中的生物装置操作方法改善了稳定同位素的质谱检测法。实施例6利用稳定同位素进行的代谢曲线研究对于稳定同位素13C、15N、和2H(D)，给狗静脉注射50mg适当标记的苯妥英，提取48小时尿样的1％水溶液用于分析(C1)。对于每种标记物，色谱可以验证含有总标记物1.5％以下标记物的代谢物。信噪比为2时，尿样中15N标记的代谢物的检测限为380pg/mL，13C标记的代谢物为7ng/mL，氘标记的代谢物为16ng/mL。转化为上柱量，15N标记的苯妥英为0.44pmol，13C标记的苯妥英为12.3pmol，氘标记的苯妥英为95pmol。随着检测的同位素的不同，观察到CRI-MS检测的线性动力学范围为250-1000不等。
CRI-MS或连续流动IRMS的分析特征类似于放射性同位素的检测，即只需关注标记物质而不必考虑其特殊化学形式。该实验将指导今后的研究向定量鉴定已知代谢物中的“标志性”物质的方向发展。一旦进行鉴定，同位素选择色谱下的峰面积可以用于定量代谢模型。因为每种代谢物都只需鉴定相同的降解分子，因此这种定量实验不需要进一步校正；而且如果代谢物中标记物的数量是已知的，就不需要合成每种代谢物以获得灵敏度因子。
这项实验涉及检测13C标记的色氨酸在肝瘤细胞中的代谢。将标记材料加入培养基，培养细胞4天，倾析提取上清液，进行t-丁基二甲基硅烷(TBDMS)衍生化。CRI-MS检测发现三个13C标记的峰。其中两个峰在初始培养基中也发现存在，扫描实验鉴定是标记色氨酸的两个不同的衍生化形式(顺式和反式TBDMS)。一个未知峰根据其质谱图暂时确定为(吲哚)-N-甲酰基-色氨酸。鼠腹膜内注射13C标记的色氨酸之后，尿中也发现类似化合物和(氨基)-N-甲酰基-异构体。这个实验表明CRI-型偶联的不依赖化合物的检测能力使分析者有可能得到完全意料不到的结果。
本发明人也分析了培养过程加入13C标记的(S)-丙戊酸的鼠肝细胞提取物样品。样品被三甲基硅烷化，然后用毛细管柱进行色谱分析。通过富含的13CO2信号，我们能够观察到氧化产物的范围，而且通过监测m/z30频道(14NO)观察到两个没有预料到的代谢物。丙戊酸自身不含氮，因此他们可能是以前没有识别的其结构中已经加入氮的代谢物(也许是通过结合)。
实验的范围表明GC/CRI-MS能够对广泛的生物来源的样品进行很好地操作，它为科学家进行代谢研究提供了重要的分析工具。
使用苯妥英进行操作(C2)，评价GC/CRI-MS对同位素比率测定能力的实验。存在500、50、和5ng无标记苯妥英时，13C标记的苯妥英的检测限分别为10、3、和2.5ng。它们表示380-38000pmol总CO2中过量13CO2为30-120pmol。测量最低摩尔富集量为2.0％，它相当于该样品A.P.E.的计算值0.278或δO/OO234(即1.1％天然丰度中23.4％的富集量)。存在上述三个量的无标记苯妥英时，15N-标记的苯妥英的检测限均为0.3ng。这表示40-4000pmol总NO中过量15NO为2.4pmol。测量的最低摩尔富集量为0.00059，它相当于该样品A.P.E.的计算值0.059或δO/OO148。存在500ng无标记苯妥英时，可以测量低至1ng的D-标记苯妥英。这代表40pmol过量氘。虽然它的摩尔富集量为0.096％，但不能通过实验确定富集量。观察到所有这些实验的变异系数均为3-6％。IRMS具有的主要优点在于精度呈数量级提高，因此可以测量相对较低的同位素比率。实施例8检测13C时，氧化反应环境中使用13CO2产物。通过确认固有且已知的内源物质的高度(但不是无限)近似的天然丰度，可以产生单一富集色谱图。M+1处观察到的信号是天然同位素丰度加所有存在的高于天然同位素丰度的附加贡献的和。因为对m/z44和45都进行了监测，因此我们可以通过从m/z45频道中减去m/z44产物的强度和该物质的M+1峰代表的天然丰度部分，通过计算扣除天然丰度对m/z45频道的贡献(A1)。对于CO2，13C和17O的贡献约为0.0119。因此，等式富含的13CO2＝m/z45-0.0119-m/z44(1)取消了m/z45频道中的所有非富含峰，并且提供了显示选择性含量高于天然丰度的13C峰的单一富含色谱图(enrichment-only chromatogram，EOC)。监测13C的频道与监测12C的频道同样复杂。在13C单一富含色谱图中，仅观察到标记药物、其代谢物和内标。即使对照实验(没有接受药物的狗)尿样的TIC色谱，也显示几乎与12C标记看到的图谱同样复杂，而EOC中则明显较为简单。
在产生EOC时，用到Teknivent数据系统的特殊性质，被称之为CALC。CALC可以对一个或多个频道的数据进行代数处理。可以进行简单计算例如一种质量的强度除以另一种质量的强度，以及更多的复杂计算。得到的结果是能够被描绘、积分等的新频道数据，初始质量频道可以是任何方式。如果等式(1)编入CALC程序，即可以得到13C-EOC。这种本质特征在任何其它生产者的数据系统中都未曾应用，它解释了为什么我们实验室在这一点上唯独使用Teknivent数据系统。
对于15N，使用了同样的监测方法。检测类型是m/z30和31的NO。使用SO2作为氮的反应气体，显示它具有极其重要的优点。SO2作为反应气体时，来源于分析物中的氮的NO产量比O2作为反应气体高出若干倍。用SO2作为反应气体，NO至少与N2一样丰富，而氧仅约有N2丰度的10％。因为产生CO和CO2片段，m/z28和29不能用于选择性监测14N14N和14N15N。另一方面，因为m/z30和31仅代表氮，因此在探测m/z44和45的同一操作中，允许同步监测13C和15N。为了产生15N单一富含色谱图，我们使用NO的m/z31天然丰度0.00403乘以m/z30的强度，之后从观察到的m/z31信号中减去该值。
表1.CRIMS化学性质概述<
a仅对于有用的多种同素异形体的种类才用多种质量表示。b表示精确质量，为获得选择性结果需要高分辨率。c其中SO2表示反应气体，其它氧化气体例如O2将得到同样的产物，但产率不同。d我们推测选择性检测13C是可能的，但还不能证实。e18O的检测结果来自这个实验室(未公开)。实施例9本发明人也利用直接探针作为将样品导入CRI-MS的方式，对选择元素或同位素进行分析。本发明人在该领域公开的工作中，检查了蛋白质中的硫含量(A3)。重量低于20ng的多聚蛋氨酸的SO2氧化产物观察到线性信号。对于12个1μg不同组成的蛋白质，发现S/C原子含量的理论值和观察值之间具有很好的相关性(r＝0.80)。实施例10在癌症的化疗中，该检测可以提供关于干细胞储备的信息，因此可以防止化疗之后严重的嗜中性白血球减少症。分析还包括一个移植模型，监测淋巴细胞对移植药物的作用。在另一个免疫学应用中，检查了病人对药物的高敏感性。最后，本发明也应用于衰老研究领域。
据估计80％的老年人患有生长激素减少症(hyposomatomenemic)，无论老年人还是年轻人使用生长激素的频率不断增加，此种情况属于一个新的研究领域。生长激素能够逆转衰老过程中的胸腺退化，并促进骨髓细胞造血功能。
本发明人设计了测量DNA合成率的无放射性、无毒的方法。这种对细胞复制的基础性测量，在3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-dT)或溴代尿嘧啶脱氧核苷(BruU)实验系统中非常容易操作，在临床环境下却不易进行。放射性同位素的使用以及其随后插入细胞核，抑制了它的应用。虽然越来越多用卤化嘧啶例如BrdU，但它们具有毒性和致突变性。相比较而言，稳定同位素用作示踪物已有50多年的安全史。用稳定同位素标记的物质即甘氨酸，作为嘌呤全程生物合成的前体，避免了任何有关安全性的担忧，并将促进一种完全成熟的方法在基础合成过程、疾病、和影响细胞增殖的治疗研究中的临床应用。
对于这些测量，可以使用化学反应偶联/质谱(CRIMS)，它由一个基本概念发展成为一种选择性、灵敏性、多样性技术，通过该技术可以监测代谢研究中的目标同位素或元素(A1)。CRIMS同时可以使用放射性同位素，其中不必关心目标物质存在的化学结构即可监测。使用CRIMS时，完整分析物降解成为其组成元素的高温电子流形式，然后与反应气体原子相互作用形成一系列新的小聚合原子类型，它们通过质谱检测。一种特定聚合原子的存在标志着特定元素的存在，定量那些聚合原子的丰度，可以从内源物质中分辨出富含的聚合原子的同位素信号。
以前，本发明人已经比较过使用标准14C和放射性监测测定在药物代谢研究中，用HPLC/CRIMS检测稳定同位素具有何种优点(A2)。将放射性同位素和稳定同位素混合标记的tirilazad对猴和狗给药之后，对胆汁样品的药物代谢物进行一系列平行高效液相色谱分析。比较了CRIMS与放射性监测(RAM)的检测全面性、色谱分辨率、灵敏性、信躁比、和定量能力，各项指标RAM均不优越。利用HPLC/CRIMS，可以全面检测稳定同位素例如13C和15N，并且当使用14C时，可以表示生物液体中药物代谢的量化模型，该模型能够反应一定结果。因此稳定同位素在代谢研究中可以代替放射性同位素，其中后者不依赖标记物存在的结构而检测标记物的能力，是继续使用这类危险并且昂贵示踪物的主要原因。
比传统质谱性能优越之处在于为测量稳定同位素丰度而优化质谱的特殊配置一多收集器同位素比率质谱(IRMS)。设计的一种IRMS能够接受气体样品，例如CO2，将该气体高能离子化，转化成适当的离子进入能够同时监测两到三种离子的多收集器。应用IRMS可以测量13C和15N丰度的天然变异(B5)，拓宽了示踪物插入的数量级范围，该数量级范围低于传统GC/MS或HPLC/MS系统能够获得的数量级。(G2和B3)。应用CRIMS检测以前，将色谱与IRMS偶联涉及燃烧偶联(B5)。本发明人用化学反应偶联室将色谱与IRMS连接起来(T1)。该研究方向的最重要一点是建立了连续流动HPLC/IRMS组合。对于本系统，HPLC的引入和GC的引入对于测量同位素比率的精确性是相同的(T1)。
氚代胸苷是测量DNA合成率的标准方法。可以对促进细胞增殖的试剂，或减缓细胞循环进度的特殊作用进行定量。细胞动力学研究中，流动细胞技术和显微镜检查过程中发展的卤化嘧啶技术基本上代替了3H-dT的自动射线照相术。BrdU技术得以广泛应用的原因是它灵敏、快速、并且容易操作。该方法的实质是体外短期培养过程中用BrdU间歇标记细胞，或者通过体内一次性注射标记细胞。然后用抗BrdU的单抗对细胞染色，用流动细胞计数器或显微镜分析。细胞培养中，连续接触BrdU可能造成细胞功能过剩的不利影响，包括由于核苷酸池的平衡改变，DNA的直接破坏，以及DNA-蛋白质相互作用的改变导致的变化(O1)。
核苷酸的全程生物合成已有详细描述(L2)。甘氨酸的碳和氮插入嘌呤(见图6)。此处可能存在的问题是甘氨酸的C2直接转入四氢叶酸衍生物，并与丝氨酸的C2和C3相互混合。这两个丝氨酸碳中的一个也可能在后续步骤中变成叶酸盐的一个碳基团。叶酸盐涉及胸苷的全程生物合成。就象下面将要描述的，示踪甘氨酸没有标记dT非常重要，因为dT的13C同位素比率将作为脱氧鸟苷或脱氧腺苷丰度测量中的对照。因此，首次研究使用1-13C-甘氨酸作为嘌呤前体。
利用HEP G2人肝细胞瘤开始研究。HEP G2细胞经常用于代谢研究，特别是关于脂类的研究、和脂蛋白合成(J1)。这些细胞生长健康快速，因此将它们制成颗粒使用。实施例11探针1-13C-甘氨酸经全程生物合成插入嘌呤。人肝瘤细胞系HEPG2在含有1-13C-甘氨酸的培养基中生长，不同时间收获细胞，提取DNA。然后水解成核苷，进行反相HPLC分离，得到脱氧胸苷(dT)、脱氧腺苷(dA)、和脱氧鸟苷(dG)的分离峰。HPLC的流出物连续进入化学反应偶联室和同位素比率质谱(HPLC/CRI/IRMS)。CRI产生的CO2的同位素比率用于监测丰度。细胞在标记培养基中连续生长5天，也在一天的脉冲标记实验中生长，在该标记实验中观察随后九天标记物的清除。同预测的甘氨酸在嘌呤全程生物合成中的作用一样，嘧啶dT的同位素比率没有改变。然而，对于两种嘌呤，dA和dG，细胞的特征性对数生长行为在它们的13C/12C比值中同样观察到，各类实验的的加倍时间均有很好的一致性。通过直接细胞记数和插入氚代胸苷，测量培养中的HEP G2加倍时间的平行实验来验证该方法。1-13C-甘氨酸结合HPLC/CRI/IRMS的应用形成用无放射性、无毒示踪物测量人类DNA合成率方法的基础。细胞培养HEP G2细胞在25mL不含酚红的Dulbecco最小基本培养基(SigmaChemical Co.St.Louis，MO)上生长，每个底面积为150cm2的培养瓶中铺2.5-10×106个细胞。每升培养基添加10％胎牛血清，1％penstrep，4.5g葡萄糖、2.7g碳酸氢钠、0.58g谷氨酰胺、和0.11g丙酮酸盐。调整终pH至7.1-7.3。胎牛血清和penstrep购自Biofluids(Rockville，MD)。所有其它化学试剂均购自Sigma，为细胞培养纯。培养基中含有0.4mM甘氨酸。加入各种量的13C标记的1-13C-甘氨酸(99％CambridgeIsotope Laboratories，Andover，MA)，以获得所需的丰度水平。细胞培养在37℃、95％的相对湿度和5％的CO2浓度条件下。每隔两天用25mL培养基继代培养细胞，每周扩增10倍。DNA分离用PuregeneDNA分离试剂盒(Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MN)提取DNA。所有用到的酶来自Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。理想天数收获两到三瓶(共含1-2×108个)细胞，用PBS溶液清洗收获的细胞。上述细胞转移到50mL管中，500×g离心5分钟。弃去上清液，加入30mL溶胞缓冲液。接着，加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，37℃保温2小时。然后，加入RNase至终浓度为20μg/mL，37℃保温2小时。然后，将10mL来自Puregene的蛋白质沉淀溶液加入溶解细胞中，涡旋振荡30s，2000×g离心10分钟。含有DNA的上清液倾倒入含25mL iPrOH的新管中(留下蛋白质沉淀)，然后轻轻上下颠倒50次混合样品，直到可见到白色线状的DNA，再次于2000×g离心10分钟。DNA形成白色沉淀。上清液倾倒出去，在滤纸上吸干管中液体。然后，加入30mL70％的乙醇，上下颠倒管子几次以清洗DNA，2000×g离心5分钟，小心倾倒出乙醇。然后，在滤纸上吸干管中的液体，空气干燥样品5分钟。最后，加入2.5mL水，再次干燥DNA过夜(或者65℃干燥1小时)。DNA消化DNA样品用Saris等(S2)描述的改良方法酶解为核苷。所有用到的酶也来自Boehringer Mannheim。DNA在沸水中热变性3分钟，然后，迅速用冰水冷却。将下列试剂加入变性的DNA溶液(0.5mg/mL)(每毫升)100μL10×缓冲液(20mM MgCl2，10mM ZnCl2，500mM Tris，pH7.2)；10μL核酸酶P1(0.5U/μL)；20μL(4mU/μL)磷酸二酯酶。溶液37℃保温2小时。然后加入1μL10M的乙酸铵(pH9.0)和5μL碱式磷酸酶(1U/μL)，37℃再保温2小时。核苷的纯化和分析HPLC溶剂来自EM Science(Gibbstown，NJ)，它的蒸发残留物低于0.1ppm。所有HPLC实验都用一对Isco Model 260D(Isco Inc.，Lincoln，NE)注射泵与Gilson Model 811C动力混合器(Gilson Co.Inc.，Middleton，WI)相偶联进行操作。样品溶解于去离子水，通过具有100μL注射室的Model 7125阀(Rheodyne，Coati，CA)注射样品。用0.22μm的尼龙滤器(Micron Separations Inc.，Westboro，MA)过滤核苷混合物，用Waters(Milford，MA)Nova-C18填充柱(8×100mm，60埃)纯化核苷混合物。流动相A是5mM乙酸铵(pH4.0)，流动相B是50∶50的乙腈∶水(v/v)。洗脱液条件为0％B5分钟，然后5分钟内线性梯度至90％B。流速为2mL/min。收集核苷流份，Speed Vac浓缩流份。在进入CRI/IRMS之前，核苷注射入100μL进样室，用Supelco(Bellefonte，PA)18-S柱(4.6×250mm，5μm)分离。使用的梯度为15分钟内从5％的B到20％的B(线性)，流速1mL/min。如得到的色谱图所示(见图7)，该方法得到良好分离。纯化步骤除去主要杂质，但同时也除去大多数dC。dT不受纯化影响，因此如果甘氨酸是标记实验物质，dT就成为同位素比率分析中的优选内标。
用Finnigan/MAT Delta S IRMS(Finnigan/MAT，San Jose，CA)进行同位素分析，同时HPLC/CRI偶联(T1)与其连接。CRI的反应气体是UHP氧(Matheson Gas Products，East Rutherford，NJ)。各峰用1mV/s的斜率灵敏度一体化，该值发现能够得到最佳重现性。大多数样品分析3-5次，绘制标准差。增长和衰减的测量和动力学分析使用丰度为33％的1-13C-甘氨酸进行实验。首先单独测定内标5’-氟-2’-脱氧尿嘧啶(Sigma)的同位素比率(δ13C＝-25.3％4)，核苷的δ13C值基于该同位素比率。从这项初步实验结果，确定了较低程度的丰度。下一步实验在丰度达3.3％的甘氨酸存在下连续培养细胞，研究5天以上标记物的增长。第三步实验用9％丰度的甘氨酸脉冲一天，检查随后9天插入的标记物的清除。(4高精度IRMS数据常规表达为每密耳(‰)，而不是百分数。数据表示为δ13C‰，按照下式计算1000×(IRx-IRPDB)/IRPDB，其中PDB为国际同位素比率标准，(IRPDB)＝0.0112372。)这些实验数据符合适当的指数增张或衰减等式。使用SlideWritePlus for Windows4.0版(Advanced Graphics Software，Inc.，Carlsbad，CA)的模拟曲线程序获得这些等式的参数。
利用产生HEP G2细胞生长率的“常规”数据的两种方法之一将在这些细胞的正常培养期间进行一系列细胞记数。用胰蛋白酶处理之后，沉淀细胞，然后悬浮得到约200,000个细胞/mL的浓缩液。100μL这种悬浮水溶液稀释于9.9mL Isoton II(Coulter Corp.，Miami FL)。用Coulter计数器ZM对细胞记数。
产生关于细胞生长率的比较数据的第二种方法是使用氚代胸苷。HEP G2细胞培养基添加0.1μCi/mL 3H-dT(Amersham Life Science，Arlington Heights，IL)和1μL无标记的胸苷。一天之后，部分细胞转移到不含3H-dT的培养基中。培养过程的不同时间点，收获细胞培养物，除去培养基，粘联的细胞用PBS洗3次，然后细胞转移到1mL冰冷却的PBS中。细胞悬浮液用1.2N的PCA处理，收集沉淀，用0.2N的PCA洗3次，溶解于1N的NaOH(0.5mL)。水溶液在酸化的发光介质中记数。这些数据也用指数增长或衰减等式分析，同标记甘氨酸实验的分析方法相同。
在33％标记甘氨酸的研究中，培养四天后，dA丰度升高到δ13C为+375‰，dG升高到+321‰。从3.3％1-13C-甘氨酸增长实验可见(图8)，利用dA丰度的动力学测量HEP G2细胞的加倍时间为2.3±0.4天，dG丰度的动力学测量加倍时间为2.2±1.2天。成分dG的增长实验准确性较低是因为不能获得第5天dG的测量值，因此回归使用较少的数据点。
报道的偏差是回归参数的SEs。预计稳定状态的丰度应分别为+66‰和+63‰。另外，测量了dT的同位素比率。这5天中，它的δ13C值稳定在-15.8‰±1.2(均值±SD，N＝7)，相比较第-1天的值为-15.9‰±2.2(N＝6)。该结果显示1-13C-甘氨酸选择性插入嘌呤，而没有插入嘧啶。因此，它意味着可以用对dT测量的对照同位素比率计算特定实验的任何时间的dG和dA的丰度。
从清除实验可见(图9)，用dA测定确定的加倍时间为2.6±0.3天，用dG测定加倍时间为2.4±0.1天。没有使用0天的数据，因为不用该点，回归显著变佳。推测所有未插入的标记物立刻完全清除看来是不可能的。
从细胞生长曲线的对数线性部分可见(图10)，加倍时间估计为1.7±0.2(SE)天，该值与1-13C-甘氨酸插入实验计算出的值具有可比性。使用3H-dT的实验也通过这些等式详细描述(图11)。增长和衰减半衰期分别为1.9±0.2和1.23±0.04天。
甘氨酸法测量DNA合成率的有效性通过该实验的几个组成部分确立。最重要的是，无论在观察标记的插入还是标记的清除，都能够很好地符合一级方程。相关系数范围从0.974到0.994。另外，使用每种核苷时，标记增长和清除的结果互相一致。细胞记数实验给出细胞加倍时间的值，比甘氨酸预测的值快一点。最后，增长期间，3H-dT实验的t1/2也同样与1-13C-甘氨酸数据和细胞记数研究结果一致。衰减水平与细胞记数和1-13C-甘氨酸数据同样迅速。
从七次测量的组合可见(图12)，1-13C-标记甘氨酸是测量细胞总量增长过程中DNA合成率的有效方法。
已知δ13C的水平随饮食变化(K1)。这种变化使观察微小改变变得困难，因为需要为每个受试者建立基线。1-13C-甘氨酸不影响dT的结论意味着dT可以作为检测人类嘌呤的内标。如图6所示，嘌呤中的碳有多种来源。嘧啶的全程生物合成涉及不同碳源；具有胸苷甲基来源于N5，N10-亚甲基-四氢叶酸的天冬酰胺和CO2(L2)。最后，dT作为同位素内标将需要通过检测对照受试者中dT对dA和dG的同位素总体比值来进一步验证。
另外，本发明的方法也能够用放射性标记物有利地测量体外生长的外科获得组织中的DNA合成率，例如良性对恶性肿瘤；intenstinal细胞中的生长片段，以及用于评价肿瘤毒性。参考文献A1.Abramson，F.P.质谱综述，1994，13341-356。A2.Abramson，F.P.；Teffera，Y.；Kusmierz，J.；Steenwyk，R.C.；Pearson，P.G.；药物代谢论文集，1996，24，697-701。A3.Abramson，F.P.和Markey，S.P.，应用反应偶联质谱分析对大分子中硫微克级定量分析；生物医学环境质谱分析，13411-415(1986)。A4.Abramson，F.P.；McLean，M.和Vestal，M.，气相或液相色谱分离后应用质谱选择性稳定-同位素分析。已出版，国际同位素协会会议论文集，加拿大多伦多，1991。A5.Arends，J和Bier，D.M.，用稳定同位素示踪物标记氨基酸溶入体内蛋白合成和气质联用分析。分析化学文摘247255-263(1991)。B1.Barrie，A.，Bricout，J.，和Koziet，J.，在天然丰度水平气相色谱分析稳定同位素比例，生物医学环境质谱分析，11583-588(1984)。B2.Berthold，H.K.；Grain，P.F.；Gouni，I.；Reeds，P.J.；Klein，P.D.Proc.nat.acad.sci.(国家学术科学)，1995，92，10123-10127。B3 Bier，D.M.； Matthews，D.E.联邦论文集，1982，412679-2685。B4.Boni，R.L.；Heyes，M.P.；Bacher，J.D.，Yergey，J.A.，Ji，X.-J；Abramson，F.P.和Markey，S.P.，稳定同位素标记的色氨酸作为前体用于研究喹啉酸在兔体内的分布。实验生物医学进展294481-484(1991)。B5.Brand，W.A.J.，质谱杂志，1996，31225-235。C1 Chace，D.H.，和Abramson，F.P.，通过毛细管气相色谱-化学反应偶联/质谱测定碳-13，氮-15和氘标记的代谢物，分析化学，612724-2730(1989)。C2 Chace，D.H.，和Abramson，F.P.，同位素稀释研究通过毛细管气相色谱-化学反应偶联/质谱测定碳-13，氮-15和氘富含化合物。生物医学环境质谱分析，19117-122(1990)。C3 Chace，D.H.，和Abramson，F.P.，应用CRIMS(化学反应偶联/质谱)测定毛细管气相色谱洗脱物碳-14，色谱杂志，5271-10(1990)。C4 Chace，D.H.，和Abramson，F.P.，通过毛细管气相色谱-化学反应偶联/质谱选择性测定稳定同位素标记药物和代谢物。T.A.Baillie和J.R.Jones(编)，同位素标记化合物合成与应用，第三次国际会议论文集，Innsbruck，Austria，1988，Elsevier，Amsterdam，1989，253-258。C5 Chu，C.，Liu，B.，Watson，D.，Szu，S.，Bryla，D.，Shiloach，J.，Schneerson，R.，和Robbins，J.B.，1型痢疾志贺氏菌F1 Freedman，P.A.，Gillyon，E.C.P.，和Jumeau，E.J.，新型仪器GC-同位素比例MS设计和应用。美国实验室，114-119，1998，6月。G1 Gersovitz，M.；Bier，D.；Matthews，D.；Udall，J.；Munro，H.；Young，V.R.代谢1980，29，1087-1094。G2 Goodman，K.J.；Brenna，J.T.分析化学1992，64，1088-1095。H1 Hachey，D.L.，Wong，W.W.，Boutton，T.W.，和Klein，P.D.，在氮和生物医学研究中同位素比例测定。质谱综述，6289-328(1987)。H2 Hag Ali，M.，Abramson，F.P.，Fetterolf，D.D.，和Cohn，V.H.联用质谱对抗血吸虫药praziquanteld的代谢研究从对照鼠和血吸虫感染鼠的尿中得到的原药及其十个代谢物的分布。Biomed.
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上面的说明和实例的目的在于说明本发明的某些实施方式，而不是对本发明的暗示或限制。各种不偏离本发明实质范围的对本发明的组合物和方法的改良和变化对于所属技术领域的技术人员是显而易见的。本文引证的所有专利文件和出版物通过参考全文插入。
权利要求
1.检测DNA合成的分析方法，包括以下步骤(a)将稳定同位素标记的DNA前体加入正在复制的DNA样品；(b)分离含有所述稳定同位素的所述正在复制的DNA样品部分；(c)用同位素比率质谱测定新合成DNA的燃烧产物的稳定同位素标记的丰度，其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或生化代谢的补救途径插入DNA，然后合成DNA新链。
2.测定正在复制的DNA中氢、碳、氧和氮的稳定同位素丰度的方法，包括以下步骤(a)将稳定同位素标记的DNA前体加入正在复制的DNA样品；(b)分离含有所述稳定同位素的所述复制DNA样品部分；(c)用同位素比率质谱测定新合成DNA的燃烧产物的稳定同位素标记的丰度，其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或生化代谢的补救途径插入DNA，然后合成DNA新链。
3.测定DNA合成的分析方法，包括以下步骤(a)将稳定同位素标记的DNA前体加入正在复制的DNA样品；(b)分离或纯化含有所述稳定同位素的所述正在复制的DNA样品部分；(c)燃烧步骤(b)的DNA，产生稳定同位素标记的燃烧产物，测定该产物的丰度；(d)用质谱测定新合成的DNA中稳定同位素标记的丰度，其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或生化代谢的补救途径插入DNA，然后合成DNA新链。
4.检测DNA合成的分析方法，包括以下步骤(a)将稳定同位素标记的前体加入正在复制的DNA样品；(b)分离或纯化含有所述稳定同位素的所述正在复制的DNA样品部分；(c)降解步骤(b)的DNA；(d)色谱分析步骤(b)或(c)中得到DNA；(e)用质谱测定新合成的DNA中稳定同位素标记的丰度，其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或生化代谢的补救途径插入DNA，然后合成DNA新链。
5.测定DNA合成的分析方法，包括以下步骤(a)加入稳定同位素标记的DNA前体，其中所述标记的DNA前体没有标记所有的四种DNA碱基；(b)分离或纯化含有所述稳定同位素的所述正在复制的DNA样品部分；(c)降解步骤(b)的DNA；(d)用高效液相色谱分析降解的DNA，其中所述色谱可以用无标记的DNA组成成分作为标记DNA的内标；(e)用化学反应偶联质谱(CRIMS)测定所述DNA中稳定同位素标记的量；其中稳定同位素标记的前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或生化代谢的补救途径插入DNA，然后合成DNA新链。
6.如权利要求5的分析方法，其中所述标记的DNA前体为1-13C甘氨酸和仅C5被标记的合成DNA的嘌呤，但不包括嘧啶。
7.如权利要求5的分析方法，所述DNA前体可以任意为胞嘧啶、腺苷、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和无标记的碱基，所述碱基作为对合成DNA中鸟嘌呤或腺苷丰度测量时的基线。
8.测定化疗药物有效性的方法，包括(a)给接受化疗的患者使用稳定同位素标记的DNA前体，其中所述标记前体不标记所有四种DNA碱基；(b)从所述接受化疗的患者体内得到正在复制期的DNA样品；(c)分离或纯化含有所述稳定同位素的所述正在复制的DNA样品部分；(d)降解步骤(c)的DNA；(e)用高效液相色谱分析降解的DNA，其中所述色谱可以用无标记的DNA组成成分作为标记DNA的内标；(f)用质谱测定所述DNA中稳定同位素标记的量用以确定所述化疗药物的有效性。其中稳定同位素标记的DNA前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或生化代谢的补救途径插入，然后合成DNA新链。
9.权利要求3的分析方法，其中所述稳定同位素是氢、氧、碳或氮的稳定同位素。
10.如权利要求3的分析方法，其中所述标记的前体选自甘氨酸、腺苷、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸苷。
11.如权利要求4的分析方法，其中所述色谱为高效液相色谱、气相色谱或毛细管电泳。
12.如权利要求3的分析方法，其中所述光谱为化学反应偶联质谱或同位素比率质谱。
13.如权利要求3的分析方法，其中所述燃烧步骤优选在氧化铜燃烧炉中进行。
14.检测老化过程的分析方法，包括(a)从患者体内获得细胞样品；(b)将稳定同位素标记的DNA前体加入所述细胞，其中所述标记的DNA前体不标记所有四个DNA碱基；(c)分离或纯化含有所述稳定同位素的正在复制的DNA样品；(d)降解步骤(b)的DNA；(e)用高效液相色谱分析降解的DNA，其中所述色谱可以使用无标记的DNA组成成分作为标记DNA的内标；(g)用化学反应偶联质谱(CRIMS)测定所述DNA中稳定同位素标记的量；其中稳定同位素标记的DNA前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或生化代谢的补救途径插入，然后合成DNA新链，将所述细胞样品中的DNA合成量与对照相比，确定细胞样品的老化程度。
15.测定淋巴细胞功能的分析方法，包括以下步骤(a)将稳定同位素标记的DNA前体对患者给药，其中所述标记DNA前体不标记所有四个DNA碱基；(b)从患者体内获得细胞样品；(c)分离或纯化含有所述稳定同位素的所述正在复制的DNA样品部分；(d)降解步骤(b)的DNA；(e)用高效液相色谱分析降解的DNA，其中所述色谱可以使用无标记的DNA组成成分作为标记DNA的内标；(f)用化学反应偶联质谱(CRIMS)测定所述DNA中稳定同位素标记的量；其中稳定同位素标记的DNA前体经嘌呤或嘧啶的全程生物合成途径或生化代谢的补救途径插入，然后合成DNA新链，将所述细胞样品中DNA的合成量与对照相比，测定细胞样品的淋巴细胞功能。
16.权利要求15的分析方法，其中进行分析是为了观察防止化疗后出现严重中性粒细胞减少的干细胞储备；或者监测移植中的淋巴细胞功能，或者检查对药物高度敏感的病人。
全文摘要
非放射性示踪技术用于测量DNA合成率。通过将一种或多种稳定同位素标记的前体插入一种或多种DNA分子,然后测定从目标细胞中提取到DNA中稳定同位素标记的量,来确定DNA合成。
文档编号G01N33/50GK1251615SQ98802516
公开日2000年4月26日 申请日期1998年2月13日 优先权日1997年2月14日
发明者弗瑞得·P·阿布拉姆松 申请人:乔治华盛顿大学